超聲提取食用玫瑰花總酚及其大孔樹脂純化前后抗氧化活性

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(1.昆明理工大學食品安全研究院,云南昆明 650500;2.昆明市農業科學研究院,云南昆明 650231)

超聲提取食用玫瑰花總酚及其大孔樹脂純化前后抗氧化活性

蔣孟君1,王藝2,任建青2,葉玉2,程桂廣1,趙天瑞1,曹建新1,*

(1.昆明理工大學食品安全研究院,云南昆明 650500;2.昆明市農業科學研究院,云南昆明 650231)

以昆明安寧八街食用玫瑰為原料,對其多酚提取工藝及純化前后抗氧化活性進行研究。結果表明,提取溫度是影響食用玫瑰多酚提取效果的主要因素;超聲提取的最佳條件為乙醇體積分數70%、提取溫度40 ℃、料液比1∶25 (g/mL)、提取3次，提取時間每次40 min,經實驗驗證此條件下總多酚含量為93.81 mg/g;通過9種樹脂靜態吸附及解析性能比較,確定XAD-7型樹脂為多酚分離純化的理想樹脂;對比純化前后玫瑰花多酚對DPPH自由基、ABTS自由基的氧化能力,純化前對DPPH自由基和ABTS自由基清除能力IC50值分別為209.27、505.67 μg/mL;純化后分別為96.30、378.09 μg/mL;結果表明玫瑰花多酚經XAD-7型大孔樹脂純化后能提高其抗氧化活性。

食用玫瑰花,多酚,提取工藝,大孔樹脂純化,抗氧化活性

薔薇科植物玫瑰(RosarugosaThunb)是一種具有較高食用價值和經濟價值的藥用植物[1],其成分十分豐富,約有300多種,含有多酚、可溶性糖、有機酸、黃酮類等小分子活性物質[2]。其中多酚類化學成分具有清除自由基、抗炎、抑菌、降血脂和預防心臟病等生理活性[3]。隨著天然產物開發的不斷深入,植物多酚已成為最具潛在開發價值的天然抗氧化劑來源,其抗氧化活性的研究也備受關注[4-6]。

利用超聲產生的熱效應、機械作用使植物細胞內可溶性物質快速釋放、擴散并溶解進入溶劑中,同時可以較好地保持提取物的結構和活性,具有時間短、提取率高[7],消耗溶劑少、避免高溫對有效成分的破壞等特點,對酚類等熱敏性物質,超聲提取優勢尤為明顯[8]。大孔樹脂是一種常用有效的分離純化多酚物質的方法[9],這種技術因為成本低、選擇性好、效率高、毒性小等特點而具有很好的應用前景[10]。目前對玫瑰花的研究大多停留在玫瑰花精油[11]、黃酮[12]、多糖[13]、原花青素[14]的提取、生物活性等研究上,對可食用玫瑰花多酚經大孔吸附樹脂純化前后的抗氧化活性研究尚未見報道。

因此,本文以盛產于云南昆明安寧市八街鎮的食用玫瑰(Rosachinensis‘An Ning Ba Jie’)為原料,采用超聲提取法提取其中的多酚,運用正交實驗優化提取工藝,通過大孔樹脂作用于玫瑰花多酚類物質的靜態吸附-解析研究,篩選純化多酚的理想樹脂,并對純化前后玫瑰多酚的抗氧化活性進行研究,研究結果為有效開發利用食用玫瑰花多酚,發揮其最大經濟效益提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

食用玫瑰花 采自安寧市八街鎮,經冷凍干燥48 h,粉碎過40目篩后保存于-80 ℃冰箱備用;LSD-296、NKA-2、LSD-762、AB-8、HPD-TSD、XAD-7、HPD-100、XAD-16、NKA-9型大孔吸附樹脂 天津海光化工有限公司;DPPH、ABTS、TPTZ 美國Sigma公司;無水乙醇、甲醇 均為國產分析純;實驗用水 均為超純水。

ZD-F12真空冷凍干燥機 南京載智自動化設備有限公司;AL204型電子天平 梅特勒-托利多(上海)有限公司;SpectraMax M5 多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司;TDL-40B型離心機 上海安亭科學儀器廠;SCQ-數控加熱超聲波清洗機 上海聲彥超聲波儀器有限公司;UPHW-I-90T優普系列超純水機 成都超純科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 沒食子酸標準曲線的建立 參照Folin-Ciocalteu法[15],在波長765 nm處使用多功能酶標儀測定吸光值,以沒食子酸標準溶液濃度為橫坐標(X),對應的吸光值為縱坐標(Y),繪制標準曲線。

