黃芪注射液聯合恩替卡韋對乙型肝炎模型小鼠血清炎癥因子及肝功能的影響Δ

胡雪原，李杏英，楊勤，黃立中（.重慶三峽醫藥高等專科學校中醫系，重慶4040；.湖南中醫藥大學第一附屬醫院內科，長沙4000）

黃芪注射液聯合恩替卡韋對乙型肝炎模型小鼠血清炎癥因子及肝功能的影響Δ

胡雪原1＊，李杏英1，楊勤1，黃立中2（1.重慶三峽醫藥高等?？茖W校中醫系，重慶404120；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院內科，長沙410002）

目的：研究黃芪注射液聯合恩替卡韋對乙型肝炎模型小鼠血清炎癥因子及肝功能的影響。方法：將60只小鼠隨機分為正常對照組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、黃芪注射液組（0.5 mL/10 g）、恩替卡韋組（45 μg/kg）和聯用組（0.5 mL/10 g黃芪注射液+45 μg/kg恩替卡韋），各12只。除正常對照組外，其余4組小鼠均建立乙型肝炎模型。成模后，各組小鼠ig給藥，每天1次，連續4周。給藥結束后，檢測小鼠血清中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、干擾素γ（IFN-γ）、白細胞介素8（IL-8）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、丙氨酸轉氨酶（ALT）、總膽紅素（TBIL）水平，觀察各組小鼠肝組織的病理學變化。結果：與正常對照組比較，模型組小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-8、AST、ALT和TBIL水平均顯著升高（P＜0.05），肝細胞呈彌散性重度脂肪變性。與模型組比較，各給藥組小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-8、AST、ALT和TBIL水平均顯著降低（P＜0.05），肝組織病理學變化得到不同程度改善，且聯用組小鼠指標改善程度優于黃芪注射液組和恩替卡韋組（P＜0.05）。結論：黃芪注射液聯合恩替卡韋有助于下調乙型肝炎模型小鼠血清中炎癥因子表達、改善肝功能水平，且兩藥聯用效果優于兩藥單用。

黃芪注射液；恩替卡韋；乙型肝炎；炎癥因子；肝功能；小鼠

慢性乙型肝炎（簡稱乙肝）是指由乙肝病毒（HBV）感染導致的以肝損傷為主的全身性傳染疾病，可發展為肝硬化，且隨著病情的繼續發展和HBV的進一步復制，則可能發展為肝細胞癌[1]。恩替卡韋為新一代抗HBV藥，能有效抑制HBV的DNA復制[2-3]，在病毒性肝炎的臨床治療中具有重要作用。但恩替卡韋臨床應用時需要考慮患者的耐受程度以及不良反應發生情況，在應用時較為受限，導致患者的臨床預后結局差異性較大。因此，恩替卡韋治療乙肝的安全性與有效性一直是臨床研究熱點。近年來的相關研究表明，黃芪注射液有助于改善乙肝患者臨床癥狀，遏制、逆轉患者肝纖維化病程，有學者提出采用恩替卡韋聯合黃芪注射液的方案治療乙肝，其目的是為了在保證乙肝治療效果的同時，降低恩替卡韋的應用劑量與治療時間，提升乙肝治療效果以及安全性。本研究通過復制乙肝小鼠模型，探討黃芪注射液聯合恩替卡韋對模型小鼠血清中炎性因子及肝功能的影響，為兩藥聯用治療乙肝提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

JA1203型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；TGL-16型高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；6500型全自動生化分析儀（日本日立公司）；SHH-W21型電熱恒溫水浴鍋（北京市長風儀器有限公司）；EVOS智能顯微成像系統及配套顯微鏡（美國Invitrogen公司）。

1.2 藥品與試劑

恩替卡韋片（中美上海施貴寶制藥有限公司，批號：20151025，規格：每片0.5 mg）；黃芪注射液（成都地奧九泓制藥有限公司，批號：20151210，規格：10 mL/支）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、干擾素γ（IFN-γ）、白細胞介素8（IL-8）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、丙氨酸轉氨酶（ALT）、總膽紅素（TBIL）試劑盒均購自深圳晶美生物工程有限公司北京分公司。

