高效液相色譜二極管陣列聯(lián)用技術(shù)同時(shí)檢測蘋果醋和甘蔗醋中11種酚類物質(zhì)

,, ,,陳趕

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與檢測技術(shù)研究所,廣西南寧 530007;2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,廣西南寧 530007;3.廣西大學(xué)，農(nóng)學(xué)院,廣西南寧 530007;4.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，甘蔗研究中心,廣西南寧 530007)

何潔1,勞水兵1,林波2,3,鄭鳳錦2,陳趕林4,*

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與檢測技術(shù)研究所,廣西南寧 530007;2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,廣西南寧 530007;3.廣西大學(xué)，農(nóng)學(xué)院,廣西南寧 530007;4.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，甘蔗研究中心,廣西南寧 530007)

利用高效液相色譜聯(lián)合二極管陣列技術(shù)(HPLC-DAD)建立一種可以同時(shí)檢測不同蘋果醋和甘蔗醋中11種酚類物質(zhì)的分析方法。使用OMNI Hubble C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相A為甲醇-甲酸(100∶2,v/v),B為10 mmol/L磷酸氫二鉀-磷酸水溶液(200∶1,v/v),流速為1.0 mL/min,進(jìn)樣量為20 μL,梯度洗脫,柱溫為35 ℃,二極管陣列掃描波長范圍210～400 nm。應(yīng)用本方法可以檢測出不同蘋果醋和甘蔗果醋中香草醛、香豆素、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、對(duì)香豆酸、芹菜素、木犀草素、肉桂酸、山奈酚、芒柄花黃素等11種酚類物質(zhì),其中甘蔗醋中富含綠原酸等10種酚類物質(zhì)成分。本方法回收率在84.1%～118.2%之間,結(jié)果準(zhǔn)確可靠,簡單易行,適合用于各類果醋中酚類物質(zhì)的分析檢測。

蘋果醋,甘蔗醋,酚類,高效液相色譜,二極管陣列

果醋是以水果、水果加工下腳料或濃縮水果汁(漿)為原料,經(jīng)微生物發(fā)酵技術(shù)制成的液體產(chǎn)品[1]。果醋飲料是果醋添加不同的輔料,經(jīng)加工制成的飲料。果醋中保留了水果原有的大多數(shù)營養(yǎng)物質(zhì)[2],含有人體需要的碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂類、維生素、礦物質(zhì)、氨基酸、有機(jī)酸和酚類物質(zhì)等[3]。果醋有緩解疲勞、促進(jìn)鈣吸收、預(yù)防高血壓、預(yù)防心臟病和降低血清總膽固醇水平等作用[4-5]。這些作用主要來源于有機(jī)酸、酚類物質(zhì)和醇類物質(zhì)的互相作用[6]。其中酚類物質(zhì)是植物次生代謝物[7],不僅具有各種生理活性功能[8],還影響著水果的風(fēng)味和質(zhì)量品質(zhì)[9]。

目前,市面上的果醋飲料以蘋果醋居多,它是以蘋果為原料,經(jīng)酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵釀制而成的一種營養(yǎng)豐富、風(fēng)味優(yōu)良的酸性保健調(diào)味品,具有蘋果的典型風(fēng)味與口感;風(fēng)味與營養(yǎng)均高于普通食醋,生產(chǎn)的醋酸飲料可直接飲用[10]。甘蔗醋是近年來研發(fā)的一類新型果醋產(chǎn)品,以新鮮糖料甘蔗為原料,經(jīng)壓榨、滅菌、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵、陳釀、調(diào)配等工藝加工而成的一類直接飲用醋飲料[11-12]。高效液相色譜法是常用檢測酚類物質(zhì)的方法[4-5,9],而二極管陣列聯(lián)合高效液相色譜可以進(jìn)行全波長掃描,得到三維光譜圖,更好地對(duì)復(fù)雜基質(zhì)進(jìn)行分析[13]。

