羊奶及奶粉中27種β受體激動(dòng)劑類藥物殘留UPLCMS/MS檢測(cè)方法

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(1.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,北京 102609;2.中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì),北京 100048)

劉洪斌1,李穎1,姚喜梅2,于雷1,蔡英華1,*

(1.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,北京 102609;2.中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì),北京 100048)

采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜建立羊奶及奶粉中吡布特羅、丙卡特羅、瑞普特羅、克倫普羅、奧達(dá)特羅等27種β-受體激動(dòng)劑類藥物殘留檢測(cè)方法。樣品經(jīng)過1%甲酸乙腈提取、Oasis PRiME HLB柱凈化后,經(jīng)Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)分離,以甲醇和0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,多通道MRM信號(hào)采集模式,27種β-受體激動(dòng)劑類藥物能在10.5 min內(nèi)出峰完好,在1.0～100.0 μg/L濃度范圍內(nèi),27種β-受體激動(dòng)劑類藥物線性良好,相關(guān)系數(shù)均在0.993以上;羊奶中最低定量限均低于0.5 μg/kg,通過0.5、2.5、5.0 μg/kg三個(gè)濃度的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)表明,回收率為65.7%～119%,批內(nèi)變異系數(shù)為0.79%～10.4%,批間變異系數(shù)為2.13%～15.7%。奶粉中最低定量限均低于2.0 μg/kg,通過2.0、10.0、20.0 μg/kg三個(gè)濃度的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)表明,回收率為60.5%～109%,批內(nèi)變異系數(shù)為1.91%～12.4%,批間變異系數(shù)為3.06%～17.2%。所建立方法為一種高通量檢測(cè)羊奶及奶粉中β-受體激動(dòng)劑類藥物殘留確證分析方法。

羊奶,奶粉,β-受體激動(dòng)劑類,殘留,UPLC-MS/MS

羊奶在國(guó)際營(yíng)養(yǎng)學(xué)界被稱為“奶中之王”,相比牛奶,羊奶脂肪粒和蛋白微粒小,更容易被人體吸收,羊奶酪蛋白含量比牛奶低,乳清蛋白比例高,更接近于人奶,更適合嬰幼兒食用,同時(shí)異體蛋白含量也較少,對(duì)牛奶過敏和體質(zhì)較弱的人群更適合選用羊奶[1]。隨著消費(fèi)水平的提高,越來越多的消費(fèi)者傾向于營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高的羊奶及奶制品,但隨著近年來我國(guó)畜產(chǎn)品例行監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)羊肉中β-受體激動(dòng)劑類藥物的不斷檢出,羊奶及奶粉中β-受體激動(dòng)劑類藥物殘留的風(fēng)險(xiǎn)越來越大,對(duì)嬰幼兒及體弱人群身體健康造成潛在威脅。

現(xiàn)行國(guó)標(biāo)GB/T22965-2008未包含羊奶和奶粉中β-受體激動(dòng)劑類藥物檢測(cè)方法,目前檢測(cè)β-受體激動(dòng)劑類藥物方法文獻(xiàn)較多,近年來檢測(cè)方法有毛細(xì)管電泳法[2]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[3]、飛行時(shí)間質(zhì)譜法[4]和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[5-6]等,尤其液質(zhì)聯(lián)用方法較多;動(dòng)物源性基質(zhì)大多為動(dòng)物組織,尿液和牛奶等[7-12],且檢測(cè)新型β-受體激動(dòng)劑藥物種類少,而同時(shí)檢測(cè)羊奶及奶粉中包括吡布特羅、丙卡特羅、瑞普特羅、克倫普羅、奧達(dá)特羅等27種β-受體激動(dòng)劑類藥物的檢測(cè)方法還未見報(bào)道,因此建立同時(shí)檢測(cè)羊奶及奶粉中多種β-受體激動(dòng)劑類藥物殘留定量方法勢(shì)在必行。

本文采用超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜建立的羊奶及奶粉中27種β-受體激動(dòng)劑類藥物檢測(cè)方法,具有藥物種類多、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高,穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn),并通過已知陽性樣品驗(yàn)證,方法滿足羊奶及奶粉中β-受體激動(dòng)劑類藥物殘留檢測(cè)要求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

