天然植物粗提物對藍莓貯運病菌的抑制效果

,,,,,*

(1.湖南大學研究生院隆平分院,湖南長沙 410125;2.湖南省農業科學院農產品加工研究所,湖南長沙 410125)

天然植物粗提物對藍莓貯運病菌的抑制效果

王偉1,陽秀蓮1,袁洪艷2,林樹花2,張菊華2,*

(1.湖南大學研究生院隆平分院,湖南長沙 410125;2.湖南省農業科學院農產品加工研究所,湖南長沙 410125)

為了篩選出對藍莓鮮果貯運有較好應用保鮮效果的天然保鮮劑,采用牛津杯法開展21種植物粗提物對藍莓貯藏中分離的3種病原真菌和物流中常見2種食源性致病細菌的抑菌活性的研究,并確定其最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC),研究提取液濃度變化對病原菌抑制率的影響和進行提取液復配抑菌實驗。結果表明:丁香提取物對真菌的抑制能力表現最強,對灰霉、鏈格孢霉和青霉的平均抑菌圈直徑分別為47.58、39.68和40.54 mm,對這3種真菌的MIC分別為15.63、31.25、31.25 mg/mL,MBC分別為31.25、62.5 和62.5 mg/mL;五味子提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果最強,對這2種細菌的平均抑菌圈直徑分別為42.08、28.49 mm,MIC分別為31.25、62.5 mg/mL,MBC分別為62.5、125 mg/mL。丁香和五味子提取液濃度梯度的變化對不同病原菌抑制率的影響存在差異,高濃度變化影響較大,丁香和五味子復配液比例大于5∶5可作為較佳的藍莓貯運保鮮復配應用參考。

藍莓,貯運病菌,植物粗提物,抑菌效果,復配

藍莓又名越橘(Vacciniumspp.),藍莓屬于呼吸躍變型果實,含水率高、果皮薄,成熟在高溫多水的夏季且采摘期比較集中,采后極不耐貯藏,常溫下放置2～4 d 就開始腐爛變質,鮮果特別容易受機械損傷和微生物侵染而導致腐爛發霉,影響采后的貯藏、運輸及銷售。

隨著食源性疾病的不斷上升,農產品微生物污染引起的疾病風險也逐漸受到世界各國的關注,細菌性微生物更是導致我國食源性疾病發生的主要病因,藍莓等漿果類農產品由于易腐易爛的特性,長期暴露在冷鏈保護之外,容易滋生細菌,不慎食用將危害身體健康,而當前我國的果蔬冷鏈物流基礎設施仍不完善,相關標準未與國際接軌,冷鏈流通環節十分薄弱,嚴重存在食源性致病細菌的滋生風險[1-4]。

近年來,人們對食品安全越來越關注,探索安全、高效、環保、經濟的綠色新型果蔬貯運保鮮技術已成為當下研究的熱點。天然植物提取物中含有抑制病原微生物、抗菌、抗炎、抗癌等生物活性成分[5-7],對果蔬有防腐保鮮作用且無毒、無害、無殘留,食用安全,能有效延長果蔬貨架期壽命,其中從中草藥和香辛料中提取天然活性成分被認為是食品防腐保鮮研究領域最具前景的發展方向,是開發新型高效果蔬生物防腐保鮮劑的重要途徑[8]。在天然植物源保鮮劑的應用研究中,對草莓[9]、柑橘[10]、獼猴桃[11]等都起到了良好的貯藏保鮮效果,大大地延長了貨架期,而天然植物源保鮮劑對藍莓貯藏保鮮的研究卻鮮有報道。

本研究以天然植物粗提物為抑菌劑,通過研究對采后自然貯藏腐爛的藍莓果實中分離出的3種主要病原霉菌和物流中常見2種食源性致病細菌的體外抑菌能力,篩選出對藍莓貯運保鮮和食用安全有潛在應用效果的植物提取物,為藍莓鮮果綠色保鮮技術及高效、廣譜、無毒、天然植物源新型綠色防腐保鮮劑的研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

