一平浪鹽礦產(chǎn)蛋白酶嗜鹽古菌的鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)

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(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

一平浪鹽礦產(chǎn)蛋白酶嗜鹽古菌的鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)

侯靖,徐佳琪,李楊,周瑤,崔恒林*

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

從分離自一平浪鹽礦的嗜鹽古菌中篩選產(chǎn)胞外蛋白酶菌株,并對(duì)所產(chǎn)蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究。結(jié)果表明,2株高產(chǎn)胞外蛋白酶嗜鹽古菌YPL20和YPL26為鹽礦鹽古球菌(Halococcussalifodinae)。YPL20胞外蛋白酶最適反應(yīng)條件為50 ℃,pH9.0和0 mol/L NaCl。YPL26胞外蛋白酶最適反應(yīng)條件為50 ℃,pH7.0～9.0和2.5 mol/L NaCl。它們具有良好的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和鹽度耐受性。Mn2+、Ca2+對(duì)YPL20和YPL26的蛋白酶活性均有促進(jìn)作用,而Cu2+、Zn2+均有抑制作用。絲氨酸蛋白酶抑制劑完全抑制YPL20和YPL26的蛋白酶活性,說明YPL20和YPL26的胞外蛋白酶是絲氨酸蛋白酶。

胞外蛋白酶,嗜鹽古菌,酶學(xué)性質(zhì),鹽礦鹽古球菌

蛋白酶催化蛋白質(zhì)肽鍵的水解,是一種重要的工業(yè)酶制劑,目前廣泛應(yīng)用于食品、洗滌、醫(yī)藥、廢物處理等工業(yè)領(lǐng)域[1]。然而,普通的蛋白酶在高鹽或低水活度條件下會(huì)變性失活,從而限制了其在高鹽發(fā)酵食品或高鹽污水處理等特殊領(lǐng)域的應(yīng)用。

嗜鹽古菌是一類通常生活在鹽湖、曬鹽場(chǎng)、鹽礦以及高鹽腌制食品等高鹽環(huán)境的微生物。由于其特殊的生存環(huán)境,嗜鹽古菌胞外酶大多具有耐鹽、耐有機(jī)溶劑的特性,能夠在高鹽或低水活度條件下維持高活性和穩(wěn)定性。因而,嗜鹽古菌胞外蛋白酶能夠拓寬普通蛋白酶的催化和應(yīng)用范圍,成為近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。Akolkar等人對(duì)Halobacteriumsp. SP1(1)胞外蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究[2],并以此為基礎(chǔ)改良了傳統(tǒng)魚露發(fā)酵工藝,縮短了魚露發(fā)酵時(shí)間[3]。Dammak等人發(fā)現(xiàn)HalorubrumezzemoulenseETR14的胞外蛋白酶具有耐鹽堿、熱穩(wěn)定的特征[4]。Elbanna等人報(bào)道了Halobacteriumsp. HP25胞外蛋白酶耐鹽堿、耐熱的特性,并且能夠耐受一定的有機(jī)溶劑和表面活性劑[5]。石萬良等人對(duì)Natrinemasp. R6-5所產(chǎn)胞外蛋白酶進(jìn)行了純化以及酶學(xué)性質(zhì)表征[6]。高瑞昌等人研究了HalogranumrubrumRO2-11胞外蛋白酶的特性[7]。然而,相對(duì)于豐富的嗜鹽古菌資源,對(duì)其胞外蛋白酶的研究尚處于起步階段,尤其是對(duì)環(huán)境具有廣適性的蛋白酶資源仍有很大挖掘空間[5]。

我國(guó)有很多獨(dú)特的高鹽環(huán)境,如鹽湖、鹽田、鹽礦等,其中蘊(yùn)藏著豐富的嗜鹽古菌酶資源有待發(fā)掘。本研究從分離自云南一平浪鹽礦的嗜鹽古菌中篩選高產(chǎn)胞外蛋白酶菌株,并對(duì)所產(chǎn)蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究,為進(jìn)一步分離純化及工業(yè)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

