利福平納米脂質載體的制備及質量評價

胡建軍，余莉，陳海林，林薇，金海英（寧波大學醫學院附屬醫院藥劑科，浙江寧波315020）

利福平納米脂質載體的制備及質量評價

胡建軍＊，余莉，陳海林，林薇，金海英#（寧波大學醫學院附屬醫院藥劑科，浙江寧波315020）

目的：制備利福平（RFP）納米脂質載體（RFP-NLCs），提高其水溶性，并評價其質量。方法：以液固脂質材料油酸及單硬脂酸甘油酯為脂質材料，大豆卵磷脂為乳化劑，泊洛沙姆188為非離子型表面活性劑，采用熔融-超聲乳化法制備RFP-NLCs。以粒徑和包封率的綜合評分為指標，以脂質材料的用量、液態脂質材料比例、投藥量和大豆卵磷脂-泊洛沙姆188質量比為因素，采用正交試驗優化處方。測定最優處方所制脂質載體的形態、粒徑、多分散指數（PDI）、Zeta電位、包封率、載藥量和體外釋放度。結果：最優處方中脂質材料用量為150 mg，液態脂質比例為30%，RFP用量為10 mg，大豆卵磷脂-泊洛沙姆188的質量比為1∶3。所制RFP-NLCs的外觀較圓整，粒徑為（124.07±3.25）nm，PDI為0.104±0.010，Zeta電位為（－31.07±2.94）mV，包封率為（80.90±2.59）%，載藥量為（4.81±0.68）%（n＝3）。與RFP原料藥比較，RFP-NLCs體外釋放度明顯減緩，12 h內的累積釋放度為63.2%，釋藥行為符合Weibull方程。結論：篩選處方可成功制備RFP-NLCs；所制RFP-NLCs粒徑小、包封率較高，具有體外緩釋特征。

利福平；納米脂質載體；制備；質量評價

利福平（Rifampicin，RFP）系抗結核一線用藥，對結核桿菌及其他分枝桿菌均有強大的殺菌作用。但由于臨床上RFP用藥劑量大、作用時間長，易造成嚴重的胃腸道毒副作用及肝損傷，以致患者依從性較差、治療失敗率升高[1-5]。納米脂質載體（Nano-structured lipid carriers，NLCs）為第二代脂質納米粒，是在固體脂質中加入化學性質不同的液態脂質，使納米粒變成結晶缺陷型或無定形型結構，以達到提高難溶性藥物水溶性和載藥量的目的，且具有緩釋特性[6-8]。本研究采用熔融-超聲乳化法制備RFP-NLCs，采用正交試驗優化處方，并評價其質量，以期為開發新型RFP給藥劑型提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Nano-ZS型粒徑分析儀（英國Malvern公司）；HT7700型透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司）；OptimaMAX型超速離心機（美國Beckman公司）；Scientz-ⅡDN型超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 藥品與試劑

RFP原料藥（沈陽雙鼎制藥有限公司，批號：13050301，純度：＞98%）；RFP對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110757-201004，純度：＞99%）；單硬脂酸甘油酯（法國Gattefosse公司，批號：127339）；油酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：141021）；注射用大豆卵磷脂（上海太偉藥業有限公司，批號：20130201）；泊洛沙姆188（德國Basf公司，批號：WPAF538B）；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.3 其他

透析袋（美國Viskase公司，截留分子量：7 000 Da）。

2 方法與結果

2.1 RFP-NLCs的制備

稱取處方量的單硬脂酸甘油酯、油酸和RFP，加入少量甲醇，置于70℃恒溫水浴中熔融，作為油相；另稱取處方量的乳化劑大豆卵磷脂和泊洛沙姆188，分散于20 mL水中，作為水相；待水相加熱至與油相相同的溫度，在磁力攪拌下將水相滴加到油相中形成初乳；趁熱將初乳超聲3 min（300 W，3 s間隔）后，冷卻至室溫，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得RFP-NLCs。同法制備不含RFP的NLCs，作為空白對照。