本文以市面上不同品種蘋果醋和甘蔗醋這兩類果醋為研究對(duì)象,利用高效液相色譜-二極管陣列聯(lián)用技術(shù)同時(shí)檢測不同品種蘋果醋及新型甘蔗醋中的11種酚類物質(zhì),為果醋產(chǎn)品的品質(zhì)綜合評(píng)價(jià)、鑒別防偽及其它果醋食品開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘋果醋飲料:不同品牌蘋果醋飲料樣品A～F,購于超市。甘蔗醋飲料:廣西農(nóng)科院加工研究所研制,廣西石埠乳業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。酚類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):綠原酸(Chlorogenic acid,HPLC≥98%)、芹菜素(Apigenin,HPLC≥98%)、木犀草素(Luteolin,HPLC≥98%)、咖啡酸(Caffeic acid,HPLC≥98%)、肉桂酸(Cinnamic acid,HPLC≥98%)、香草醛(Vanillin)、對(duì)香豆酸(p-Coumaric acid,HPLC≥98%)、阿魏酸(Ferulic acid,HPLC≥98%)、山奈酚(Kaempferol,HPLC≥98%)、芒柄花黃素(Formononetin,HPLC≥98%)、香豆素(Coumarin,HPLC≥98%) 均購于北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司。磷酸氫二鉀、甲醇、乙腈、甲酸、磷酸等為分析純;超純水,自制。

Waters 2695液相色譜儀,配備OMNI BOND,Hubble C18色譜柱,(250 mm×4.6 mm,5 μm),Waters 2996二極管陣列檢測器,Waters 2489紫外檢測器 沃特世科技(上海)有限公司;GR-202 分析天平 日本A&D有限公司;CAHT-50L超純水器 北京中科智恒科技有限公司;GM-0.5A隔膜真空泵 天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;D3500S-DTH超聲波清洗器 必能信超生(上海)有限公司;F-33C pH計(jì) 北京中農(nóng)高科土壤肥料測試設(shè)備有限公司;VORTEX GENIUS 3渦旋振蕩器 德國IKA公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 分別稱取5.0 mg(精確至0.01 mg)各酚類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),以甲醇轉(zhuǎn)移并定容至10 mL,制得500 mg/L單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。移取500 mg/L單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液200 μL,以甲醇定容至1 mL,配成100 mg/L單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-18 ℃保存。分別移取500 mg/L單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL置于25 mL容量瓶中,以甲醇定容成20 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,于-18 ℃保存。使用時(shí)按需要逐級(jí)稀釋成0.10、0.40、2.00、10.00、20.00 mg/L的單標(biāo)準(zhǔn)工作液和混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品制備 果醋樣品經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后待測。

1.2.3 色譜條件 色譜柱:OMNI Hubble C18250 mm×4.6 mm,5 μm;柱溫:35 ℃;流動(dòng)相A:甲醇-甲酸(100∶2,v/v),流動(dòng)相B:10 mmol/L磷酸氫二鉀-磷酸溶液(200∶1,v/v),流速:1.0 mL/min;梯度洗脫程序見表1;進(jìn)樣量:20 μL。檢測器:采用2998二極管陣列檢測器(檢測波長:210～400 nm)。

表1 HPLC梯度洗脫程序Table 1 Gradient eluted program of HPLC

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Waters的Empower軟件及Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.4 方法檢出限

方法檢出限以進(jìn)樣最小濃度時(shí),儀器基線的10倍噪音所對(duì)應(yīng)的濃度來計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長

用二極管陣列掃描單標(biāo)準(zhǔn)工作液,得到11種酚類物質(zhì)的吸收波長譜圖。通過比對(duì)不同波長下各酚類物質(zhì)峰面積大小及不同波長下是否易于與周圍化合物分開,得到11種酚類物質(zhì)在紫外檢測器下的最佳檢測波長,見表2。

表2 11種酚類物質(zhì)保留時(shí)間和檢測波長Table 2 Retention time and detection wavelength of 11 phenolic compounds