1.3 動物

清潔級C57BL/6小鼠60只，♀♂各半，4～6周齡，體質量20～25 g，購于華中科技大學實驗動物中心[動物使用合格證號：SYXK（鄂）2010-0057]。小鼠購入后于室溫為（22.12±0.35）℃、相對濕度為（55.45±1.21）%的條件下飼養。

2 方法

2.1 分組與給藥

將60只小鼠適應性飼養1周后，根據編號隨機分為5組，分別為正常對照組、模型組、黃芪注射液組、恩替卡韋組和聯用組，各12只。除正常對照組外，其余各組小鼠均參考文獻[4]方法建立HBV感染模型，注射24 h后檢測小鼠血清中乙肝表面抗原（Hepatitis B surface antigen，HBsAg），HBsAg＞1.0 PEIU/mL提示建模成功[5]。造模成功當天開始給藥，正常對照組和模型組小鼠ig 1.5 mL/kg生理鹽水；黃芪注射液組小鼠ig 0.5 mL/10 g黃芪注射液；恩替卡韋組小鼠ig 45 μg/kg恩替卡韋；聯用組小鼠ig 0.5 mL/10 g黃芪注射液+45 μg/kg恩替卡韋[6]。每天上午9：00－11：00給藥，每天給藥1次，連續4周。

2.2 標本采集、觀察與指標檢測

末次給藥8 h后，摘小鼠眼球取血2 mL，以離心半徑為3 cm、3 000 r/min離心10 min，取血清，采用酶聯免疫吸附法檢測血清中炎性因子（TNF-α、IFN-γ、IL-8）水平，采用電化學發光法檢測血清中肝功能指標（AST、ALT、TBIL）水平，具體操作按照相應試劑盒說明書進行。處死小鼠，取肝組織，常規石蠟切片后，行蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察小鼠肝病理學變化。

2.3 統計學方法

采用SPSS 20.0統計學軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 小鼠血清中炎癥因子水平的變化

與正常對照組比較，模型組小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-8水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-8水平顯著降低，且聯用組顯著低于黃芪注射液組和恩替卡韋組，差異均具有統計學意義（P＜0.05），結果見表1。

表1 各組小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-8水平測定結果（±s，n＝12，μg/L）Tab 1Determination results of TNF-α，IFN-γ，IL-8 levels in serum of mice in each group（±s，n＝12，μg/L）

表1 各組小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-8水平測定結果（±s，n＝12，μg/L）Tab 1Determination results of TNF-α，IFN-γ，IL-8 levels in serum of mice in each group（±s，n＝12，μg/L）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與黃芪注射液組、恩替卡韋組比較，ΔP＜0.05Note：vs.blankcontrolgroup，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05；vs.Astragali radix injection group and entecavir group，ΔP＜0.05

IL-8 32.82±5.35 353.47±42.63＊174.12±22.36#168.29±17.35#105.38±14.52#Δ組別正常對照組模型組黃芪注射液組恩替卡韋組聯用組TNF-α 41.02±6.37 212.34±25.61＊110.05±14.25#103.16±12.48#66.29±7.52#Δ IFN-γ 0.26±0.16 2.17±0.48＊1.65±0.42#1.54±0.34#1.06±0.25#Δ

3.2 小鼠血清中肝功能指標變化

與正常對照組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST、TBIL水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠血清中ALT、AST、TBIL水平顯著降低，且聯用組低于黃芪注射液組和恩替卡韋組，差異均具有統計學意義（P＜0.05），結果見表2。

表2 各組小鼠血清中ALT、AST、TBIL水平測定結果（±s，n＝12）Tab 2Determination results of ALT，AST，TBIL levels in serum of mice in each group（±s，n＝12）

