杏仁及杏仁皮多酚超聲提取優化及抗氧化能力差異性研究

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(鄭州輕工業學院食品與生物工程學院,河南鄭州 450002)

杏仁及杏仁皮多酚超聲提取優化及抗氧化能力差異性研究

劉夢培,鐵珊珊,張麗華,王小媛,唐銀華,縱偉*

(鄭州輕工業學院食品與生物工程學院,河南鄭州 450002)

為獲得杏仁及杏仁皮內多酚提取的最優方案，采用超聲波處理樣品，以料液比、超聲溫度、功率和時間為影響因素多酚得率為指標進行研究。結果表明：杏仁多酚超聲提取最佳條件為料液比1∶10、超聲溫度50 ℃、超聲功率400 W,超聲時間60 min。而杏仁皮多酚超聲提取最佳條件為料液比1∶10、超聲溫度60 ℃、超聲功率400 W,超聲時間60 min。采用還原力、OH、DPPH和ABTS自由基清除率四個抗氧化能力指標對杏仁及杏仁皮多酚的抗氧化能力進行差異性分析,以期為杏仁多酚這一功能性成分的開發提供參考依據。研究結果表明,杏仁多酚抗氧化能力大小與其含量成正比。甜杏仁多酚的還原力、OH和ABTS自由基清除率均高于苦杏仁多酚,而甜苦杏仁多酚的DPPH自由基清除率接近一致,且在0.024 mg/mL濃度時依次為25.4%和23.7%。甜苦杏仁皮多酚抗氧化能力差異不明顯,其還原力、DPPH和ABTS自由基清除率三者基本一致,而在0.24 mg/mL濃度時,甜杏仁皮多酚的OH自由基清除率約為苦杏仁皮的2倍。總體來說,甜杏仁多酚的抗氧化能力優于苦杏仁多酚,潛在利用價值更高。

杏仁,杏仁皮,多酚,抗氧化能力

仁用杏是以杏仁為主要產品的薔薇科杏屬植物,有甜苦之分。杏仁營養價值豐富,其蛋白質含量豐富,總蛋白高達35%,油脂的不飽和脂肪酸含量高達95%左右,其中油酸的含量與橄欖油相近,達70%以上[1-2];另外,它富含約6.1%苦杏仁甙,在抗癌方面具有顯著的藥用價值[3]。近年來,氧化與抗氧化,衰老與抗衰老已成為食品科學、營養科學研究的熱點。活性氧自由基攻擊生命大分子,導致蛋白質損傷、酶失活、膜脂過氧化、碳水化合物和核酸損傷,從而引起機體衰老或病理性疾病。流行病學的研究表明,食用富含抗氧化成分的水果和蔬菜可以有效降低這些慢性疾病發生的概率。果蔬多酚的含量與抗氧化能力之間存在顯著的相關性[4-6]。天然酚類化合物是植物體內最豐富的次生代謝產物。植物多酚具有抗氧化、抗衰老、降血脂、抑菌和調節免疫功能等多種生理和藥理活性,被廣泛應用于食品、醫藥和化妝品等領域[7-10]。仁用杏作為我國重要的木本糧油樹種,其杏仁的抗氧化能力主要來自于多酚。

目前，我國仁用杏產業還處于粗放階段，針對杏仁的研究主要集中在杏仁產品的開發和工藝方面，而對杏仁的生物活性功能，尤其是抗氧化作用進行深入的研究不多，已開展的研究僅僅局限在杏仁油多酚、杏仁皮黃酮方面[11-12]。例如，黃麗華等通過超聲輔助提取三種杏仁中的黃銅，發現其都具有較強的抗氧化性能[13]；王妙飛等研究發現采用超聲波輔助提取馬尾松松塔中的多酚，乙醇濃度為65%，超聲時間30 min，超聲功率40 W條件下多酚得率最高[7]。因此，本文采用超聲提取杏仁及杏仁皮中的多酚。另外，針對甜苦杏仁之間的差異性研究開展較少。

本研究以杏仁和杏仁皮資源為研究材料,一方面優化多酚超聲提取的最佳工藝,另一方面比較甜苦杏仁多酚抗氧化能力差異性,以期為杏仁多酚這一天然的抗氧化劑的深入利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

甜杏仁主栽品種‘龍王帽’和苦杏仁主栽品種‘山杏’ 中國林科院仁用杏種質資源圃;1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH)、2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulph-onic acid)acid diammonium salt(ABTS)、沒食子酸(標準品) Sigma公司;葡萄糖、維生素C(VC)、硫酸、正丁醇、氯仿、磷酸鈉、鉬酸銨、無水乙醇 北京化工廠;以上試劑 均為分析純。

