洋蔥槲皮素對脂多糖誘導的小鼠腹腔巨噬細胞炎癥反應抑制作用

，，

(錦州醫科大學食品科學與工程學院，遼寧錦州 121001)

洋蔥槲皮素對脂多糖誘導的小鼠腹腔巨噬細胞炎癥反應抑制作用

倪灣，李敬雙，于洋*

(錦州醫科大學食品科學與工程學院，遼寧錦州 121001)

為探討洋蔥槲皮素的抗炎作用,本研究以小鼠腹腔巨噬細胞為模型,采用MTT法檢測洋蔥槲皮素單藥組、洋蔥槲皮素與LPS復合藥組對巨噬細胞吞噬功能的影響;采用ELISA法檢測洋蔥槲皮素單藥組、洋蔥槲皮素與LPS復合藥組對小鼠腹腔巨噬細胞分泌細胞因子和炎癥介質的影響。結果顯示,洋蔥槲皮素能夠提高巨噬細胞的吞噬功能;洋蔥槲皮素單藥、洋蔥槲皮素與LPS復合藥組刺激巨噬細胞,均能夠抑制巨噬細胞IL-1β和 COX-2的產生。結論:洋蔥槲皮素可能通過提高巨噬細胞的吞噬功能、影響細胞因子和炎癥介質的分泌,而發揮抗炎作用。

洋蔥槲皮素,巨噬細胞,細胞因子,炎癥介質,抗炎

洋蔥(AlliumcepaL.),又名蔥頭,圓蔥,玉蔥,屬百合科蔥屬二年生草本植物。根據聯合國糧食與農業組織(Food and Agriculture Organization,FAO)的統計,截止到2015年12月年全球洋蔥的種植面積達到600多萬公頃,洋蔥的干產量達到11000多萬噸,我國的洋蔥種植面積達到200多萬公頃,洋蔥的干產量達到3500多萬噸,我國已成為洋蔥生產大國[1]。洋蔥槲皮素(Onion quercetin)是洋蔥中提取的一種多羥基黃酮類化合物,研究表明,洋蔥槲皮素具有抗氧化、清除自由基[2]、抗肥胖[3]、抗癌[4]、抗炎[5]、抗菌[7]、抗病毒[7]、降糖降壓[7]、免疫調節及心血管保護等作用[8]。

近年來,槲皮素的抗炎作用逐漸受到重視,特別是槲皮素調節細胞因子及炎性介質釋放發揮抗炎作用已成為研究熱點。王保健等[9]研究了槲皮素對海水誘發性急性肺損傷(SW-ALI)的保護作用,并探索該作用與M1型巨噬細胞極化及其介導的炎癥的相關性,結果表明槲皮素可通過抑制M1型巨噬細胞極化及其介導的免疫反應顯著改善SW-ALI后氣體交換功能、減輕肺組織病變。王敏等[10]研究了以人臍靜脈內皮細胞為試材,用棕櫚酸(PA)建立氧化應激與炎癥模型,考察槲皮素和其代謝物槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸對內皮細胞氧化應激與炎癥的抑制作用,結果表明PA刺激誘發了內皮細胞內的氧化應激反應,導致胞內ROS的增加和線粒體膜電位的下降。劉明玥等[11]研究了槲皮素抑制RAW264.7巨噬細胞膽固醇累積、膽固醇流入及促進膽固醇流出作用及其機制,結果表明槲皮素可能是一種新型的膽固醇累積抑制劑,其作用可能是通過激活PPARγ-LXRα-ABCA1/ABCG1通路和抑制SR-A1和SR-A2的表達實現的。然而關于洋蔥槲皮素抗炎作用的研究目前還鮮有報道。因此,加大、加深洋蔥槲皮素抗炎活性的研究具有更高經濟效益和社會效益,為洋蔥槲皮素的臨床應用和藥物開發提供依據,對發展特色農業,推進農業產業化進程,提高農業總體競爭力,促進農產品轉化增值,支撐國民經濟發展,增加農民經濟收入,都具有十分重要的意義。

為探討洋蔥槲皮素的抗炎作用,本研究建立了以小鼠腹腔巨噬細胞為靶細胞的模型,體外研究洋蔥槲皮素抗炎活性,為洋蔥槲皮素的進一步開發和利用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