2.2 RFP的含量測定方法

2.2.1 色譜條件色譜柱：Platisil ODS（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.02 mol/L磷酸二氫鉀（65∶45，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；檢測波長：254 nm；進樣量：20μL。在該色譜條件下，輔料不干擾RFP的測定。

2.2.2 線性關系精密量取RFP對照品適量，加甲醇稀釋成質量濃度分別為50.0、20.0、10.0、5.0、2.0、1.0 μg/mL的系列對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，以峰面積（A）對質量濃度（c）進行線性回歸，得RFP的回歸方程為：A＝89.944c+49.97（r＝0.999 9，n＝6）。結果表明，RFP檢測質量濃度在1.0～50.0 μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系，RFP的定量限為0.5 μg/mL（以信噪比≥10計）。

2.2.3 精密度、準確度與穩定性取低、中、高質量濃度（2.0、10.0、40.0 μg/mL）的RFP對照品溶液，分別按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，同日內測定5次考察日內精密度；每日測定1次，連續測定5 d考察日間精密度；以測定值/真實值×100%計算回收率。結果，RFPNLCs混懸液的日內、日間精密度RSD均小于2%（n＝5）；低、中、高濃度樣品的平均回收率分別為（96.51±1.32）%、（97.03±1.43）%、（97.50±1.15）%（n＝3）。同一批次制備的RFP-NLCs混懸液放置24 h后再進樣測定，考察穩定性。結果，穩定性試驗中含量的RSD為1.25%（n＝6）。

2.3 包封率與載藥量的測定

精密量取RFP-NLCs混懸液，4℃下225 000×g離心60 min。取上清液1 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，經0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定游離RFP的含量，記作W1；取離心后沉淀物，蒸餾水洗滌3次，真空冷凍干燥后精密稱定總質量，記作W。另精密量取RFP-NLC混懸液1 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，100 W超聲10 min，經0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定RFP總含量，記作W0。計算RFP-NLCs的包封率和載藥量：包封率（%）＝（W0－W1）/W0×100%，載藥量（%）＝（W0－W1）/W×100%。

2.4 正交試驗優化處方

2.4.1 試驗設計與結果根據單因素預試驗結果，選擇對RFP-NLCs制備工藝、理化性質影響較大的因素，即脂質材料的用量（A，mg）、液態脂質比例（B，%）、投藥量（C，mg）和大豆卵磷脂-泊洛沙姆188質量比（D）為考察因素。每個因素選取3個水平，按正交設計L9（34）表設計試驗，以粒徑（y1）和包封率（y2）的綜合加權評分值[y，y＝50×（1－y1/y1max）+50×y2/y2max]為考察指標，篩選RFP-NLCs處方。因素與水平見表1，正交試驗設計與結果見表2，方差分析結果見表3。

表1 因素與水平Tab 1Factors and levels

表2 正交試驗設計與結果Tab 2Orthogonal test design and results

表3 方差分析結果Tab 3Results of variance analysis

由表2和表3可知，各因素對綜合加權評分值的影響程度依次為A＞C＞D＞B，其中A和C對綜合加權評分值有顯著影響（P＜0.05）。以綜合加權評分值越大為標準，篩選得到最優處方為A2B1C2D3，即脂質材料用量為150 mg，液態脂質比例為30%，RFP用量為10 mg，大豆卵磷脂-泊洛沙姆188質量比為1∶3。

2.4.2 驗證試驗按“2.4.1”項下優化的處方制備3批RFP-NLCs，采用Nano-ZS型粒徑分析儀檢測其粒徑、多分散指數（PDI）和Zeta電位，按“2.3”項下方法檢測其包封率和載藥量。結果顯示，所制RFP-NLCs的平均粒徑為（124.07±3.25）nm，PDI為0.104±0.010，Zeta電位為（－31.07±2.94）mV，包封率為（80.90±2.59）%，載藥量為（4.81±0.68）%（n＝3）。