迷迭香、青花椒、綠茶、丁香、牛至、金銀花、黃芩、八角、五味子、連翹、肉桂、高良姜、艾蒿、馬尾松、厚樸、百里香、薄荷、荷葉、黑胡椒、白鮮、廣藿香 購自湖南省長沙市高橋市場;從采后貯藏的湖南省長沙縣兔眼藍莓(粉藍)果實上分離出3種主要病原真菌,分別為灰霉(Botrytiscinerea)、鏈格孢霉(Alternariaalternata)和青霉(Penicilliumsp.);金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大腸桿菌(Escherichiacoli) 由中國普通微生物菌種保藏管理中心提供,所有菌株3 ℃冰箱保存,備用;營養瓊脂培養基(NA)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA) 購自廣東環凱微生物科技有限公司;MH肉湯(MH Broth)、馬鈴薯液體培養基(含氯霉素) 青島高科技工業園海博生物技術有限公司;無水乙醇 國藥集團化學試劑有限公司;無菌生理鹽水 按照無菌檢查法配制。

SW-CJ-1B型超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;HWS型智能恒溫恒濕培養箱 寧波江南儀器廠制造;LX-B100 L型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器 合肥華泰醫療設備有限公司;SHA-B型水浴恒溫振蕩器 金壇市醫療儀器廠;GL-888旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;750T西廚多功能粉碎機 鉑歐五金廠;RE-52AA旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;循環真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;回流冷凝裝置 北京德天佑科技有限公司;AP-01P真空抽濾泵 天津奧特賽恩斯儀器有限公司;KQ-700DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取液制備 參考寥玨[12]的制備方法略作改進,將植物原料干燥粉碎,過40目篩,稱取500 g干粉裝入廣口三角瓶中,加入70%乙醇,料液比為1∶5,浸泡24 h;經40 MHz超聲輔助提取2 h后真空抽濾,收集濾液,再次加入70%乙醇,重復上述過程3次,合并濾液,旋轉蒸發(40 ℃,100 r/min)濃縮得植物提取物浸膏,裝入250 mL藍蓋棕色玻璃試劑瓶,前后稱重。

按以下公式計算提取率:

P(%)=m/W×100

式中,P-植物粗提物提取率(%);m-植物浸膏實際提取重量(g);W-植物干粉原料重量(g)。

根據提取率計算結果稱取一定量提取物浸膏均先用0.6 mL 50%乙醇將其溶解,后加入5%乙醇2 mL旋渦振蕩30 s,待大部分浸膏溶解,用蒸餾水定容至40 mL,40 ℃恒溫水浴振蕩30 min,再旋渦振蕩,重復上述操作,直至提取物充分溶解,制備1 g/mL母液,用蒸餾水將其稀釋至相應濃度梯度,高溫高壓(121 ℃,0.5 MPa,20 min)滅菌,4 ℃冰箱內避光保存備用。

1.2.2 菌懸液的制備 將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌分別接種到營養瓊脂培養基上,在37 ℃培養24 h,挑選單一菌落接種到MH肉湯培養基,充分振蕩混勻,采用麥氏比濁法[13],用0.5麥氏比濁管調整細菌濃度至1×107cfu/mL;將分離純化后的真菌菌種分別接種到PDA培養基,28 ℃培養72 h,無菌水洗出,將菌懸液過濾四層紗布過濾后,振蕩均勻,用血球計數板計數[14],用無菌生理鹽水稀釋菌懸液至1×106cfu/mL。

1.2.3 抑菌活性的測定 采用管碟法[15]。取無菌培養皿,每皿倒入約20 mL培養基(細菌:NA;真菌:PDA),吸取200 μL菌液入平板表面,用涂布器將菌液涂布均勻,等距離放置3個已滅菌牛津杯(內徑6 mm,外徑7.8 mm,高10 mm),向其中2個牛津杯中加入0.5 g/mL質量濃度的植物提取液250 μL,另一牛津杯加入對照液(以0.6 mL 50%乙醇+2 mL 5%乙醇定容至20 mL為對照母液),每種菌做2組平行。細菌于37 ℃ 培養24 h,真菌于28 ℃培養48～72 h(灰霉、鏈格孢霉72 h,青霉48 h),取下牛津杯,用十字交叉法測量抑菌圈直徑,記錄數據。對從藍莓果實中分離得到的3種主要霉菌進行體外抑菌實驗,以0.5 g/mL濃度對21種植物提取物進行篩選,根據篩選結果對抑菌效果較為明顯的丁香和五味子兩種植物提取液分別作不同濃度梯度(0.5、0.2、0.05 g/mL)的抑菌實驗,參照賀紅宇的方法[16],計算抑制率,探究不同濃度的提取液對病原菌抑制率的影響。計算公式如下:

表1 植物原料及提取率Table 1 Plant material and extraction rate

抑制率(%)=(C-T)/C×100

式中:C-對照菌落直徑(mm);T-處理菌落直徑(mm)。

1.2.4 最低抑菌濃度(MIC)的測定 根據抑菌活性測定的結果,選取抑菌效果明顯的植物提取液進行實驗。參照華亞南[17]的方法略作修改。置于恒溫搖床中(細菌37 ℃,培養24 h;真菌28 ℃,灰霉、鏈格孢菌培養48 h,青霉培養36 h)振蕩(100 r/min)培養,取出用肉眼觀察,不發生渾濁變化(沒有懸浮菌落)的最高提取液的稀釋倍數后的濃度即為該提取液的MIC值,實驗重復3次。

1.2.5 最低殺菌濃度(MBC)的測定 基于最小抑菌濃度(MIC)測定結果,將所有與對照比濁清晰的試管培養液接種于對應平板培養基,細菌37 ℃培養24 h,真菌28 ℃(灰霉、鏈格孢霉培養48 h,青霉培養36 h)培養,無菌生長的培養皿所對應的提取液稀釋管的濃度即是該提取液的最低殺菌濃度(MBC)。

1.2.6 復配提取液抑菌活性的測定 根據單一提取物的抑菌效果,對0.5 g/mL濃度的丁香和五味子,分別以 1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1 (V/V)的比例進行復配實驗,按照1.2.3抑菌活性實驗方法,測定復配液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、灰霉、鏈格孢霉和青霉5種病原菌的抑菌圈直徑大小。

1.3 數據處理

采用SPSS 22統計軟件(美國IBM公司)進行單因素方差分析,表中數值以平均值SD表示,以p<0.05作為差異顯著性判斷標準,利用Origin 7.5軟件(美國OriginLab公司)繪圖。

2 結果與分析

2.1 植物原料提取率

從表1可以看出,迷迭香、青花椒、綠茶、丁香4種植物提取物的提取率較高,均超過30%,牛至、金銀花、黃芩、八角、五味子、連翹次之,在18%～27%之間,根據抑菌篩選結果和提取率,丁香可作為天然植物源保鮮劑的優先篩選源。

2.2 植物提取液對病菌的抑菌效果

由表2可以看出,丁香對3種霉菌抑制作用均表現最強,抑菌圈直徑顯著高于其他植物提取物(p<0.05),均超過40 mm。從綜合抑菌效果來看,除丁香抑菌效果最好外,厚樸、黃芩和八角也均對3種霉菌有廣譜抑菌活性。由表3可以看出,篩選得到對金黃色葡萄球菌有抑菌活性的植物明顯多于大腸桿菌,其中五味子對2種細菌的抑制效果最好,對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑分別達到42.08、28.49 mm,其他抑菌活性較好的植物提取物對這2種細菌抑制作用大小為:八角>綠茶>連翹>丁香>迷迭香>金銀花。

表2 植物提取物對病原真菌的抑菌活性Table 2 Antifungal activity of plant extracts against pathogenic fungi

注:表2,表3中“-”表示沒有抑菌圈形成;同列不同字母表示差異顯著(p<0.05);表6同。

表3 植物提取物對病原細菌的抑菌活性Table 3 Antibacterial activity of plant extracts against pathogenic bacteria

丁香提取物主要抑菌活性成分為丁香酚[18],具有較強的抗氧化、抗真菌效果[19-20]。抑菌活性結果表明,丁香對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌同樣有較強抑制效果,Prabuseenivasan等[21]也研究發現丁香精油對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等6種細菌有較好的抑制效果;五味子對多種致病菌具有廣譜抗菌作用[22-24],其有效抑菌成分為木脂素類化合物[25],本研究中,五味子對金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性菌)的抑制強度明顯高于大腸桿菌(革蘭氏陰性菌),推斷五味子對革蘭氏陽性和陰性細菌有著不同的抑菌機理,可能與青霉素類似,對革蘭陽性菌抑制效果較強,對革蘭氏陰性菌作用稍弱,閆紹悅等[26]研究得到,五味子提取液對革蘭氏陽性和陰性菌均有明顯的抑菌活性并對耐藥菌也有較穩定的抑菌活性。可見,丁香和五味子可作為研發具有高效、廣譜植物源防腐保鮮劑的潛在資源。