洋蔥槲皮素 西安天瑞生物技術有限公司，批號(MUST-12062610),純度≥98%;新生牛血清 浙江天杭生物科技有限公司;脂多糖(LPS)、甲基噻唑藍(MTT)、臺盼藍、RPMI-1640培養基、二甲基亞砜(DMSO)、IL-1β、COX-2試劑盒 北京索萊寶科技有限公司;健康SPF級Balb/c小鼠 體重(20±2) g,6～8周齡,錦州醫科大學實驗動物中心提供;CO2培養箱 日本SHELLAB;CKX41SF倒置顯微鏡 Olympus Corporation Tokyo,Japan Madein Philippiness;TD5A低速離心機 湖南赫西;TDL80-2B 96孔板或24孔板臺式離心機 上海安亭;FA2004N電子天平 上海精密;SUNRISE-BASJC TECAN酶標儀 TeCan Austria GmbH 5082 Grodly,Austria;SW-CJ-1F型超凈工作臺 蘇州凈化設備。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備巨噬細胞懸液 小鼠飼養于環境溫度(20±2) ℃,濕度50%±10%,按照12 h光照/12 h黑暗,自由攝食、飲水的飼養條件喂養,實驗前適應性飼養1周。頸椎脫臼法處死小鼠,75%乙醇浸泡3 min,將4 mL RPMI-1640培養基注入腹腔,輕按摩腹部約3 min,抽取腹腔液,1800 r/min離心5 min,棄上清,重復上述操作3次。細胞沉淀用RPMI-1640完全培養基懸起,過濾后臺盼藍染色計數,活細胞數達到95%以上,將細胞密度調整為5×106個/mL,制成巨噬細胞懸液。96孔細胞培養板中,每孔加入100 μL細胞懸液,置于37 ℃、5% CO2培養箱中,培養 12 h 后換液,以去掉少數未貼壁的雜細胞[12],用于下列實驗。

1.2.2 MTT法檢測巨噬細胞吞噬功能 96孔細胞培養板中,每孔加入100 μL巨噬細胞懸液,設空白組、LPS組、洋蔥槲皮素單藥組、洋蔥槲皮素與LPS(1 μg/mL LPS)復合藥組,各組均設3個重復。空白組每孔加入100 μL RPMI-1640完全培養基,LPS組每孔加入100 μL LPS(終濃度為1 μg/mL)溶液;其它各濃度組每孔各加100 μL含不同濃度的洋蔥槲皮素(終濃度為20,40,80,120和160 μg/mL)溶液;37 ℃,5% CO2培養24 h 后取出,每孔加入50 μL金黃色葡萄球菌懸液,繼續培養9 h,每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL),置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養4 h,1800 r/min離心10 min,棄上清。每孔再加入150 μL DMSO振蕩溶解,用酶標儀檢測570 nm處的OD值[12]。

1.2.3 ELISA法檢測巨噬細胞因子及炎癥介質

1.2.3.1 洋蔥槲皮素對巨噬細胞分泌IL-1β、COX-2功能的影響 24孔細胞培養板中,每孔加入l mL巨噬細胞懸液,設空白組、LPS組、洋蔥槲皮素單藥組,各組均設3個重復?？瞻捉M每孔加入l mL RPMI-1640完全培養基,LPS組每孔加入1 mL LPS(終濃度為1 μg/mL)溶液;洋蔥槲皮素單藥組每孔分別加入1 mL不同濃度的洋蔥槲皮素(終濃度為20、40、80、120和160 μg/mL)溶液。37 ℃,5% CO2培養箱中培養24 h,離心取細胞上清液,采用ELISA 法檢測IL-1β、COX-2的分泌量,按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.3.2 洋蔥槲皮素對LPS誘導的巨噬細胞分泌IL-1β、COX-2功能的影響 24孔細胞培養板中,每孔加入l mL巨噬細胞懸液,設空白組、LPS組、洋蔥槲皮素與LPS(1 μg/mL LPS)復合藥組,各組均設3個重復?？瞻捉M每孔加入l mL RPMI-1640完全培養基;LPS組每孔加入1 mL LPS(終濃度為1 μg/mL)溶液;洋蔥槲皮素與LPS復合藥組每孔分別加入l mL不同濃度的洋蔥槲皮素(終濃度為20、40、80、120和160 μg/mL)溶液。37 ℃,5% CO2培養箱中培養24 h,離心取細胞上清液,采用ELISA 法檢測IL-1β、COX-2的分泌量,按照試劑盒說明書進行操作。