2.5 外觀形態

取按最優處方制備的RFP-NLCs適量，以2.0%磷鎢酸溶液負染，使用HT7700型透射電子顯微鏡觀察其外觀形態。結果顯示，RFP-NLCs外觀形態圓整，大小及分布較均勻。透射電鏡圖見圖1。

圖1 RFP-NLCs的透射電鏡圖Fig 1TEM photograph of RFP-NLCs

2.6 體外釋藥

精密稱取RFP原料藥和按最優處方制備的RFPNLCs適量（約含RFP 2 mg），分散于2 mL釋放介質[含1%乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）和1%Na2SO3的磷酸鹽緩沖液（PBS），pH為7.4]中[9]，裝入處理好的透析袋中，密封后置于100 mL釋放介質中，于（37±0.5）℃恒溫水浴下以75 r/min振蕩。分別于15、30、60 min和1、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h各取樣2 mL，同時補充2 mL同溫釋放介質。按“2.2.1”項下色譜條件進樣檢測釋放液中RFP的含量，計算累積釋放度，并以累積釋放度（Q）為縱坐標、時間（t）為橫坐標作圖，繪制釋放曲線。RFP原料藥和RFP-NLCs的體外釋藥曲線見圖2。

圖2 RFP原料藥和RFP-NLCs的體外釋藥曲線（n＝3）Fig 2The in vitro drug release curves of RFP raw materials and RFP-NLCs（n＝3）

由圖2可見，RFP原料藥釋藥迅速，4 h時的累積釋放度已達到95.1%；而RFP-NLCs釋藥前期有少量突釋，12 h時的累積釋放度為63.2%，之后平穩釋藥，48 h時的累積釋放度為85.2%。此外，分別用零級動力學方程、一級動力學方程、Higuchi方程和Weibull方程對RFP-NLCs的體外釋藥行為進行擬合，結果顯示，其釋藥行為符合Weibull方程[lnln（1/1－Q）＝0.564 9lnt－1.486 1，R2＝0.995 3]。

3 討論

筆者曾采用溶劑分散法、薄膜超聲分散法制備RFPNLCs，但所制RFP-NLCs的粒徑明顯大于熔融-超聲乳化法，且較不穩定。綜合考察，選用熔融-超聲乳化法制備RFP-NLCs。文獻[10-11]表明，液態脂質比例在0～40%范圍為宜，其包封率隨液態脂質的比例升高，先增大后減少。通過正交試驗，本試驗最終選擇30%的油酸比例。泊洛沙姆188為非離子型表面活性劑，與大豆卵磷脂合用，能插入磷脂單分子層形成穩固的混合層，可減小粒徑，亦能提高穩定性。

RFP在水中幾乎不溶，選擇普通溶出介質難以實現漏槽條件。因此，本試驗參考文獻[9]中相關內容，選擇含1%EDTA-2Na和1%Na2SO3的PBS（pH 7.4）作為釋放介質。由體外釋藥曲線可見，RFP-NLCs具有一定的突釋性，后期平緩釋藥，呈現明顯的緩釋特性。

綜上所述，本研究篩選的處方可成功制備RFPNLCs，所制RFP-NLCs粒徑小、包封率較高、具有體外緩釋特征。

[1]Riccardi G，Pasca MR.Trends in discovery of new drugs for tuberculosis therapy[J].J Antimicrob，2014，67（9）：655-659.

[2]Riccardi G，Pasca MR，Buroni S.Mycobacterium tuberculosis：drugresistanceandfutureperspectives[J].Future Microbiol，2009，4（5）：597-614.

[3]Gallardo CR，Comas DR，Figuls MRI，et al.Fixeddoseco-mbinationsofdrugsversussingledrug formulations for treating pulmonary tuberculosis[J].CochraneDatabaseSystRev，2016，doi：10.1002/14651858.CD009913.pub2.

[4]Alsultan A，Peloquin CA.Therapeutic drug monitoring in the treatment of tuberculosis：an update[J].Drugs，2014，74（9）：1061.