62株嗜鹽古菌 分離自云南一平浪鹽礦;酵母粉、蛋白胨 OXOID試劑公司;酸水解酪素 Difco公司;酪蛋白、PCR擴(kuò)增試劑盒、脫脂奶粉 上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司;其它試劑 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;NHM培養(yǎng)基成分(g/L) 酵母提取物0.05,魚蛋白胨0.25,丙酮酸鈉1.0,KCl 5.4,CaCl20.29,NH4Cl 0.27,MgSO4·7H2O 26.8,MgCl2·6H2O 23.0,NaCl 184.0,K2HPO40.3,pH7.0～7.2;HM培養(yǎng)基成分(g/L) 酵母提取物1.0,魚蛋白胨1.0,KCl 5.4,K2HPO40.3,CaCl20.29,NH4Cl 0.27,MgSO4·7H2O 26.8,MgC2·6H2O 23.0,NaCl 184.0,pH7.0～7.2;CM培養(yǎng)基成分(g/L) 酸水解酪素7.5,酵母提取物10.0,檸檬酸三鈉3.0,KCl 2.0,MgSO4·7H2O 20.0,FeSO4·7H2O 0.05,NaCl 200.0,pH7.0～7.2;固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂;緩沖液 50 mmol/L磷酸-氫氧化鈉緩沖液(pH6.0),50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.0、8.0、9.0),50 mmol/L硼砂-氫氧化鈉緩沖液(pH10.0、11.0),以及含有不同NaCl濃度的相應(yīng)pH的緩沖液。

超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;LRH-250生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;電子天平 上海精科天平儀器廠;全自動(dòng)滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司;pHS-3TC型酸度計(jì) 上海天達(dá)儀器有限公司;DYY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠;HBA-1151PCR儀 MJ Research公司;HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;DU800TM核酸蛋白分析儀 Beckman-Coulter公司;Avanti J-14離心機(jī) Beckman公司;HYG-C型多功能搖床 太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)胞外蛋白酶菌株篩選 配制含0.5%(m/v)脫脂奶粉的NHM平板,取5 μL經(jīng)NHM培養(yǎng)基活化后的菌液接種到NHM-脫脂奶粉平板,于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 d形成明顯的菌苔后,觀察菌苔周圍是否產(chǎn)生蛋白水解透明圈。產(chǎn)胞外蛋白酶菌株的菌苔周圍有透明圈,不產(chǎn)胞外蛋白酶菌株的菌苔周圍沒有透明圈,根據(jù)透明圈直徑與菌苔直徑之比初步評(píng)價(jià)產(chǎn)蛋白酶能力。

1.2.2 16S rRNA和rpoB′基因序列分析 取少量菌體加入30～50 μL無菌水,100 ℃加熱10 min裂解細(xì)胞,作為PCR擴(kuò)增DNA的模板。16S rRNA基因擴(kuò)增的正反向引物分別為引物0018F和1518R[8]。rpoB′基因擴(kuò)增的正反向引物分別為引物HrpoB2 1420F和HrpoA 153R[9]。PCR反應(yīng)體系25 μL,熱循環(huán)參數(shù):95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,循環(huán)30次,72 ℃后延伸10 min。PCR產(chǎn)物測(cè)序由北京諾賽基因組研究中心完成。基因序列經(jīng)NCBI BLAST分析,獲得相關(guān)模式菌株的16S rRNA和rpoB′基因序列,使用GeneDoc軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)。

1.2.3 培養(yǎng)基對(duì)YPL20和YPL26產(chǎn)胞外蛋白酶能力的影響 分別配制含0.5%(m/v)脫脂奶粉的NHM、HM和CM平板,取5 μL經(jīng)NHM、HM和CM培養(yǎng)基活化后的YPL20和YPL26菌液分別接種到NHM、HM和CM-脫脂奶粉平板,于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 d形成明顯的菌苔后,觀察菌苔周圍蛋白水解透明圈的大小。

1.2.4 粗酶液的制備 YPL20和YPL26菌株經(jīng)NHM液體培養(yǎng)基活化后,以2%的比例接種于200 mL NHM培養(yǎng)基中,37 ℃,160 r/min培養(yǎng)6 d至穩(wěn)定期。培養(yǎng)液于4 ℃,9000×g離心15 min,上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,再采用截留分子量為10 kDa的超濾離心管(Millipore)超濾濃縮10倍,濃縮液即為胞外蛋白酶粗酶液。