表2 各組小鼠血清中ALT、AST、TBIL水平測定結果（±s，n＝12）Tab 2Determination results of ALT，AST，TBIL levels in serum of mice in each group（±s，n＝12）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與黃芪注射液組、恩替卡韋組比較，ΔP＜0.05Note：vs.blankcontrolgroup，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05；vs.Astragali radix injection group and entecavir group，ΔP＜0.05

TBIL，μmol/L 4.74±0.68 22.82±3.35＊15.85±2.32#14.62±2.17#5.88±0.79#Δ組別正常對照組模型組黃芪注射液組恩替卡韋組聯用組ALT，U/L 40.48±6.36 146.02±15.95＊81.05±10.14#78.93±9.24#47.56±6.78#Δ AST，U/L 46.63±6.51 178.45±16.28＊74.12±9.36#72.54±8.16#51.63±6.09#Δ

3.3 小鼠肝組織病理學變化

正常對照組小鼠可見肝細胞正常，結構完整；模型組小鼠可見肝細胞呈彌漫性重度脂肪變性，出現壞死或間質性炎癥病變；黃芪注射液組和恩替卡韋組小鼠可見輕度肝細胞彌漫性脂肪變性；聯用組小鼠肝組織結構基本完整，與正常對照組基本相似，結果見圖1。

4 討論

HBV感染后會在患者肝組織中不斷復制，引起肝組織發生慢性炎癥損傷，此時機體會防御性地對這種慢性炎癥損傷進行主動性反復修復，引起肝竇內肝星狀細胞活化，膠原在肝內不斷沉積，肝內纖維組織異常增生，最終導致乙肝、肝硬化的形成[7]。有研究顯示，血清中IL-8水平的變化與乙肝、肝硬化、肝癌等的發生、發展密切相關，病情越嚴重，血清中IL-8水平越高[8]。細胞因子不平衡現象是導致炎癥反應的主要原因，TNF-α、IFN-γ和IL-8均是重要的促炎因子，三者共同作用下可引起組織器官的損壞[9-10]。本研究中，模型組小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-8水平均顯著高于正常對照組，說明小鼠乙肝模型建立成功，且HBV感染后機體產生了明顯的炎癥反應。

圖1 各組小鼠肝組織切片圖（HE染色，×200）Fig 1Slice of liver tissue of mice in each group（HE staining，×200）

恩替卡韋作為一種新型的核苷類抗病毒藥，也是目前推薦的一線抗病毒治療用藥，能快速、選擇性地抑制HBV的DNA復制，減輕患者肝細胞炎癥，修復損傷的肝細胞[11-12]。國內外研究報道均證實了其治療乙肝患者的有效性[13-14]，但由于其易導致上呼吸道感染、咽喉炎等不良反應，也易造成ALT水平升高，這在一定程度上制約了其臨床應用。祖國醫學認為，乙肝多因濕熱瘀毒侵襲所致，病在肝，累及脾、腎。濕熱之毒損傷肝絡，肝失疏泄則氣滯，氣滯至血液運行不暢而致瘀血，本為濕熱之毒，貫穿慢性乙肝病程之始終，治則當標本兼治。黃芪注射液的主要成分為黃芪，黃芪具有固表斂汗、利水消腫、通調水道的功效，可增強機體抵抗力、抑制HBV病毒、誘導腫瘤細胞凋亡的功效[6，15-16]。本文研究中，給藥后小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-8水平均顯著降低，且聯用組顯著低于黃芪注射液組和恩替卡韋組，提示黃芪注射液聯合恩替卡韋能有效減輕乙肝模型小鼠的炎癥反應。