奧西那林(CAS:586-06-1)、西馬特羅(CAS:54239-37-1)、特布他林(CAS:23031-25-6)、沙丁胺醇(CAS:242-424-0)、齊帕特羅(CAS:117827-79-9)、西布特羅(CAS:54239-39-3)、吡布特羅(CAS:38677-81-5)、羥芐羥麻黃堿(CAS:26652-09-5)、丙卡特羅(CAS:72332-33-3)、非諾特羅(CAS:13392-18-2)、瑞普特羅(CAS:54063-54-6)、羥甲基克倫特羅(CAS:38339-18-3)、克侖塞羅(CAS:157877-79-7)、克倫普羅(CAS:38339-11-6)、氯丙那林(CAS:3811-25-4)、克侖特羅(CAS:37148-27-9)、萊克多巴胺(CAS:97825-25-7)、妥布特羅(CAS:41570-61-0)、美托洛爾(CAS:37350-58-6)、馬布特羅(CAS:56341-08-3)、馬噴特羅(CAS:54238-51-6)、福莫特羅(CAS:73573-87-2)、溴布特羅(CAS:41937-02-4)、班布特羅(CAS:81732-65-2)、奧達(dá)特羅(CAS:868049-49-4)、噴布特羅(CAS:38363-32-5)、苯乙醇胺A(CAS:1346746-81-3) 購(gòu)于德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司,純度均在97%以上;乙腈、甲醇、甲酸等有機(jī)溶劑均為色譜純 美國(guó)Fisher公司;Waters Oasis PRiME HLB SPE柱(60 mg,3 cc) 美國(guó)waters公司。

用甲醇將上述標(biāo)準(zhǔn)品配制單標(biāo)母液,并配制10 μg/mL混合儲(chǔ)備液于-20 ℃保存(保存期限3個(gè)月),使用時(shí)現(xiàn)配成系列標(biāo)準(zhǔn)工作液;

樣本原料:10份羊奶及5份奶粉購(gòu)于超市和電商,部分樣本經(jīng)LC-MS/MS分析確認(rèn)為不含待測(cè)物的陰性樣本作空白添加實(shí)驗(yàn)使用;實(shí)驗(yàn)室原有含β-受體激動(dòng)劑類藥物羊奶樣為陽性測(cè)試樣本。

超高效液相色譜儀(Acquity UPLC)配三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀(quattro premier XE)、3K15型離心機(jī)、millipore純水儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 前處理過程 羊奶樣品提取:準(zhǔn)確稱取2 g(精確到0.01 g)羊奶于50 mL離心管中,加入50 μLβ-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶,37 ℃酶解12 h,然后加入8 mL 1%甲酸乙腈,9500 r/min離心5 min取上清液于15 mL離心管中,待過凈化柱。

奶粉樣品提取:準(zhǔn)確稱取5 g(精確到0.01 g)奶粉樣品,加入適量水溶解,并最終定容于20 mL,充分混勻后,準(zhǔn)確稱取2 mL羊奶于50 mL離心管中,加入50 μLβ-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶,37 ℃酶解12 h,后加入8 mL 1%甲酸乙腈,9500 r/min離心5 min取上清液于15 mL離心管中,待過凈化柱。

凈化:將提取液全部轉(zhuǎn)移至80%乙腈水活化的Oasis PRiME HLB柱中,流速1～2 d/s,收集全部濾過液,50 ℃氮?dú)獯抵两?用初始流動(dòng)相定容至1 mL,12000 r/min離心5 min,0.22 μm濾膜過濾待上機(jī)測(cè)定。

1.2.2 液相條件 色譜柱:Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流速:0.3 mL/min;流動(dòng)相A:甲醇,B:0.1%甲酸水溶液,0～0.5 min,3% A保持不變,0.5～2.0 min,3% A線性變化至25%;2.0～3.5 min,25% A保持不變,3.5～3.6 min,25% A線性變化至40%;3.6～4.0 min,40% A保持不變;4.0～5.5 min,40% A線性變化至90%;5.5～8.0 min,90% A保持不變;8.0～8.1 min,90% A線性變化至3%,8.1～10.5 min,3% A保持不變。

1.2.3 質(zhì)譜條件 電離模式:ESI+;毛細(xì)管電壓:3.5 kV;萃取錐孔電壓:3 V;RF透鏡電壓:0.5 V;源溫:110 ℃;脫溶劑溫度:350 ℃;錐孔氣流速:50 L/h;脫溶劑氣流速:550 L/h;碰撞氣流速:0.17 mL/min;采集模式:多通道MRM。