2.3 提取液濃度對病菌抑制率的影響

0.5 g/mL濃度的丁香提取液對3種病原真菌的抑制效果見圖1,3種霉菌牛津杯周圍都有明顯的抑菌區域形成,對青霉的抑菌圈較為規則;0.5 g/mL的五味子提取液對2種致病菌的抑制效果見圖2,對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有明顯且規則的抑菌圈形成。由圖3對比結果可以看出,0.5 g/mL的丁香提取液對3種霉菌的抑制效果最好,抑制率均超過50%,隨著濃度的降低,對3種霉菌的抑制作用均出現不同程度下降。在0.05 g/mL時,丁香提取液對3種霉菌的抑制率在20%左右;對灰霉的抑制率隨濃度變化較鏈格孢霉和青霉下降明顯;由圖4看出,0.5 g/mL五味子提取液對金黃色葡萄球菌的抑制率超過50%,對大腸桿菌的抑制率略差,五味子提取液在高濃度梯度變化時對2種細菌抑制率同樣影響較大,低濃度梯度影響幅度不大。不同濃度梯度變化與病原菌的抑制效果沒有成比例關系可能與提取液中有效抑菌成分的變化及不同病原菌對提取物耐藥性相關。

圖1 丁香對灰霉(1)、鏈格孢霉(2)、青霉(3)的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of clove extract on Botrytis cinerea(1), Alternaria alternata(2)and Penicillium sp.(3)

圖2 五味子對金黃色葡萄球菌(4)、大腸桿菌(5)的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of Fructus schisandrae extract on Staphylococcus aureus(4)and Escherichia coli(5)

圖3 不同濃度丁香提取液對真菌的抑制率Fig.3 Different concentration of clove extract on fungi inhibition rate

圖4 不同濃度五味子提取液對細菌的抑制率Fig.4 Different concentration of Schisandra chinensis extract on bacteria inhibition rate

2.4 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)

從表4可以看出,丁香對灰霉(Botrytiscinerea)、鏈格孢霉(Alternariaalternata)和青霉(Penicilliumsp.)的MIC值和MBC值均最低,與抑菌活性測定實驗結果一致。其中丁香對灰霉的MIC為15.63 mg/mL,MBC為31.25 mg/mL,其次為廣藿香;其他植物提取物對灰霉的MIC和MBC較表2表征效果略有不同,可能與抑菌接觸方式的差異相關;丁香對鏈格孢霉的MIC和MBC分別為31.25和62.5 mg/mL;綠茶、五味子對鏈格孢霉的抑菌效果相對較弱,厚樸、八角、黃芩介于兩種抑菌強度之間;丁香對青霉的MIC和MBC分別為31.25和62.5 mg/mL,八角、百里香、黃芩對青霉的MIC和MBC測定結果與表2抑菌活力相比存有差異,剩余提取物抑菌能力都較弱與表2抑菌活力基本一致。

由表5結果可知,五味子對2種細菌的抑菌效果最強,對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC分別為31.25和62.5 mg/mL,MBC分別為62.5和125 mg/mL,其他提取物對2種細菌的MIC值和表3抑菌效力結果相一致,八角、丁香對這2種細菌有相同的MIC和MBC,連翹、迷迭香、綠茶對金黃色葡萄球菌的最低抑菌活力稍強于大腸桿菌。

表4 植物提取物對病原真菌的MIC和MBCTable 4 MIC and MBC of plant extracts against pathogenic fungi

注:表中“-”表示無最低效力。

2.5 復配提取液的抑菌效果

表6 復配提取液的抑菌活性Table 6 Antimicrobial activity of compound extracts

由表6可知,丁香和五味子復配比例的調整對3種霉菌的抑菌效力沒有表現出協同增效的作用,起主要抑菌效力的為丁香。隨著丁香比例的增大,對3種霉菌的抑菌圈直徑均呈不同梯度擴大,復配液在5∶5比例后對灰霉和青霉的抑菌直徑增幅較為明顯,比例在9∶1時對3種霉菌的抑制能力達到最大,但抑菌圈直徑仍低于0.5 g/mL單獨使用丁香的抑菌效力。復配液的個別比例區間對2種細菌的抑菌效力出現不同程度的影響變化,6∶4配比對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑較前后配比增大顯著(p<0.05),表現出局部比例區間增效作用,之后抑菌效力遞減,而5∶5配比對大腸桿菌的增效抑制作用更為顯著(p<0.05),達到所有配比中最好的抑制效果。