KQ-100型超聲儀 昆山市超聲儀器有限公司;EV 311旋轉蒸發儀 北京萊伯泰科儀器公司;OptimaL-80 XP離心機 貝克曼庫爾特商貿(中國)有限公司;UV-120-02紫外分光光度計 日本Shimadzu公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 甜杏仁及杏仁皮超聲提取工藝優化 本研究選擇超聲提取多酚。以甜杏仁及杏仁皮為研究材料,以70%的無水乙醇為提取溶劑,將干燥的杏仁/杏仁皮粉碎過80目篩,稱取5.00 g,采用L9(34)正交實驗設計進行超聲提取(表1),優化的四因素依次為料液比(X1)、超聲溫度(X2)、超聲功率(X3)和超聲時間(X4),以多酚得率為評價指標,尋找最佳提取工藝。3次平行重復實驗(苦杏仁及杏仁皮多酚的提取采取甜杏仁超聲優化的最佳條件)。

多酚得率(mg/g)=(V×C)/m

式中:m：稱取的樣品質量(g);V：樣品多酚提取液的體積(mL);C：樣品中的多酚含量(mg/mL)。

表1 因素水平表Table 1 Factor and levels table

測定總酚的方法見參考文獻[13-14]。以沒食子酸為標準品,繪制標準曲線。總酚的標準曲線為:吸光度值x與沒食子酸標準溶液濃度(y,mg/mL)之間的回歸方程為:y=0.786x+0.008,(R2=0.9995)。

1.2.2 杏仁及杏仁皮多酚抗氧化能力評價

1.2.2.1 還原力的測定 主要參考李順峰的方法[15]。取樣品溶液1 mL,加入pH=6.6,0.2 mol/L磷酸緩沖液2.5 mL,1%鐵氰化鉀2.5 mL,50 ℃保溫20 min,急劇冷卻加入10%三氯乙酸2.5 mL,3000 r/min離心10 min,取上清液2.5 mL,加入2.5 mL去離子水,再加入0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL,反應30 min,700 nm下測吸光度。

1.2.2.2 OH自由基清除率的測定 主要參考Li的方法[16]。取樣品溶液0.5 mL,依次加6 mmol/L的FeSO4和6 mmol/L水楊酸-乙醇各1 mL。混勻后靜止10 min,加入8.8 mmol/L H2O20.5 mL啟動反應,避光靜置0.5 h,510 nm下測吸光度。

OH清除率(%)=1-(A1-A2)/A0×100

式中:A1:樣品的吸光度,A2:以蒸餾水代替H2O2作樣品本底吸收度,A0以蒸餾水為對照。

1.2.2.3 DPPH自由基清除能力的測定 主要參考Suttirak的方法[17]。取2 mL樣品,加入2 mL DPPH(2×10-4mol/L)溶液混合均勻,黑暗處反應30 min,以無水乙醇調零,測定517 nm處吸光值。

DPPH自由基清除率(%)=1-(A1-A2)/A3×100

式中:A1:樣品的吸光度,A2:以乙醇代替DPPH吸光度為空白,A3:以乙醇代替樣品為對照。

1.2.2.4 ABTS自由基清除能力的測定 主要參考Miller的方法[18]。ABTS自由基的制備:固體的ABTS溶解于水中配成7 mmol/L溶液,將7 mmol/L的ABTS溶液與2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液混合(1∶0.5),置室溫黑暗條件下放置12～16 h后備用。使用前用無水乙醇稀釋至吸光值在734 nm處為0.70+0.02。測量:100 μL樣品提取液加到3 mL ABTS自由基溶液中避光反應6 min后,在734 nm處測定吸光值。

ABTS自由基清除率(%)=1-(Ax-Ax0)/A0×100

式中:Ax:加入樣品后溶液吸光度,Ax0:樣品溶液本底吸光度,A0:空白。

表3 杏仁多酚提取的方差分析Table 3 ANOVA for the extraction of kernel polyphenol

注:**表示極顯著(p<0.01)；表5同。

1.2.3 數據分析 利用SPSS 22.0軟件對杏仁/杏仁皮多酚提取條件進行極差分析、方差分析(ANOVA)和多重比較;利用Origin Pro 8.5軟件進行杏仁/杏仁皮多酚抗氧化能力作圖分析。

2 結果與分析

2.1 甜杏仁及杏仁皮超聲提取條件篩選

2.1.1 甜杏仁超聲提取最佳條件 通過極差分析發現(表2),對杏仁多酚提取得率影響因素大小依次為:超聲溫度(X2)>料液比(X1)>超聲功率(X3)=超聲時間(X4)。杏仁多酚超聲提取的最優條件為料液比1∶10、超聲溫度50 ℃、超聲功率400 W,超聲時間60 min,此時多酚得率0.0297 mg/g。而方差分析的結果顯示(表3),四個因素間,料液比、超聲溫度、超聲功率和超聲時間各自對多酚含量均產生了極顯著差異。