1.2.2 玫瑰花多酚的提取與測定 準確稱取玫瑰花粉末1.00 g于燒杯中,在各因素考察條件下提取玫瑰花多酚,于50 Hz超聲波清洗機中,重復提取三次。將提取液在5000 r/min的離心機中離心分離15 min后取上清液定容至50 mL,即為玫瑰花多酚提取液。然后按照繪制標準曲線步驟操作,測定樣品中的吸光值,按下式計算樣品:

式中:C:樣液中多酚的含量 μg/mL;V:樣液的體積 mL;W:玫瑰粉末質量 g;N:稀釋倍數。

1.2.3 玫瑰花多酚提取的單因素實驗

1.2.3.1 提取溶劑對多酚提取量的影響 在提取時間30 min,料液比1∶25 (g/mL),超聲溫度40 ℃條件下,考察不同溶劑乙醇、超純水、甲醇、丙酮對總多酚含量的影響。

1.2.3.2 乙醇濃度對多酚提取量的影響 在提取時間30 min,料液比1∶25 (g/mL),超聲溫度40 ℃條件下,考察乙醇濃度40%、50%、60%、70%、80%、90%對總多酚含量的影響。

1.2.3.3 提取次數對多酚提取量的影響 用70%乙醇在提取時間30 min,料液比1∶25 (g/mL),超聲溫度40 ℃條件下,分別考察提取次數1、2、3、4次對總多酚含量的影響。

1.2.3.4 料液比對多酚提取量的影響 在乙醇體積分數70%,超聲溫度40 ℃、時間30 min條件下,分別考察料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 (g/mL)對總多酚含量的影響。

1.2.3.5 提取溫度對多酚提取量的影響 在乙醇體積分數70%,超聲30 min,料液比1∶25 (g/mL)條件下,分別考察溫度30、35、40、45、50 ℃對總多酚含量的影響。

1.2.3.6 提取時間對多酚提取量的影響 在乙醇體積分數70%、料液比為1∶25 (g/mL)、超聲溫度40 ℃條件下,分別考察超聲10、20、30、40、50 min對總多酚含量的影響。

1.2.4 正交實驗 在單因素實驗的基礎上,選取提取次數、料液比、溫度、提取時間為影響因素,選用正交表L9(34)進行實驗,正交實驗因素與水平見表1。

表1 正交實驗因素與水平Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.5 大孔樹脂對多酚的純化工藝

1.2.5.1 大孔吸附樹脂預處理 取9種不同型號的適量大孔樹脂用95%乙醇浸泡24 h,待其充分溶脹后,用70%乙醇反復淋洗,至加超純水不渾濁后。用超純水沖洗至無乙醇味,將樹脂過濾,備用[16]。

1.2.5.2 樹脂的篩選 參照文獻[17]的方法,略有改動。分別稱取不同型號濾干樹脂2.00 g置于30 mL錐形瓶中,分別加入20 mL多酚粗提液,置于120 r/min搖床,靜態吸附24 h,取上清液測定多酚含量,計算吸附率。取吸附飽和的樹脂,吸干其表面水分,加入70%乙醇溶液20 mL,靜態解析24 h,取上清液測定多酚含量,計算解析率。吸附率和解析率計算公式如下[18]:

式中:C0:提取液中玫瑰多酚的初始濃度(mg/g);C1:吸附平衡時多酚濃度(mg/g);C2:解析后乙醇洗脫液中的多酚濃度(mg/g);V1:上樣前體積(mL);V2:解析后體積(mL)。

1.2.5.3 吸附動力學實驗 取2.00 g濾干樹脂于20 mL玫瑰多酚提取液中,避光振蕩吸附(25 ℃、120 r/min),每1 h取溶液,測其多酚含量,計算吸附量。以時間為橫坐標,吸附量為縱坐標繪制吸附動力學曲線。吸附量公式如下:

式中:C0:提取液中玫瑰多酚的初始濃度(mg/g);C1:吸附平衡時多酚濃度(mg/g);V1:上樣前體積(mL)。

1.2.6 玫瑰多酚純化前后抗氧化實驗

1.2.6.1 DPPH自由基清除實驗 參照文獻[19]的方法,略作改動。精確吸取0.4 mL不同濃度待測樣品,于5 mL離心管中,加入2.0 mL 0.1 mmol/L DPPH·反應液,混勻,避光反應30 min,在波長為517 nm處測吸光值,以無水乙醇做試劑空白,測定空白樣吸光值。玫瑰花多酚對DPPH自由基清除率按下式計算:

式中:A0:0.4 mL 無水乙醇+2.0 mL DPPH·溶液;A1:0.4 mL 樣品+2.0 mL 無水乙醇;A2:0.4 mL 樣品+2.0 mL DPPH·溶液。

1.2.6.2 ABTS自由基清除實驗 參照文獻[20]的方法,略做改動。取0.5 mL不同濃度的樣品與4.0 mL ABTS+工作液混勻,30 ℃水浴6 min,在波長734 nm處測吸光值,以無水乙醇做試劑空白,測定空白樣吸光值。ABTS自由基清除率按下式計算:

式中:A0:0.5 mL超純水+4.0 mL ABTS+·工作液;A1:0.5 mL樣品+4.0 mL乙醇;A2:0.5 mL樣品+4.0 mL ABTS+·工作液。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 標準曲線

以沒食子酸標準溶液濃度為橫坐標(X),對應的吸光值為縱坐標(Y),繪制標準曲線,得回歸方程為Y=56.438X+0.054,R2=0.9985。

2.2 單因素實驗

2.2.1 提取溶劑對多酚提取量的影響 由圖1可知,不同溶劑對玫瑰花多酚含量有影響,用乙醇或甲醇提取玫瑰花多酚含量與用水或丙酮提取的含量差異顯著(p<0.05)。提取溶劑為乙醇時,玫瑰多酚的提取率最高,其次是甲醇,從實際生產考慮乙醇毒性較小,廉價,故選取乙醇作為提取溶劑。

圖1 溶劑種類對玫瑰花總多酚含量的影響Fig.1 Effect of solvent type on total polyphenol content from rose注:小寫字母不同表示總多酚含量差異顯著(p<0.05),圖2～圖6同。

2.2.2 乙醇濃度對多酚提取量的影響 由圖2可知,隨乙醇體積分數的升高,多酚含量先增加后趨于平緩,這可能由于乙醇濃度低時,無法破壞樣品中多酚類物質與蛋白、多糖或其他物質的連接,多酚得率低;隨著乙醇濃度的增加,多酚類物質在乙醇溶液中的溶解度增加,但是乙醇體積分數過高時,脂溶性成分浸出較多,不利于多酚類物質的提取[21]。再結合統計學分析,乙醇濃度從70%往上增加,多酚提取量差異不顯著,故選擇70%乙醇作為提取劑。

圖2 乙醇濃度對玫瑰花總多酚含量的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on total polyphenol content from rose

2.2.3 提取次數對多酚提取量的影響 由圖3可知,隨著提取次數的增加,玫瑰多酚的提取率逐漸增加,多酚含量經1、2、3次提取有顯著差異(p<0.05),但提取4次與提取3次差異不顯著(p>0.05)。從節省時間、溶劑、能源方面考慮,選取2次提取為正交實驗的提取次數中心值。

圖3 提取次數對玫瑰花總多酚含量的影響Fig.3 Effect of extraction times on total polyphenol content from rose

2.2.4 料液比對多酚提取量的影響 由圖4可知,玫瑰花多酚含量隨料液比降低而升高。料液比為1∶15 (g/mL)時,總酚含量為59.13 mg/g;當料液比達到1∶30 (g/mL)時,總酚含量為79.80 mg/g,顯著高于料液比1∶15 (g/mL)(p<0.05);此后再降低料液比,總酚含量增加不顯著(p>0.05),且料液比過小會為后續的濃縮操作帶來不便,故選取1∶30 (g/mL)為正交實驗的料液比中心值。

圖4 料液比對玫瑰花總多酚含量的影響Fig.4 Effect of solid-to-liquid ratio on total polyphenol content from rose