1.2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

1.2.4.1 線性方程及靈敏度 實(shí)驗(yàn)采用空白羊奶及奶粉樣品經(jīng)1.2.1方法處理,在1.0～100.0 μg/L濃度范圍內(nèi)分別添加β-受體激動(dòng)劑類藥物混標(biāo)溶液,配制1.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L基質(zhì)加標(biāo)溶液,依次進(jìn)樣,以色譜峰面積為縱坐標(biāo),化合物濃度為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線;將處理好的空白羊奶及奶粉樣品逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液,按10倍信噪比確定方法的定量限(LOQ)。

1.2.4.2 回收率實(shí)驗(yàn)及變異系數(shù) 取空白羊奶樣品,添加濃度為0.5、2.5、5.0 μg/kg(奶粉中添加2.0、10.0、20.0 μg/kg)三個(gè)水平混標(biāo)溶液,批內(nèi)6次平行,按1.2.1方法進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn);在不同日期重復(fù)測(cè)定3個(gè)批次,計(jì)算日內(nèi)變異系數(shù)與日間變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

通過文獻(xiàn)[13]對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),β-受體激動(dòng)劑類化合物碎片離子和丟失離子存在一定共性,其中羥甲基克倫特羅、克侖塞羅、克倫普羅和克侖特羅具有相同的碎片離子m/z 202.9,推測(cè)是各自準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+,脫去H2O分子后,經(jīng)結(jié)構(gòu)重排失去(2-甲基丙烯)得到的特征碎片;而沙丁胺醇、西布特羅、丙卡特羅、瑞普特羅、克倫普羅等丟失離子普遍為m/z 60.2、m/z 18.0、m/z 74.3分別為脫H2O+丙烯峰、脫H2O峰和脫H2O+2-甲基丙烯峰;依據(jù)歐盟2002/957/EC決議中關(guān)于質(zhì)譜分析法定性定量不少于4分的規(guī)定,選擇強(qiáng)度較高的兩對(duì)子離子,并優(yōu)化碰撞電壓使其相應(yīng)強(qiáng)度最佳,各種藥物優(yōu)化母離子和子離子及對(duì)應(yīng)聚焦電壓和碰撞電壓值見表1。

表1 27種β-受體激動(dòng)劑類藥物的檢測(cè)離子、對(duì)應(yīng)質(zhì)譜參數(shù)及保留時(shí)間Table 1 Qualitative ions,quantitative Ions* and relevant parameters of β-agonists

續(xù)表

注:*為表示定量離子。

由于同時(shí)分析藥物較多,單一MRM通道無法滿足靈敏度和準(zhǔn)確度要求,因此采用分時(shí)段多通道MRM模式,并對(duì)駐留時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,使各通道駐留時(shí)間在0.005～0.05 ms之間,保證各色譜峰上都能達(dá)到10～12個(gè)數(shù)據(jù)采集點(diǎn),確保每種化合物都能得到較高的靈敏度和準(zhǔn)確定量。

2.2 液相條件優(yōu)化

本文采用甲醇和0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相,選擇Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)、Shield RP18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)和BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,多種β-受體激動(dòng)劑類化合物在50 mm色譜柱上,出峰時(shí)間集中在2～4 min。由于相對(duì)保留時(shí)間過于集中造成色譜峰上采集點(diǎn)數(shù)過少,嚴(yán)重影響目標(biāo)化合物的靈敏度,而后兩種100 mm色譜柱中,BEH C18類型色譜柱下,各物質(zhì)更為分離完全,峰形更好,且能避免萊克多巴胺出峰分叉的問題。

2.3 提取條件優(yōu)化

國(guó)標(biāo)方法及文獻(xiàn)[14-16]中,樣本中某些β-受體激動(dòng)劑類藥物易和動(dòng)物體內(nèi)葡萄糖醛酸結(jié)合,造成提取回收率低的現(xiàn)象,因此將通過空白羊奶樣品添加20 μg/kgβ-受體激動(dòng)劑類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,經(jīng)過37 ℃酶解12 h。然后分別選取0.2%甲酸乙腈、0.5%甲酸乙腈、1%甲酸乙腈和2%甲酸乙腈為提取溶劑處理豬肉樣品,經(jīng)UPLC-MS/MS檢測(cè)發(fā)現(xiàn):酸性有機(jī)試劑提取條件下,β-受體激動(dòng)劑類藥物大多能達(dá)到50%以上的回收率,并且不同的甲酸量對(duì)提取效果的影響不同,綜合全部β-受體激動(dòng)劑類藥物回收率發(fā)現(xiàn)(圖1)1%甲酸乙腈提取效果最好,27種β-受體激動(dòng)劑類藥物回收率均能達(dá)到60%以上。