2 結果與分析

2.1 洋蔥槲皮素對巨噬細胞吞噬功能的影響

2.1.1 洋蔥槲皮素單藥組對巨噬細胞吞噬功能的影響 洋蔥槲皮素單藥各濃度組與空白組比較:洋蔥槲皮素單藥各濃度組巨噬細胞的OD570值均極顯著(p<0.01)高于空白組;洋蔥槲皮素單藥各濃度組與LPS組比較:洋蔥槲皮素單藥各濃度組巨噬細胞的OD570值均極顯著(p<0.01)高于LPS組;洋蔥槲皮素單藥各濃度組之間比較:洋蔥槲皮素為120 μg/mL濃度組巨噬細胞的OD570值極顯著(p<0.01)高于洋蔥槲皮素為20、40、80和160 μg/mL濃度組;洋蔥槲皮素為160 μg/mL濃度組巨噬細胞的OD570值低于洋蔥槲皮素為40 μg/mL濃度組,無統計學意義(p>0.05)。表明洋蔥槲皮素單藥組能夠提高巨噬細胞的吞噬功能,洋蔥槲皮素為120 μg/mL濃度組對提高巨噬細胞的吞噬功能效果優于其它濃度組,呈雙向調節作用。結果見圖1。

2.1.2 洋蔥槲皮素與LPS復合藥組對巨噬細胞吞噬功能的影響 洋蔥槲皮素與LPS復合藥各濃度組與空白組比較:洋蔥槲皮素與LPS復合藥各濃度組巨噬細胞的OD570值均極顯著(p<0.01)高于空白組;洋蔥槲皮素與LPS復合藥各濃度組與LPS組比較:洋蔥槲皮素與LPS復合藥各濃度組巨噬細胞的OD570值均極顯著(p<0.01)高于LPS組;洋蔥槲皮素與LPS復合藥各濃度組之間比較:洋蔥槲皮素為120 μg/mL濃度組巨噬細胞的OD570值極顯著(p<0.01)高于洋蔥槲皮素為20、40、80、160 μg/mL濃度組;洋蔥槲皮素為160 μg/mL濃度組巨噬細胞的OD570值高于洋蔥槲皮素為40 μg/mL濃度組,無統計學意義(p>0.05)。洋蔥槲皮素單藥組與復合藥組比較:復合藥組巨噬細胞的OD570值高于單藥組。表明洋蔥槲皮素與LPS復合藥組能夠提高巨噬細胞吞噬能力,洋蔥槲皮素為120 μg/mL濃度復合藥組對巨噬細胞吞噬功能優于其它濃度復合藥組。結果見圖1。

圖1 洋蔥槲皮素對巨噬細胞吞噬功能的影響(n=3)Fig.1 The influnence of onion quercetinon phagocytosis of macrophages(n=3)

2.2 洋蔥槲皮素單藥組對巨噬細胞分泌IL-1β、COX-2的影響

2.2.1 洋蔥槲皮素單藥組對巨噬細胞分泌IL-1β的影響 LPS 組與空白組比較:LPS 組巨噬細胞IL-1β的分泌量極顯著(p<0.01)高于空白組,說明LPS刺激可以造成巨噬細胞IL-1β的轉錄水平顯著上升。洋蔥槲皮素單藥各濃度組與空白組比較:洋蔥槲皮素單藥各濃度組巨噬細胞IL-1β的分泌量均極顯著(p<0.01)低于空白組;洋蔥槲皮素單藥各濃度組與LPS組比較:洋蔥槲皮素單藥各濃度組巨噬細胞IL-1β的分泌量均極顯著(p<0.01)低于LPS組;洋蔥槲皮素單藥各濃度組之間比較:洋蔥槲皮素單藥各濃度組巨噬細胞IL-1β的分泌量差異均極顯著(p<0.01),且呈一定的劑量依賴關系依次遞減。表明洋蔥槲皮素單藥組能抑制巨噬細胞IL-1β的分泌,洋蔥槲皮素為160 μg/mL濃度組對抑制巨噬細胞IL-1β的分泌效果優于其它濃度組。結果見圖2。