1.2.5 蛋白酶活力的測(cè)定

1.2.5.1 酪蛋白溶液的配制 為了研究蛋白酶酶學(xué)性質(zhì),配制不同pH、不同NaCl濃度的酪蛋白溶液。稱取2.00 g干酪素,加入10 mL 0.1 mol/L氫氧化鈉溶液潤(rùn)濕后,加入70 mL一定pH、NaCl濃度的緩沖液(詳見1.2.6),于沸水浴中加熱至酪蛋白完全溶解,用此緩沖液定容至100 mL。

1.2.5.2 蛋白酶活力的測(cè)定 參照福林酚法測(cè)定蛋白酶活力[10]。蛋白酶將酪蛋白水解成酪氨酸等物質(zhì),利用酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出酪氨酸的量計(jì)算蛋白酶活力。

將100 μg/mL L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋成0.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 μg/mL,取0.5 mL上述各稀釋液(做三次平行實(shí)驗(yàn)),分別加入2.5 mL 0.4 mol/L Na2CO3溶液和0.5 mL 33%福林酚試劑,40 ℃顯色20 min,于4 ℃,9000×g離心10 min后,取上清液于680 nm測(cè)定吸光度。以不含酪氨酸的反應(yīng)體系調(diào)零,分別測(cè)定吸光度值。以酪氨酸濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.017x-0.0002。

用一定pH、NaCl濃度的緩沖液(詳見1.2.6)將酶液稀釋10倍,取250 μL酶液加入250 μL此緩沖液配制的酪蛋白溶液,一定溫度下反應(yīng)30 min,加入500 μL 10%三氯乙酸溶液終止反應(yīng)。37 ℃放置30 min后,于4 ℃,9000×g離心10 min,取500 μL上清液加入2.5 mL 0.4 mol/L Na2CO3溶液和0.5 mL 33%福林酚試劑,40 ℃顯色20 min,于4 ℃,9000×g離心10 min,取上清液于680 nm測(cè)定吸光度。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照,即在酶液中先加入三氯乙酸溶液,后加入酪蛋白溶液。在特定反應(yīng)條件下,每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸定義為1個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.6 酶學(xué)性質(zhì)的研究

1.2.6.1 最適反應(yīng)溫度 用2 mol/L NaCl,pH7.0緩沖液將25 μL酶液稀釋10倍后,按上述蛋白酶活力的測(cè)定方法,與250 μL相應(yīng)酪蛋白溶液分別在35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 ℃下反應(yīng),測(cè)定酶活力。

1.2.6.2 熱穩(wěn)定性 用2 mol/L NaCl,pH7.0緩沖液將25 μL酶液稀釋10倍后,在30、50、70、90 ℃下分別放置0、20、40、60 min,按上述蛋白酶活力的測(cè)定方法,與250 μL相應(yīng)酪蛋白溶液在最適溫度下反應(yīng),測(cè)定酶活力。

1.2.6.3 最適反應(yīng)pH 將25 μL酶液分別用含2 mol/L NaCl的pH6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0緩沖液稀釋10倍后,按上述蛋白酶活力的測(cè)定方法,與250 μL相應(yīng)酪蛋白溶液在最適溫度下反應(yīng),測(cè)定酶活力。

1.2.6.4 酸堿穩(wěn)定性 將25 μL酶液分別用含2 mol/L NaCl的pH6.0、8.0、10.0緩沖液稀釋10倍后,于30 ℃放置0、20、40、60 min,按上述蛋白酶活力的測(cè)定方法,與250 μL含2 mol/L NaCl的最適pH的酪蛋白溶液在最適溫度下反應(yīng),測(cè)定酶活力。

1.2.6.5 最適反應(yīng)NaCl濃度 將25 μL酶液分別用含有0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mol/L NaCl的緩沖液稀釋10倍,按上述蛋白酶活力的測(cè)定方法,與250 μL相應(yīng)酪蛋白溶液在最適溫度、最適pH下反應(yīng),測(cè)定酶活力。