[5]荊穎，黃淑萍，王倩，等.利福平藥動學影響因素的研究進展[J].中國藥房，2017，28（12）：1726-1728.

[6]Slavomira D，Souto EB，Silva AM.Nanotoxicology appli-ed to solid lipid nanoparticles and nanostructured lipid carriers-a systematic review of in vitro data[J].Eur J Pharm Biopharm，2014，87（1）：1-18.

[7]Beloqui A，Solinís Má，Rodríguezgascón A，et al.Nanostructuredlipidcarriers：promising drugdeliverysystemsforfutureclinics[J].Nanomed Nanotechnol，2015，12（1）：143-161.

[8]Singh H，Jindal S，Singh M，et al.Nano-formulation of rifampicin with enhanced bioavailability：development，characterizationandin-vivo safety[J].Int J Pharm，2015，12（1）：143-161.

[9]曹佳薇，倪堅軍，姚君，等.利福平脂質體溫敏型原位凝膠的制備及其體外釋藥特征研究[J].中國現代應用藥學，2016，33（2）：183-187.

[10]孫珊珊，王慧云，王飛飛，等.阿德福韋酯納米脂質載體的制備及處方優化[J].中國藥房，2017，28（16）：2259-2261.

[11]Shao Z，Shao J，Tan B，et al.Targeted lung cancertherapy：preparationandoptimizationof transferrin-decorated nanostructured lipid carriers as novel nanomedicine for co-delivery of anticancer drugs and DNA[J].Int J Nanomedicine，2015，10：1223-1233.

Preparation and Quality Evaluation of Rifampicin Nano-structured Lipid Carriers

HU Jianjun，YU Li，CHEN Hailin，LIN Wei，JIN Haiying（Dept.of Pharmacy，the Affiliated Hospital of Medical College，Ningbo University，Zhejiang Ningbo 315020，China）

OBJECTIVE：To prepare rifampicin（RFP）nano-structured lipid carriers（RFP-NLCs）to improve its watersolubility，and evaluate its quality.METHODS：Using liquid-solid lipid materials oleate and glyceryl monostearate as lipid materials，soy lecithin as emulsifier，poloxamer 188 as nonionic surfactant，melting-ultrasonic emulsification was used to prepare RFP-NLCs.Using the comprehensive scores of particle size and encapsulation efficiency as indexes，the amount of lipid materials，proportion of liquid lipid materials，dosage，and mass ratio of soy lecithin-poloxamer 188 as factors，orthogonal test was adopted to optimize the formulation.The morphology，particle size，polydispersity index（PDI），Zeta potential，encapsulation efficiency，drug loading and in vitro release degree of prepared lipid carriers with optimal formulation were evaluated.RESULTS：In the optimal formulation，the amount of lipid materials was 150 mg，proportion of liquid lipid materials was 30%，amount of RFP was 10 mg，and mass ratio of soy lecithin-poloxamer 188 was 1∶3.Prepared RFP-NLCs had rounded appearance，particle size was（124.07±3.25）nm，PDI was 0.104±0.010，Zeta potential was（－31.07±2.94）mV，encapsulation efficiency was（80.90±2.59）%，and drug loading was（4.81±0.68）%（n＝3）.Compared with RFP raw materials，in vitro release degree of RFP-NLCs significantly slowed down，and the cumulative release degree within 12 h was 63.2%，which was in line with Weibull equation.CONCLUSIONS：Screened formulation can successfully prepare RFP-NLCs；the prepared RFPNLCs have small particle size and high encapsulation efficiency，and the in vitro drug release shows certain sustained-release characteristics.

Rifampicin；Nano-structured lipid carriers；Preparation；Quality evaluation

R943

A

1001-0408（2017）34-4879-03

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.34.33

＊藥師。研究方向：醫院藥學、藥物新劑型。電話：0574-87035223。E-mail：526416166@qq.com

#通信作者：副主任藥師，碩士。研究方向：醫院藥學。電話：0574-87035223。E-mail：13736053092@163.com

2017-06-05

2017-08-28）

（編輯：鄒麗娟）