圖2 洋蔥槲皮素對巨噬細胞分泌IL-1β的影響(n=3)Fig.2 The influence of onion quercetin on macrophages secretion of IL-1β(n=3)

2.2.2 洋蔥槲皮素單藥組對巨噬細胞分泌COX-2的影響 LPS組與空白組比較:LPS組巨噬細胞COX-2的分泌量極顯著(p<0.01)高于空白組,說明LPS刺激可以造成巨噬細胞COX-2的轉錄水平顯著上升。洋蔥槲皮素單藥各濃度組與空白組比較:洋蔥槲皮素單藥各濃度組巨噬細胞COX-2的分泌量均極顯著(p<0.01)低于空白組;洋蔥槲皮素單藥各濃度組與LPS組比較:洋蔥槲皮素單藥各濃度組巨噬細胞COX-2的分泌量均極顯著(p<0.01)低于LPS組;洋蔥槲皮素單藥各濃度組之間比較:洋蔥槲皮素單藥各濃度組巨噬細胞COX-2的分泌量差異均極顯著(p<0.01),且呈一定的劑量依賴關系依次遞減。表明洋蔥槲皮素單藥組能抑制巨噬細胞COX-2的分泌,洋蔥槲皮素為160 μg/mL濃度組對抑制巨噬細胞COX-2的分泌效果優于其它濃度組。結果見圖3。

圖3 洋蔥槲皮素對巨噬細胞分泌COX-2的影響(n=3)Fig.3 The influence of onion quercetin on macrophages secretion of COX-2(n=3)

2.3 洋蔥槲皮素對LPS誘導的巨噬細胞分泌IL-1β、COX-2的影響

2.3.1 洋蔥槲皮素對LPS誘導的巨噬細胞分泌IL-1β的影響 洋蔥槲皮素與LPS復合藥各濃度組與空白組比較:洋蔥槲皮素濃度為40、80、120、160 μg/mL復合藥組巨噬細胞IL-1β的分泌量均極顯著(p<0.01)低于空白組;洋蔥槲皮素濃度為20 μg/mL復合藥組巨噬細胞IL-1β的分泌量低于空白組,無統計學意義(p>0.05);洋蔥槲皮素與LPS復合藥各濃度組與LPS組比較:洋蔥槲皮素與LPS復合藥各濃度組巨噬細胞IL-1β的分泌量均極顯著(p<0.01)低于LPS組;洋蔥槲皮素與LPS復合藥各濃度組之間比較:洋蔥槲皮素與LPS復合藥各濃度組巨噬細胞IL-1β的分泌量差異均極顯著(p<0.01),且呈一定的劑量依賴關系依次遞減。表明洋蔥槲皮素與LPS復合藥組能抑制LPS誘導的巨噬細胞IL-1β的分泌,洋蔥槲皮素為160 μg/mL濃度的復合藥組對抑制LPS誘導的巨噬細胞IL-1β的分泌效果優于其它濃度復合藥組。結果見圖4。

圖4 洋蔥槲皮素對LPS誘導的巨噬細胞分泌IL-1β的影響(n=3)Fig.4 The influence of onion quercetin on lps-induced macrophages secretion of IL-1β(n=3)

2.3.2 洋蔥槲皮素對LPS誘導的巨噬細胞分泌COX-2的影響 結果見圖5。洋蔥槲皮素濃度為40、80、120、160 μg/mL復合藥組巨噬細胞COX-2的分泌量均極顯著(p<0.01)低于空白組;洋蔥槲皮素濃度為20 μg/mL復合藥組巨噬細胞COX-2的分泌量低于空白組,無統計學意義(p>0.05);洋蔥槲皮素與LPS復合藥各濃度組與LPS組比較:洋蔥槲皮素與LPS復合藥各濃度組巨噬細胞COX-2的分泌量均極顯著(p<0.01)低于LPS組;洋蔥槲皮素與LPS復合藥各濃度組之間比較:洋蔥槲皮素與LPS復合藥各濃度巨噬細胞COX-2的分泌量差異均極顯著(p<0.01),且呈一定的劑量依賴關系依次遞減。表明洋蔥槲皮素與LPS復合藥組能抑制LPS誘導的巨噬細胞COX-2的分泌,洋蔥槲皮素為160 μg/mL濃度的復合藥組對抑制LPS誘導的巨噬細胞COX-2的分泌效果優于其它濃度復合藥組。