長期肝細胞功能損害是乙肝患者發生肝硬化的病理基礎。恩替卡韋治療后可有效改善HBeAg陽性患者肝功能[17]。保肝降酶中藥在乙肝的治療中取得了較好的效果[18]。黃芪為多年生草本植物，具有補氣升陽、益衛固表、利水消腫及免疫調劑作用。劉淑艷等[19]超聲導入黃芪注射液后發現，乙肝患者肝功能及血清中肝纖維化指標均有改善；王迎霞等[20]采用黃芪注射液聯合甘利欣注射液治療后，乙肝肝纖維化患者的肝纖維化指標和肝功能均有明顯改善。本研究結果顯示，乙肝模型小鼠血清中肝功能指標ALT、AST、TBIL的水平較正常對照組均顯著升高，給藥后各給藥組小鼠血清中上述肝功能指標水平均顯著降低，且以黃芪注射液和恩替卡韋聯用組效果最優。

綜上所述，黃芪注射液聯合恩替卡韋有助于抑制乙肝模型小鼠血清中炎性因子TNF-α、IFN-γ、IL-8的表達，改善肝功能。但黃芪注射液聯合恩替卡韋對乙肝的更多治療作用機制有待進一步研究，而且由于人體與動物對藥物反應能力的差異性，黃芪注射液聯合恩替卡韋治療乙肝還有待于更多的臨床研究去證實。

[1]Pollicino T，Bellinghleri L，Restuccia A，et al.Hepatitis B virus（HBV）induces the expression of interleukin-8 that in turn reduces HBV sensitivitytointerferon-alpha[J].Virology，2013，444（1/2）：317-328.

[2]韓海英，黃秀香，安西全，等.恩替卡韋聯合康艾注射液治療HBV相關性中晚期肝癌患者的肝功能、凝血、血常規和HBV-DNA水平變化的臨床觀察[J].安徽醫藥，2014，18（6）：1158-1159.

[3]趙文生，李有實，靳君.復方苦參注射液恩替卡韋片對慢性乙型肝炎患者肝功能的改善作用[J].中國中醫藥信息雜志，2013，20（3）：70-71.

[4]袁璐.C57BL/6小鼠乙型肝炎病毒感染模型中細胞因子研究[D].武漢：華中科技大學，2011.

[5]石瑤，劉鳳君，周仲輝，等.恩替卡韋聯合潑尼松對乙型肝炎病毒復制型小鼠體內病毒復制表達的影響[J].中華傳染病雜志，2016，34（2）：115-116.

[6]王曉琳，翁孝剛，王憲華，等.黃芪多糖預防2型糖尿病大鼠肝損傷的實驗研究[J].現代生物醫學進展，2016，16（10）：1846-1849.

[7]Chakkor A，Rouibaa F，Elaboudi S，et al.An evaluation of entecavir treatment among nucleos（t）ide-na?veMoroccanpatientswithchronic hepatitis B[J].BMJ Open Gastroenterol，2016，3（1）：e000081.

[8]歐珠美朵，嘎松卓嘎，旦增.白細胞介素-10基因多態性與西藏地區慢性乙型肝炎的相關性研究[J].山東大學學報（醫學版），2014，52（S1）：9、25.

[9]張雷，戴一菲.阿德福韋酯聯合還原型谷胱甘肽對代償期乙型肝炎后肝硬化患者肝功能和炎性因子水平的影響及其療效分析[J].海南醫學院學報，2015，21（2）：194-196.

[10]Ferreira Sda C，Chacha SG，Souza FF，et al.IL-18，TNF，and IFN-γ alleles and genotypes are associated with susceptibility to chronic hepatitis B infection and severity of liver injury[J].J Med Virol，2015，87（10）：1689-1696.

[11]趙攀，鐘彥偉，徐東平.5例應用恩替卡韋治療的慢性HBV感染者發生HBV逆轉錄酶區單獨A181位點突變的分析[J].臨床肝膽病雜志，2011，27（3）：289-291.

[12]Kim HS，Kim BK，Kim SU，et al.Association between level of fibrosis，rather than antiviral regimen，and outcomes of patients with chronic hepatitisB[J].ClinGastroenterolHepatol，2016，14（11）：1647-1656.

[13]夏紅，周智，楊玉霞.乙型肝炎患者恩替卡韋抗病毒治療后外周血T淋巴細胞PD-1的表達及其與HBeAg血清學的關系[J].海南醫學院學報，2016，22（7）：655-657.