2.2.5 提取溫度對多酚提取量的影響 由圖5可知,在30～45 ℃之間時,隨著提取溫度的升高,多酚含量逐漸增加,差異顯著(p<0.05),這是因為增加溫度可加快溶質中多酚的擴散速率,酚類物質更容易從原料中提取出來[19]。在45 ℃以后,多酚含量降低,無顯著差異,這可能是由于溫度過高,熱不穩定性、揮發性成分易被破壞、揮發,使得提取量降低。故選取45 ℃為正交實驗的提取溫度中心值。

圖5 溫度對玫瑰花總多酚含量的影響Fig.5 Effect of temperature on total polyphenol content from rose

圖6 提取時間對玫瑰花總多酚含量的影響Fig.6 Effect of extraction time on total polyphenol content from rose

2.2.6 提取時間對多酚提取量的影響 由圖6可知,當提取時間為10～30 min,總酚含量隨時間延長而提高,差異極顯著(p<0.01),此后再延長提取時間,總酚含量有所減少,差異顯著(p<0.05),這可能是玫瑰中的其他醇溶性成分溶出,多酚可能會分解掉。故選取30 min為正交實驗的提取時間中心值。

2.3 玫瑰多酚提取工藝的正交實驗結果與分析

在單因素分析的基礎上,提取次數、料液比、溫度、時間4個因素,選用正交表L9(34)進行正交實驗,實驗結果如表2所示。

表2 正交實驗設計及結果Table 2 Results of the orthogonal experiment

由表2可知,經過均值和極差分析與比較,在選定范圍內,玫瑰花總多酚提取影響因素的主次關系分別為C(溫度)>D(時間)>A(次數)>B(料液比)。最優因素組合為C1D3A3B1,即溫度40 ℃、提取時間40 min、提取3次、料液比1∶25 (g/mL)時為最佳提取條件。進一步由表3的方差分析結果可知,溫度對玫瑰花總多酚含量有顯著性影響,而時間、提取次數和料液比對該過程無顯著性影響。

表3 正交實驗方差分析表Table 3 Variance analysis of the orthogonal experiment

注:F0.01(2,8)=19.37,F0.05(2,8)=9.37;當F>F0.05時,差異顯著,用*表示。

2.4 驗證實驗

因最佳因素組合為C1D3A3B1,不在正交表中,所以需要對最佳因素進行驗證實驗,即精確稱取玫瑰花粉末1.00 g,以1∶25 (g/mL)的料液比加入70%乙醇、40 ℃條件下超聲提取3次,每次40 min,得到玫瑰花多酚的含量為92.38、95.42、93.63 mg/g,平均多酚含量為93.81 mg/g,RSD值為1.53 mg/g,可以看出該工藝比較穩定,可達到優化的目的,結果與文獻[22]報道的接近。

2.5 純化工藝

大孔吸附樹脂被廣泛用于多酚類物質的分離與富集[23],但其吸附性能及其解析、純化條件參數因所分離物質的理化性質不同而不同[24]。由圖7可知,通過9種樹脂靜態吸附及解析性能比較,XAD-7和XAD-16型樹脂對玫瑰多酚均具有較高的吸附率和解析率,且無顯著差異。還需通過吸附動力學實驗,進一步篩選理想的樹脂。

圖7 大孔樹脂的吸附及解析性能Fig.7 Macroporous resin adsorption and analytical properties注:大寫字母不同表示吸附率差異顯著(p<0.05);小寫字母不同表示解析率差異顯著(p<0.05)。

由圖8可知,XAD-16型樹脂在起始階段吸附量較小,在8 h達到吸附平衡;XAD-7型樹脂在1～7 h內,隨著時間增加,樹脂對玫瑰多酚的吸附量逐漸增大,差異顯著(p<0.05),在5 h達到吸附平衡,無顯著差異。綜上,對比XAD-7和XAD-16型樹脂的吸附量性能,選擇XAD-7型樹脂對玫瑰花多酚進行純化。

圖8 大孔樹脂靜態吸附動力學曲線Fig.8 Static adsorption kinetics curve of macroporous resin

2.6 純化前后玫瑰花多酚抗氧化活性的測定

2.6.1 純化前后玫瑰花多酚對DPPH自由基的清除效果 DPPH自由基是一種穩定的自由基,能接受電子或氫自由基,形成穩定的反磁性分子,抗氧化劑對DPPH自由基的清除原理,是基于它的供氫能力[25]。由圖9可知,隨著多酚濃度的增加,其DPPH自由基清除率不斷升高,差異顯著(p<0.05)。在相同濃度下,純化后多酚較純化前對DPPH自由基的清除能力強。純化前后玫瑰花多酚對DPPH自由基清除能力IC50值分別為209.27 μg/mL和96.30 μg/mL,說明經XAD-7大孔樹脂純化后的玫瑰花多酚對DPPH自由基的清除能力強于粗多酚,這可能是因為經XAD-7大孔樹脂處理后玫瑰花多酚得到純化和富集[22]。