表2 杏仁多酚提取的正交實驗結果Table 2 Orthogonal test result of the extraction of kernel polyphenol

2.1.2 甜杏仁皮超聲提取最佳條件 杏仁皮多酚提取條件優化結果見表4和表5。通過極差分析發現,對杏仁皮多酚提取得率影響因素大小依次為:料液比(X1)>超聲功率>(X3)>超聲溫度(X2)>超聲時間(X4)。杏仁皮多酚超聲提取的最優條件為料液比1∶10、超聲溫度60 ℃、超聲功率400 W,超聲時間60 min,此時多酚得率0.1498 mg/g。而方差分析結果顯示,四個因素間,超聲溫度、超聲功率和超聲時間對多酚得率差異均不顯著,僅料液比之間的三個水平1∶20、1∶15和1∶10之間對多酚得率存在極顯著差異。

表4 杏仁皮多酚提取的正交實驗結果Table 4 Orthogonal test result of the extraction of kernel seedcase polyphenol

2.2 抗氧化能力差異性分析

2.2.1 杏仁多酚抗氧化能力差異性分析 杏仁多酚的抗氧化能力見圖1。甜苦杏仁多酚的四個抗氧化能力指標均隨著多酚濃度的增大而增高。還原力的測定表明,在0～0.024 mg/mL的較低濃度范圍,還原能力很弱,而甜杏仁多酚的還原力較高于苦杏仁多酚。在0.024 mg/mL濃度時,甜苦杏仁多酚的還原力分別為0.079和0.044。在0～0.016 mg/mL的濃度范圍內,甜杏仁多酚的還原能力甚至高于VC,而在0.016～0.024 mg/mL濃度范圍內,甜杏仁多酚的還原能力遠低于VC。

表5 杏仁皮多酚提取的方差分析Table 5 ANOVA for the extraction of kernel seedcase polyphenol

圖1 杏仁多酚的抗氧化能力差異性比較Fig.1 Different of antioxidant activity of kernel polyphenol 注:A:還原力;B:OH自由基清除率;C:DPPH自由基清除率;D：ABTS自由基清除率；圖2同。

OH自由基清除率的測定表明在0～0.024 mg/mL的較低濃度范圍,甜杏仁的OH自由基清除率高于苦杏仁,且均高于VC。在0.024 mg/mL濃度時,甜苦杏仁多酚的OH自由基清除率分別為85.3%和55.4%。

DPPH自由基清除率的測定顯示在0～0.024 mg/mL的較低濃度范圍,甜苦杏仁多酚DPPH自由基清除率基本一致,在0～0.02 mg/mL濃度時,兩者的DPPH自由基清除率均高于VC,但在0.02～0.024 mg/mL濃度時,出現了低于VC的情況。在0.024 mg/mL濃度時,甜苦杏仁多酚的DPPH自由基清除率分別為25.4%和23.7%。

ABTS自由基清除率的測定顯示在0～0.024 mg/mL的較低濃度范圍,甜杏仁多酚ABTS自由基清除率略高于苦杏仁多酚,且均高于VC。在0.024 mg/mL濃度時,甜苦杏仁多酚的ABTS自由基清除率分別為20.7%和19.3%。

2.2.2 杏仁皮多酚抗氧化能力差異性分析 杏仁皮多酚的抗氧化能力見圖2。杏仁皮多酚的四個抗氧化能力指標均隨著多酚濃度的增大而增高。還原力的測定表明,在0～0.24 mg/mL的濃度范圍,甜苦杏仁多酚的還原力與甜苦杏仁皮多酚的還原力基本一致,且甜苦杏仁皮多酚的還原力低于VC。在0.24 mg/mL濃度時,甜苦杏仁皮多酚的還原力分別為0.859和0.882。

圖2 杏仁皮多酚的抗氧化能力差異比較Fig.2 Different of antioxidant activity of kernel seedcase polyphenol

OH自由基清除率的測定表明,在0～0.24 mg/mL的濃度范圍,甜杏仁皮多酚的OH自由基清除率高于苦杏仁皮多酚,兩者均高于VC。在0.24 mg/mL濃度時,甜苦杏仁皮多酚的OH自由基清除率分別為74.5%和35.9%,甜杏仁皮多酚的OH自由基清除率約苦杏仁皮多酚的2倍。

DPPH自由基清除率的測定顯示,在0～0.24 mg/mL的濃度范圍,甜苦杏仁皮多酚DPPH自由基清除率基本一致,兩者均低于VC。在0.24 mg/mL濃度時,甜苦杏仁皮多酚的DPPH自由基清除率分別為92.8%和92.5%。