圖1 不同提取溶劑下提取回收率Fig.1 Recoveries were obtained by different extraction conditions

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

羊奶因含有更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生物活性因子,增加了基質(zhì)的復(fù)雜性,采用質(zhì)譜進(jìn)行定量分析時(shí)會(huì)存在不同程度和來源的基質(zhì)效應(yīng)[17-18],為評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)的影響,本實(shí)驗(yàn)采取提取后添加法[19],為此按照1.2.1方法處理空白羊奶樣本,然后添加20 μg/kg混合標(biāo)準(zhǔn)溶液制成基質(zhì)加標(biāo)溶液,設(shè)計(jì)基質(zhì)效應(yīng)對(duì)照實(shí)驗(yàn),基質(zhì)效應(yīng)(ME)=標(biāo)液在空白羊奶基質(zhì)中峰面積/標(biāo)液在純?nèi)軇┲蟹迕娣e,若比值小于1.0,說明基質(zhì)對(duì)待測(cè)物的響應(yīng)產(chǎn)生抑制作用;若大于1.0,說明基質(zhì)的存在增強(qiáng)效果;若等于1.0,說明待測(cè)物的響應(yīng)未受影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)27種β-受體激動(dòng)劑類藥物在羊奶基質(zhì)中均存在不同程度的基質(zhì)抑制作用,ME分別為0.56～1.00之間,原因可能為前處理過程后,羊奶中脂類、糖類、可溶性蛋白等內(nèi)源性雜質(zhì)隨目標(biāo)化合物共流出,在電離過程中共流出物抑制目標(biāo)化合物的離子化過程。因此在檢測(cè)過程中應(yīng)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液,消除基質(zhì)效應(yīng)的影響,不同藥物基質(zhì)抑制程度見圖2。

圖2 羊奶中基質(zhì)效應(yīng)圖Fig.2 The figure of matrix effect in goat milk

2.5 線性方程及靈敏度實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)采用空白羊奶及奶粉樣品經(jīng)1.2.1方法處理,分別添加β-受體激動(dòng)劑類藥物混標(biāo)溶液,配制1.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明1.0～100.0 μg/L范圍內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)均大于0.993,結(jié)果見表2～表3。

將處理好的空白羊奶及奶粉樣品逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液,按10倍信噪比確定方法的定量限(LOQ),羊奶中定量限在0.1～0.5 μg/kg,奶粉中該類藥物定量限為0.5～2.0 μg/kg,結(jié)果見表2～表3。

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)及變異系數(shù)

取空白羊奶樣品,添加濃度為0.5、2.5、5.0 μg/kg(奶粉中添加2.0、10.0、20.0 μg/kg)三個(gè)水平混標(biāo)溶液,批內(nèi)6次平行,不同時(shí)間重復(fù)測(cè)定3個(gè)批次,進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn),添加5.0 μg/kgβ-受體激動(dòng)劑類藥物的羊奶樣品定量離子圖見圖3,回收率在65.7%～119%,批內(nèi)變異系數(shù)為0.79%～10.4%,批間變異系數(shù)為2.13%～15.7%(奶粉中回收率在60.5%～109%,RSD%值為1.91%～12.4%,批間變異系數(shù)為3.06%～17.2%)之間,方法的準(zhǔn)確度及精密度滿足 GB/T 27404-2008 技術(shù)要求,結(jié)果見表2。

表2 羊奶中27種β-受體激動(dòng)劑類藥物添加回收率、CV值、線性系數(shù)及定量限值(n=6)Table 2 Spiked recoveries,CVs,linear coefficients and the limits of quantitation of 27 β-agonists in goat milk(n=6)

表3 奶粉中27種β-受體激動(dòng)劑類藥物添加回收率、CV值、線性系數(shù)及定量限值(n=6)Table 3 Spiked recoveries,CVs,linear coefficients and the limits of quantitation of 27 β-agonists in powder(n=6)