總之,丁香和五味子兩種提取液的復配對5種不同病原菌呈現出不同變化的抑菌效力,但由抑菌效果可知,復配液擴大了較單一提取液的抑菌譜范圍,保證具有顯著抑菌效果的同時,減少了每種單劑使用濃度和用量,在藍莓鮮果貯運中影響保鮮品質的主要為病原霉菌,因此為更加有效抑制主要霉菌的生長,丁香和五味子兩種提取液大于5∶5比例可作為制備藍莓貯運保鮮劑較佳的復配參考。

3 結論

從迷迭香、青花椒、綠茶等21種植物乙醇提取物中篩選出丁香、八角、黃芩等植物提取物對灰霉、鏈格孢霉和青霉3種病原真菌有不同強度的抑制效果,五味子、八角、連翹等植物取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌2種貯運致病細菌有抑制效果。其中,丁香對3種真菌的抑菌能力最明顯。0.5 g/mL丁香提取液對3種霉菌的抑制率均超過50%,對灰霉的MIC為15.63 mg/mL,MBC為31.25 mg/mL,對鏈格孢霉和青霉的MIC和MBC值相同,分別為31.25和62.5 mg/mL;五味子對2種細菌的抑制能力最強,其次為八角、連翹和綠茶,五味子對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC分別為31.25和62.5 mg/mL,MBC分別為62.5和125 mg/mL。提取液濃度的變化對病菌的抑制能力影響較大,濃度梯度的變化對不同病菌的抑菌效果也有所差異。

對丁香、五味子2種分別對病原真菌和致病細菌具有最強抑菌能力的提取液復配,產生的復配抑菌效力有所不同,一定比例的復配液對2種細菌的抑菌效力呈現出協同增效作用,對真菌則沒有表現出增效,丁香和五味子的比例在5∶5以上可作為制備藍莓貯運保鮮劑的較佳復配參考。

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Inhibitoryeffectofnaturalplantcrudeextractsonthepathogenicbacteriaofblueberryduringstorageandtransportation

WANGWei1,YANGXiu-lian1,YUANHong-yan2,LINShu-hua2,ZHANGJu-hua2,*

(1.Longping Branch,Graduate School of Hunan University,Changsha 410125,China;2.Hunan Agricultural Sciences Academy of Agricultural Products Processing Institute,Changsha 410125,China)

To screen out the natural preservative with good fresh-keeping effect on blueberry fruit during storage and transportation. In this study,21 kinds of plant crude extracts were used to investigate the antimicrobial activities of 3 pathogenic fungi isolated from blueberry during storage and 2 common foodborne pathogenic bacteria in the logistics by Oxford cup method and the minimal inhibitory concertration(MIC)and minimal bactericidal concentration(MBC)of these plant extracts were determined. Besides,the effect of concentration of extracts on the inhibition rate of pathogens was studied and the bacteriostatic activity of the compound extracts were tested. The results showed that clove has the strongest inhibitory ability,and the average inhibitory circle diameters ofBotrytiscinerea,AlternariaalternataandPenicilliumsp. were 47.58,39.68,40.54 mm,respectively,and the MICs of clove against these 3 fungi were 15.63,31.25,31.25 mg/mL,the MBCs were 31.25,62.5,62.5 mg/mL. The antibacterial effect of Schisandra chinensis againstStaphylococcusaureusandEscherichiacoliwas obviously higher than the other extracts,the average inhibitory circle diameter on the 2 kinds of bacteria was 42.08,28.49 mm,the MICs were 31.25,62.5 mg/mL,the MBCs were 62.5,125 mg/mL. Two extracts of clove andSchisandrachinensis,which were the strongest inhibitory effect on Blueberry pathogenic fungi and bacteria,respectively,were screened out and the Change of these two kinds of extract concentration gradient inhibition effect on different pathogens are different,the larger effect of high concentration,besides,clove and schisandra compound ratio greater than 5∶5 can be used as a better blueberry preservative application reference.

blueberry;storage and transportation pathogen;plant crude extracts;antimicrobial activity;compound extract

2017-06-13

王偉(1990-),男,碩士研究生,研究方向:果蔬貯藏保鮮,E-mail:davekingww@126.com。

*通訊作者:張菊華(1971-),女,碩士，研究員,研究方向:果蔬貯藏與加工,E-mail:zhangjuhua99@163.com。

國家科技支撐計劃(2015BAD16B01);湖南省重點研發計劃(2016NK2182)。

TS255.3

A

1002-0306(2017)23-0232-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.043