ABTS自由基清除率的測定顯示,在0～0.24 mg/mL的濃度范圍,甜杏仁多酚皮ABTS自由基清除率基本一致,在0～0.20 mg/mL的濃度范圍高于VC,在0.20～0.24 mg/mL的濃度時,與VC基本一致。在0.24 mg/mL濃度時,甜苦杏仁多酚的ABTS自由基清除率分別為99.5%和99.4%。

3 結論

超聲是目前提取多酚最常用的方法之一[19-20]。杏仁和杏仁皮多酚超聲提取優化條件表明,杏仁多酚超聲提取條件為料液比1∶10、超聲溫度50 ℃、超聲功率400 W,超聲時間60 min。而杏仁皮多酚超聲提取條件為料液比1∶10、超聲溫度60 ℃、超聲功率400 W,超聲時間60 min。兩者差異僅存在超聲溫度上,料液比、超聲功率和超聲時間均一致。

抗氧化能力的測定由于反應特性和機制的差異,通常使用兩種及兩種以上方法[21]。本研究選取了還原力、OH、DPPH和ABTS自由基清除率四個指標進行分析。研究發現,杏仁多酚抗氧化能力差異較大。甜杏仁多酚的還原力、OH自由基清除率和ABTS自由基清除均高于苦杏仁多酚,均顯示較低的水平。DPPH自由基清除率兩者接近一致。甜苦杏仁皮多酚抗氧化能力差異不明顯,兩者在還原力、DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率三者間基本一致,而OH自由基清除率,甜杏仁皮高于苦杏仁皮,約2倍左右,依次為74.5%和35.9%。本文的研究結果與王艷等[11]對杏仁油的多酚抗氧化能力的研究較為一致。總體來說,杏仁皮含有較為豐富的多酚,具有較強的抗氧化活性,實驗不僅為杏仁皮的開發利用提供了參考,同時也表明杏仁皮是一種有前途的天然抗氧化劑新資源,值得進一步深入研究。

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Researchonultrasonicextractionoptimizationandantioxidantcapacitydifferenceofkernelandkernelseedcasepolyphenols

LIUMeng-pei,TIEShan-shan,ZHANGLi-hua,WANGXiao-yuan,TANGYin-hua,ZONGWei*

(School of Food and Engineering,Zhengzhou University of Light Industry,Zhengzhou 450002,China)

In order to get the optimal solution to extract polyphenols from kernel and kernel seedcase,the ultrasonic apparatus was applied to treat sample,the independent variable were the ratio of raw material to water,ultrasonic temperature,ultrasonic power and time,the responses was content of kernel and kernel seedcase polyphenols. The orthogonal test analysis showed that the optimal ultrasonic conditions of kernel polyphenol determined were as: ratio of raw material to water 1∶ 10,ultrasonic temperature 50 ℃,ultrasonic power 400 W and ultrasonic time 60 min,and The optimal ultrasonic conditions of kernel seedcase polyphenol was ratio of raw material to water 1∶10,ultrasonic temperature 60 ℃,ultrasonic power 400 W and ultrasonic time 60 min. It also analyzed the antioxidant ability differences of kernel and kernel seedcase polyphenols using reducing power assay,OH,DPPH,ABTS radical-scavenging rate in order to provide a reference for the development of kernel polyphenol functional ingredients. The results showed that the antioxidant capacity of kernel polyphenol was positively related to polyphenol content. The sweet kernel polyphenol was higher than bitter kernel in reducing power assay and OH,ABTS radical-scavenging rate,and basically the same in DPPH radical-scavenging rate,25.4% and 23.7% in turn at 0.024 mg/mL of sweet and bitter kernel polyphenol. The antioxidant capacity of kernel seeacase polyphenol was not obvious,basically consistent in reducing power assay and DPPH,ABTS radical-scavenging rate in sweet and bitter kernel polyphenol. However,the sweet kernel seedcase polyphenol was two times than bitter kernel at 0.24 mg/mL in OH radical-scavenging rate. On the whole,the antioxidant capacity of sweet kernel polyphenol was better than the bitter kernel polyphenol,which had higher potential value.

kernel;kernel seedcase;polyphenol;antioxidant capacity

2017-05-02

劉夢培(1984-)，女，博士，講師，研究方向：果蔬保鮮與加工利用，E-mail：mengpei0402@126.com。

*通訊作者:縱偉(1965-)，男，博士，教授，研究方向：果蔬加工，E-mail：zongwei1965@126.com。

博士科研啟動基金(2015BSJJ037)；河南省高等學校重點科研項目(17B550007)。

TS255.3

B

1002-0306(2017)23-0159-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.030