圖5 洋蔥槲皮素對LPS誘導的巨噬細胞分泌COX-2的影響(n=3)Fig.5 The influence of onion quercetin on lps-induced macrophages secretion of COX-2(n=3)

3 討論

3.1 槲皮素對細胞活性的影響

槲皮素可以增加腹腔毛細血管和腸粘膜的通透性,減少腸道水分的滲出,電解質分泌減少,從而最終達到減輕腸道炎癥,發揮止瀉的效果。作為一種天然的免疫抑制劑,槲皮素能夠通過與IgE高親和力受體(FCεRI)交聯,抑制肥大細胞系HMC-1細胞分泌內胰蛋白酶及IL-6的釋放,同時下調HMC-1細胞組氨酸脫梭酶(HDC)mRNA的轉錄水平,使得組胺的釋放減少,減輕過敏反應[13]。有學者發現在OVA誘導的哮喘小鼠模型的動物實驗中發現,槲皮素可以通過調節T-bet和GATA-3基因的表達及比值,影響Thl/Th2淋巴細胞平衡,導致Th2型細胞因子IL-4、IL-5等炎癥介質水平下降,Thl型細胞因子IFN-α的水平升高[14],從而減輕哮喘的變態反應炎癥中具有重要的調節作用。湯海波[15]等通過檢測氧分壓(PaO2),二氧化碳分壓(PaCO2),呼吸頻率(RR)、酸堿度(pH)、IL-6、IL-1β、TNF-α、JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3 表達以及肺組織病理變化和干/濕比(D/W)方法,探討槲皮素對內毒素(LPS)誘導的急性肺損傷作用及機制,發現槲皮素組預處理可通過抑制 JAK2/STAT3信號通路激活而改善氣體交換功能,抑制炎性介質的釋放,從而減輕 LPS 誘導的急性肺損傷。

3.2 洋蔥槲皮素對巨噬細胞吞噬功能的調節作用

當巨噬細胞受到活化信號的刺激時,即可發揮免疫功效?；罨木奘杉毎粌H可以殺滅病原微生物、分泌特定的細胞因子參與機體的炎癥反應,還能夠吞噬機體衰老的細胞,在先天性免疫和獲得性免疫應答中發揮不可替代的作用,吞噬能力是檢測巨噬細胞功能的重要指標。刺激劑LPS可使細胞增殖轉化,其機制主要是通過與淋巴細胞膜上的受體結合,進而誘導胞內信號傳導[16]。LPS是一種革蘭氏陰性細菌內毒素,是革蘭氏陰性細菌的細胞壁組成成分,在炎癥的發生發展中起著重要作用。LPS主要作用于巨噬細胞、內皮細胞的膜受體,通過細胞內信號傳遞級聯,最終激活一些轉錄因子如NN-κB,誘導炎癥前細胞因子、趨化因子、炎癥介質等的合成和釋放,引起炎癥反應[17-19]。

本實驗采用MTT法測定洋蔥槲皮素對體外小鼠腹腔巨噬細胞吞噬金黃色葡萄球菌功能的影響,結果提示,洋蔥槲皮素單藥組、洋蔥槲皮素與LPS復合藥組均能夠提高巨噬細胞的吞噬功能,呈雙向調節作用。洋蔥槲皮素能刺激巨噬細胞進一步分化成熟,成為活化巨噬細胞,使吞噬功能增強,與之功能相適應的結構是富含溶酶體,溶酶體的酶消化其吞噬物,酸性磷酸酶活性增強是與其吞噬功能增強相適應的結構特點[20]。

3.3 洋蔥槲皮素對巨噬細胞分泌IL-1β、COX-2的影響

許銀鳳[21]等采用不同濃度的槲皮素處理細菌LPS誘導過的BV2小膠質細胞,觀察不同濃度的槲皮素對炎癥因子:一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子(TNF-α)以及白介素-1β(IL-1β)的抑制效果。發現槲皮素對LPS刺激的小膠質細胞炎癥因子有一定的下調作用,其抗炎機制可能與下調NO、TNF-α綠以及IL-1β的產生有關。