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

應(yīng)用該方法對(duì)超市購(gòu)買的10份羊奶樣品、5份羊奶粉和實(shí)驗(yàn)室原有陽性羊奶樣本進(jìn)行測(cè)定,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,購(gòu)買的羊奶及奶粉樣本中未檢測(cè)到β-受體激動(dòng)劑類藥物殘留,陽性樣本檢出沙丁胺醇含量為5.56 μg/kg,與原有結(jié)果5.82 μg/kg相比較,在結(jié)果偏差允許范圍內(nèi)。表明該方法適用于羊奶及奶粉中β-受體激動(dòng)劑類藥物檢測(cè)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)液相和質(zhì)譜條件和前處理過程進(jìn)行優(yōu)化,建立了同時(shí)檢測(cè)羊奶及奶粉樣本中吡布特羅、丙卡特羅、瑞普特羅、克倫普羅、奧達(dá)特羅等27種β-受體激動(dòng)劑類藥物的超高效色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法,并對(duì)所建方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證和實(shí)際樣本檢測(cè),驗(yàn)證該方法滿足羊奶及奶粉中β-受體激動(dòng)劑類藥物檢測(cè)要求。該方法彌補(bǔ)了現(xiàn)有國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)基質(zhì)單一,檢測(cè)藥物種類少的缺點(diǎn),對(duì)奶及奶粉中多種β-受體激動(dòng)劑類藥物同時(shí)確證檢測(cè)、篩查和確證羊奶及奶粉中β-受體激動(dòng)劑類藥物殘留以及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制修訂提供了參考,對(duì)監(jiān)管羊奶及奶粉質(zhì)量安全具有一定技術(shù)支撐作用。

圖3 空白羊奶基質(zhì)中添加5.0 μg/kg β-受體激動(dòng)劑類藥物色譜圖Fig.3 The chromatograms obtained from blank goat milk spiked with 5.0 μg/kg of β-agonists

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Simultaneousdeterminationoftwenty-sevenβ-agonistsresiduesingoatmilkandpowderusingultraperformanceliquidchromatographytandemmassspectrometry

LIUHong-bin1,LIYing1,YAOXi-mei2,YULei1,CAIYing-hua1,*

(1.China Animal Disease Control Center,Beijing 102609,China;2.China Association for Standardization,Beijing 100048,China)

A multiresidue method based on ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry has been developed for the determination of twenty-sevenβ-agonists(pyrbuterol,procaterol,reproterol,clenproperol,olodaterol. et al)residues in goat milk and powder. In this method,analytes were extracted by acidified acetonitrile,and purified by Oasis PRiME HLB SPE column. twenty-sevenβ-agonists were analyzed by Acquity UPLC BEH C18column(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)using methanol and 0.1% formic acid as the mobile phases. The signals are acquired through the multi-channel MRM mode. All analytes could be well-separated by a gradient program during 10.5 minutes. The calibration curves of twenty-sevenβ-agonists were linear in a concentration range of 1.0～100.0 μg/L(r>0.993),and the limits of quantitation were all less than 0.5 μg/kg in goat milk. The recoveries of 0.5,2.5,5.0 μg/kg fortified samples ranged from 65.7%～119%,with the intra-assay coefficient of variation was 0.79%～10.4% and the inter-assay coefficient of variation was 2.13%～15.7%. The limits of quantitation were all less than 2.0 μg/kg in milk powder. The recoveries of 2.0,10.0,20.0 μg/kg fortified samples ranged from 60.5%～109%,with the intra-assay coefficient of variation was 1.91%～12.4% and the inter-assay coefficient of variation was 3.06%～17.2%. The method was established as a high-throughput method for confirmation ofβ-agonists residues in goat milk and powder.

goat milk;milk powder;β-agonists;residues;UPLC-MS/MS

2017-03-29

劉洪斌(1985-)，男，碩士，工程師，從事動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方面的研究，E-mail:liuhongbin111@163.com。

*通訊作者:蔡英華(1977-)，男，本科，工程師，從事動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方面的研究，E-mail:caiyh@163.com。

十二五國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2014BAD13B05)；獸藥殘留檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制(2013FY113300-1)。

TS207.3

A

1002-0306(2017)23-0214-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.040