圖1 酚類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖(310 nm)Fig.1 HPLC chromatogram of phenolic compounds standard(310 nm)注:1：綠原酸;2：咖啡酸;3：香草醛;4：對(duì)香豆酸;5：阿魏酸;6：香豆素;7：肉桂酸;8：木犀草素;9：山奈酚;10：芹菜素;11：芒柄花黃素。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別進(jìn)樣0.10、0.40、2.00、10.00、20.00 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作液測定峰面積,利用二極管陣列檢測器分析得到酚類物質(zhì)210～400 nm的三維譜圖。通過選取不同波長,得到不同波長下酚類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的色譜圖(圖1)。以混合標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),各酚類物質(zhì)最佳檢測波長下的峰面積為縱坐標(biāo)得到各酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。由各酚類物質(zhì)的回歸方程及相關(guān)系數(shù)(表3)可知,11種酚類物質(zhì)的峰面積與質(zhì)量濃度存在良好的線性關(guān)系。

2.3 方法檢出限

表3 11種酚類物質(zhì)回歸方程、最小檢出限和添加回收率Table 3 Regression equation,LOD,recoveries and R2 of 11 phenolic compounds

進(jìn)樣0.10 mg/L酚類物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,以基線10倍噪音所對(duì)應(yīng)的濃度計(jì)算,得到11種酚類物質(zhì)的方法檢出限,見表3。

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

分別制備5個(gè)平行果醋樣品,測量11種酚類物質(zhì)的含量,得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(表3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,果醋樣品11種酚酸物質(zhì)的測定重復(fù)性良好。

2.5 添加回收

取0.1 mL 1 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作液加入0.9 mL已知濃度的果醋基質(zhì),混勻得到0.1 mg/L加標(biāo)樣品溶液。取0.1 mL 1 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作液加入0.9 mL甲醇,混勻得到0.1 mg/L標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液。取0.1 mL甲醇加入0.9 mL果醋基質(zhì),混勻得到空白基質(zhì)溶液。檢測溶液酚類含量,求得果醋酚類HPLC檢測的添加回收率在84.1%～118.2%之間(表3)。

2.6 實(shí)際樣品測定

采用本方法對(duì)6種不同蘋果醋和甘蔗醋樣品進(jìn)行分析,得到不同波長下酚類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的色譜圖(圖2),分析得出各種果醋中11種酚類物質(zhì)的含量,見表4。

圖2 甘蔗醋色譜圖(310 nm)Fig.2 HPLC chromatogram of sugarcane vinegar(310 nm)注:1：綠原酸;2：咖啡酸;3：香草醛;4：對(duì)香豆酸;5：阿魏酸;6：香豆素;7：肉桂酸;8：木犀草素;9：山奈酚;10：芹菜素。

表4 果醋樣品中11種酚類物質(zhì)含量(mg/L)Table 4 Eleven phenolic compounds content of fruit vinegar samples(mg/L)

注:ND,未檢出。

超市購買的蘋果醋飲料在實(shí)驗(yàn)條件下檢出酚類物質(zhì)5種(綠原酸、咖啡酸、香草醛、對(duì)香豆酸、阿魏酸)。其中綠原酸、咖啡酸和對(duì)香豆酸在之前關(guān)于高濃度蘋果醋[5]、蘋果汁和蘋果渣[14]酚類物質(zhì)研究文獻(xiàn)中也有被定量檢測出。孫翔宇[9]等從蘋果醋中定量檢測出沒食子酸、香草酸、綠原酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、表兒茶素沒食子酸酯和根皮苷。本實(shí)驗(yàn)測得蘋果醋飲料中酚類物質(zhì)的種類較少,這可能與發(fā)酵用的蘋果原料來源和蘋果原醋調(diào)配用量有著顯著性差異,導(dǎo)致不同品類的蘋果醋飲料酚類物質(zhì)也存在著差異。