IL-1是巨噬細胞分泌的主要細胞因子,過量分泌可刺激各種免疫細胞及炎性細胞產生TNF-α、IL-6及IL-8等多種細胞因子,從而介導炎性反應和細胞損傷。IL-1β為一種致炎細胞因子,廣泛參與了機體組織破壞、水腫形成等多種病理損傷過程。本研究采用ELISA 法檢測洋蔥槲皮素對巨噬細胞分泌IL-1β的影響,結果提示,洋蔥槲皮素單藥組、洋蔥槲皮素與LPS復合藥組均能抑制巨噬細胞IL-1β的分泌,IL-1β的分泌呈一定的劑量依賴關系依次遞減,表明洋蔥槲皮素能劑量依賴性地抑制LPS誘導的巨噬細胞因子IL-1β的產生。一定濃度的洋蔥槲皮素能抑制LPS刺激活化的小鼠原代培養腹腔巨噬細胞分泌IL-1β,這可能與抑制IL-1βmRNA表達有關。因此,我們認為洋蔥槲皮素對IL-1β的抑制作用是在基因轉錄水平上進行調節。

COX-2與炎癥性疾病的關系非常密切,各種炎癥疾病和動物炎癥模型的炎性滲出液中均發現 COX-2 mRNA和蛋白表達的增強,同時伴隨 PGE2、PGI2代謝物和 TXA2水平的提高[22]。本研究采用ELISA 法檢測洋蔥槲皮素對巨噬細胞分泌COX-2的影響,結果提示,洋蔥槲皮素單藥組、洋蔥槲皮素與LPS復合藥組均能抑制巨噬細胞COX-2的分泌,COX-2的分泌呈一定的劑量依賴關系依次遞減,表明洋蔥槲皮素劑量依賴性地抑制LPS誘導的巨噬細胞炎癥介質COX-2的產生。洋蔥槲皮素其抗炎作用機制與選擇性抑制 COX-2有關,體現在對COX-2活性的直接抑制作用,或下調COX-2蛋白及mRNA 的表達從而干擾其功能,并且避免了由抑制COX-1而引起的胃腸道等一系列副作用。

4 結論

洋蔥槲皮素可能通過提高巨噬細胞的吞噬功能、影響細胞因子和炎癥介質的分泌,從而發揮抗炎作用。洋蔥為我國主要農產品之一,資源十分豐富,利用其產品洋蔥槲皮素來開發抗炎活性成分或功能食品能大大增加洋蔥的附加值,具有較高的實用價值和廣闊的應用前景。

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Inhibitingeffectofonionquercetinonlipopolysaccharide-inducedmice’senterocoeliamacrophageinflammatoryresponse

NIWan,LIJing-shuang,YUYang*

(College of Food Science and Engineering Jinzhou Medical University,Jinzhou 121001,China)

To discuss the inhibiting effect of onion quercetin on inflammatory response,this paper took mice’s enterocoelia macrophage as sample and used MTT to investigate the impact of onion quercetin single drug group,combination drug of onion quercetin and LPS group on macrophage’s phagocytosis,used ELISA to investigate the impact of onion quercetin single drug group,combination drug of onion quercetin and LPS group on cytokines and inflammatory mediator secretion from mice’s enterocoelia macrophage. The result showed that onion quercetin can improve phagocytosis of macrophage;onion quercetin single drug and combination drug of onion quercetin and LPS can stimulate macrophage of IL-1βand COX-2 which induces secretion of macrophage. In summary,onion quercetin may inhibit inflammation via improving macrophage’s phagocytosis and affecting secretion of cytokines and inflammatory mediator.

onion quercetin;macrophages;cytokines;inflammatory mediator;anti-inflammatory

2017-06-13

倪灣(1994-),女,在讀研究生,研究方向:功能因子與健康的相關性,E-mail:15350907088@163.com。

*通訊作者:于洋(1962-),男,博士,教授,研究方向：功能因子與健康的相關性,E-mail:spyuyang@163.com。

遼寧省科技廳-錦州醫科大學聯合基金項目(20170540357);遼寧省大學生創新創業訓練計劃項目(201610160000055,201610160000011)。

TS201.4

A

1002-0306(2017)23-0284-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.052