圖9 多酚純化前后對DPPH自由基的清除效果Fig.9 Removal of DPPH free radicals before and after polyphenol purification

2.6.2 純化前后玫瑰花多酚對ABTS+自由基的清除效果 藍綠色的ABTS+自由基穩定性高,當存在具有供氫能力的抗氧化劑時,可使其還原成無色的ABTS,根據ABTS+自由基溶液前后吸光度的變化可測定樣品的抗氧化能力[26]。由圖10可知,隨著多酚濃度的增加,其ABTS+自由基清除率不斷升高,差異顯著(p<0.05)。在相同濃度下,純化后多酚對ABTS+自由基的清除能力均強于粗多酚,與DPPH自由基的清除結果一致。純化前后玫瑰花多酚對ABTS自由基清除能力IC50值分別為505.67 μg/mL和378.09 μg/mL,說明純化后的玫瑰花多酚具有較強的清除ABTS自由基的能力。

圖10 多酚純化前后對ABTS+自由基的清除效果Fig.10 Removal of ABTS+ free radicals before and after polyphenol purification

3 結論

通過單因素實驗和正交實驗,確定提取玫瑰花總酚的最佳工藝條件為:70%乙醇超聲提取,提取時間40 min,提取3次,料液比1∶25 (g/mL),溫度40 ℃,在此條件下總酚含量為93.81 mg/g。利用XAD-7型樹脂對玫瑰花總酚進行分離純化,再對純化前后多酚提取液進行抗氧化實驗。結果表明:純化前對DPPH自由基和ABTS自由基清除能力IC50值分別為209.27 μg/mL和505.67 μg/mL;純化后分別為96.30 μg/mL和378.09 μg/mL,說明超聲提取的玫瑰花多酚經XAD-7型大孔樹脂處理后,對DPPH、ABTS自由基清除能力均有所提高。這將為可食用玫瑰花在食品、保健品行業的深入開發提供基礎數據。

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Studyonultrasonicextractionoftotalphenolfromedibleroseandantioxidantactivityofmacroporousresinbeforeandafterpurification

JIANGMeng-jun1,WANGYi2,RENJian-qing2,YEYu2,CHENGGui-guang1,ZHAOTian-rui1,CAOJian-xin1,*

(1.Yunnan Institute of Food Safety,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China;2.Kunming Academy of Agricultural Sciences,Kunming 650231,China)

Rosachinensis‘An Ning Ba Jie’ as the raw material,the extraction process of polyphenol and the antioxidant activity before and after purification were studied. The extraction temperature were identified as main factor that influence extraction efficiency. The optimum conditions for the ultrasonic extraction of polyphenols from rose were found to be with 70% ethanol at solid-to-liquid ratio 1∶25 (g/mL)for 40 min with ultrasonic temperature 40 ℃with extraction three times. Under these conditions,the extraction of total phenol was 93.81 mg/g. The XAD-7 resin was found to be the ideal resin for the purification of phenolics from rose by comparing the static adsorption and analytical properties of nine resins. Before purification of DPPH and ABTS free radical scavengingIC50values were 209.27 μg/mL and 505.67 μg/mL,after purification,they were 96.30 μg/mL and 378.09 μg/mL,respectively. The results showed that rose polyphenols could enhance their antioxidant activity after purification by XAD-7 macroporous resin.

edible rose;polyphenols;extraction technology;macroporous resin purification;antioxidative activity

2017-06-03

蔣孟君(1994-)，女，碩士研究生，研究方向：天然藥物化學，E-mail:jiangmj0327@163.com。

*通訊作者:曹建新(1969-)，女，博士，教授，研究方向：天然藥物化學，E-mail:jxcao321@hotmail.com。

國家自然科學基金( 31600274，31460083)；昆明安寧八街食用玫瑰成分分析(KKF0201562034)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)23-0164-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.031