甘蔗醋飲料中酚類物質(zhì)種類最為豐富,共檢出酚類物質(zhì)10種,按含量從高到低為香草醛、香豆素、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、對(duì)香豆酸、芹菜素、木犀草素、肉桂酸和山奈酚,其中香草醛、香豆素、綠原酸、咖啡酸含量較高(>2.0 mg/L),芹菜素、木犀草素、肉桂酸和山奈酚含量較低(<0.1 mg/L)。其中綠原酸被認(rèn)為是蔗汁氧化褐變的重要原因[15]。芒柄花黃素存在于紅車軸草[16]、黃芪[17]等中藥中。本文首次對(duì)不同品種蘋果醋和甘蔗醋中的芒柄花黃素進(jìn)行檢測,結(jié)果蘋果醋飲料和甘蔗醋飲料中均未檢出。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以甲醇-甲酸(100∶2,v/v),10 mmol/L磷酸氫二鉀-磷酸溶液(200∶1,v/v)為流動(dòng)相,采用梯度洗脫方式,用HPLC-DAD法同時(shí)檢測果醋中11種酚類物質(zhì)的含量。11種酚類物質(zhì)綠原酸、咖啡酸、香草醛、對(duì)香豆酸、阿魏酸、香豆素、肉桂酸、木犀草素、山奈酚、芹菜素、芒柄花黃素分離效果好,回收率在84.1%～118.2%之間,結(jié)果準(zhǔn)確可靠,簡單易行,適合用于果醋中酚類物質(zhì)的分析。用此方法從蘋果醋飲料中同時(shí)檢測出5種酚類物質(zhì),甘蔗醋飲料中酚類物質(zhì)種類達(dá)10種之多。甘蔗醋中相關(guān)功能性的酚類物質(zhì)的生理活性有待下一步深入研究。

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Simultaneousdeterminationof11phenoliccompoundsinapplevinegarandsugarcanevinegarbyHPLC-DAD

HEJie1,LAOShui-bing1,LINBo2,3,ZHENGFeng-jin2,CHENGan-lin4,*

(1.Research Institute of Agro-products Quality Safety and Testing Technology,Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530007,China;2.Agro-food Science and Technology Research Institute,Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530007,China;3.College of agriculture,Guangxi University,Nanning 530007,China;4.Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Sugarcane Research Center,China Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530007,China)

A new method for simultaneous determination of 11 phenolic compounds in fruit vinegar,such as different kinds of apple vinegar and sugarcane vinegar,by high performance liquid chromatography-diode array detector(HPLC-DAD)was established in this study. The phenolic compounds were separated by OMNI BOND with Hubble C18column(250 mm×4.6 mm,5 μm)at 35 ℃. The mobile phase A was MeOH-HCOOH solution(100∶2,v/v)and the mobile phase B was 10 mmol/L K2HPO4-H3PO4(200∶1,v/v),eluted at a flow rate of 1.0 mL/min by a gradient elution program. The injection volume was 20 μL and the eluted components were monitored at 210～400 nm. Under the optimized condition,11 phenolic compounds in different kinds of apple vinegar and sugarcane vinegar were separated and simultaneous determined,including coumarin,vanillin,chlorogenic acid,caffeic acid,ferulic acid,p-coumaric acid,apigenin,luteolin,cinnamic acid,kaempferol and formononetin,in which 10 phenolic components were found and determined in sugarcane vinegar. The recovery of the above method was 84.1%～118.2%. The method is accurate,reliable,simple,feasible and suitable for determination of phenolic compounds in fruit vinegar.

apple vinegar;sugarcane vinegar;phenolic compounds;high performance liquid chromatography;diode array detector(DAD)

2017-03-10

何潔(1984-)，女，碩士，高級(jí)工程師，主要從事食品科學(xué)與產(chǎn)品質(zhì)量檢測工作，E-mail：herb312@126.com。

*通訊作者:陳趕林(1980-)，男，碩士，副研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工與綜合利用研究工作，E-mail：ganlin-chen@163.com。

國家星火計(jì)劃項(xiàng)目(2015GA790013)；廣西科技計(jì)劃項(xiàng)目(桂科AB16380244、桂科合14123001-10)；南寧市西鄉(xiāng)塘區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(201720103)；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)(桂農(nóng)科2015YZ02)；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技發(fā)展基金項(xiàng)目(桂農(nóng)科2017JM60)。

TS207.3

A

1002-0306(2017)23-0210-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.039