[14]Boglione L，De Nicolo A，Cusato J，et al.Entecavir plasma concentrations are inversely related to HBV-DNA decrease in a cohort of treatment-na?vepatientswithchronichepatitisB[J].Int J Antimicrob Agents，2016，48（3）：324-327.

[15]郭雪紅.黃芪注射液的藥理作用及臨床應用研究進展[J].中國藥房，2015，26（21）：3018-3021.

[16]申玉梅，李文麗，王偉行.康艾注射液聯合恩替卡韋治療乙型病毒性肝炎相關性中晚期肝癌的臨床療效及安全性評價[J].中國臨床藥理學雜志，2015，31（24）：2390-2392.

[17]Jonas MM，Chang MH，Sokal E，et al.Randomized，controlled trial of entecavir versus placebo in children with hepatitis B envelope antigen-positive chronic hepatitis B[J].Hepatology，2016，63（2）：377-387.

[18]劉蕊潔，葉永安，江鋒，等.保肝降酶中藥在慢性乙型肝炎治療中的系統評價[J].中西醫結合肝病雜志，2014，24（1）：54-64.

[19]劉淑艷，楊小明，孟憲紅，等.超聲導入療法治療慢性乙型肝炎肝纖維化臨床研究[J].現代生物醫學進展，2013，13（25）：4953-4956.

[20]王迎霞，李慶相，張運巧，等.丹紅注射液、黃芪注射液對慢性乙型肝炎肝纖維化的影響[J].中醫雜志，2011，52（17）：1486-1488.

Effects of Astragali Radix Injection Combined with Entecavir on Serum Inflammatory Cytokines and Liver Function of Model Mice with Hepatitis B

HU Xueyuan1，LI Xingying1，YANG Qin1，HUANG Lizhong2（1.College of TCM，Chongqing Three Gorges Medical College，Chongqing 404120，China；2.Dept.of Internal Medicine，the First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410002，China）

OBJECTIVE：To study the effects of Astragali radix injection combined with entecavir on serum inflammatory cytokines and liver function of model mice with hepatitis B.METHODS：60 mice were randomly divided into normal control group（normal saline），model group（normal saline），Astragali radix injection group（0.5 mL/10 g），entecavir group（45 μg/kg）and combination group（0.5 mL/10 g Astragali radix injection+45 μg/kg entecavir），12 in each group.Except for normal control group，mice in other 4 groups were induced for hepatitis B models.After mod-eling，all mice were intragastrically administrated once a day，for 4 weeks.After administration，tumor necrosis factor α（TNF-α），interferon γ（IFN-γ），interleukin 8（IL-8），aspartate aminotransferase（AST），alanine aminotransferase（ALT），total bilirubin（TBIL）levels in serum were detected，and the pathological changes in liver tissue in each group were observed.RESULTS：Compared with normal control group，TNF-α，IFN-γ，IL-8，AST，ALT，TBIL levels in serum of mice in model group were significantly increased（P＜0.05）；and liver cells were diffuse and severe steatosis.Compared with model group，TNF-α，IFN-γ，IL-8，AST，ALT，TBIL levels in serum of mice in each administration group were significantly decreased（P＜0.05），pathological changes in liver tissue were improved to varying degrees，and the index improvement degree in combination group was superior to Astragali radix injection group and entecavir group（P＜0.05）.CONCLUSIONS：Astragali radix injection combined with entecavir helps to downregulate the expressions of inflammatory cytokines of model mice with hepatitis B，and improve the liver function.The combination use has better effect than single use.

Astragali radix injection；Entecavir；Hepatitis B；Inflammatory cytokines；Liver function；Mice

R512.62

A

1001-0408（2017）34-4800-04 DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.34.12

重慶市教委科學技術研究項目（No.KJ121802）

＊講師，碩士。研究方向：中西醫結合臨床。電話：023-58567969。E-mail：851225755@qq.com

2017-02-22

2017-09-30）

（編輯：林靜）