1.2.6.6 NaCl濃度穩(wěn)定性 將25 μL酶液分別用含有0、1.0、2.0、3.0 mol/L NaCl的緩沖液稀釋10倍,在30 ℃放置0、20、40、60 min,按上述蛋白酶活力的測(cè)定方法,隨后分別與250 μL含3.0、2.0、1.0、0 mol/L NaCl的酪蛋白溶液在最適溫度、最適pH下反應(yīng),測(cè)定酶活力。

1.2.6.7 金屬離子對(duì)蛋白酶活力的影響 最適緩沖液稀釋10倍后的250 μL酶液中分別加入終濃度為5 mmol/L的KCl、CaCl2、ZnSO4、CuSO4、FeCl2、MnCl2、MgCl2,30 ℃放置20 min,按上述蛋白酶活力的測(cè)定方法,在最適條件下測(cè)定酶活力。設(shè)置不加金屬離子的對(duì)照反應(yīng)體系。

1.2.6.8 抑制劑對(duì)蛋白酶活力的影響 最適緩沖液稀釋10倍后的250 μL酶液中分別加入4 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)、1 mmol/L對(duì)-氯汞基苯甲酸(PCMB)、10 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、0.1 mmol/L胃蛋白酶抑制劑(Pepstatin A),30 ℃放置20 min,按上述蛋白酶活力的測(cè)定方法,在最適條件下測(cè)定酶活力。設(shè)置不加抑制劑的對(duì)照反應(yīng)體系。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)測(cè)定三次,以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,用SPSS 18.0進(jìn)行顯著性分析,顯著水平設(shè)為0.05,極顯著水平設(shè)為0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)胞外蛋白酶菌株的篩選和鑒定

分離自云南一平浪鹽礦的62株嗜鹽古菌中,YPL20和YPL26在NHM-脫脂奶粉平板上產(chǎn)生的水解圈直徑與菌苔直徑之比最大。16S rRNA基因序列分析表明,YPL20和YPL26的16S rRNA基因序列完全一致,與鹽礦鹽古球菌(Halococcussalifodinae)DSM 8989菌株的16S rRNA基因序列的一致性為100%。rpoB′基因序列分析表明YPL26的rpoB′基因序列與H.salifodinaeDSM 8989的一致性為100%,而YPL20與其一致性為99.6%。因此,YPL20與YPL26為H.salifodinae的不同菌株。鹽古球菌屬(Halococcus)尚未有任何菌株被報(bào)道能夠產(chǎn)生胞外蛋白酶,因而將本研究篩選到的兩株高產(chǎn)蛋白酶的鹽礦鹽古球菌YPL20和YPL26用作進(jìn)一步研究對(duì)象。

2.2 培養(yǎng)基對(duì)YPL20和YPL26產(chǎn)胞外蛋白酶能力的影響

從圖1可以看出,YPL20和YPL26在氮源匱乏的NHM-脫脂奶粉平板上的水解圈直徑大于氮源適中的HM-脫脂奶粉平板,而在氮源豐富的CM-脫脂奶粉平板上未產(chǎn)生明顯的水解圈。說明當(dāng)培養(yǎng)基中存在豐富的可利用的氨基酸、多肽時(shí),細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生胞外蛋白酶。類似地,D’Alessandro等人研究發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)受限的條件能夠促進(jìn)Natrialbamagadii產(chǎn)生胞外蛋白酶[11]。

圖1 YPL26和YPL20在脫脂奶粉平板上培養(yǎng)4 d產(chǎn)生的水解圈Fig.1 Hydrolysis zones of YPL26 and YPL20 cultured on milk agar plates for 4 days注:左側(cè)為YPL26菌株,右側(cè)為YPL20菌株;(a)NHM-脫脂奶粉平板,(b)HM-脫脂奶粉平板,(c)CM-脫脂奶粉平板。

2.3 YPL20和YPL26胞外蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1 最適反應(yīng)溫度與熱穩(wěn)定性 基于以上結(jié)果,NHM培養(yǎng)基用于培養(yǎng)YPL20和YPL26菌株并制備粗酶液進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)表征。從圖2可以看出,YPL20和YPL26的蛋白酶在35～90 ℃內(nèi)均有酶活,隨著溫度升高,酶活先增加后降低,最適反應(yīng)溫度均為50 ℃。YPL20的蛋白酶在65～90 ℃酶活力基本保持不變,約為最高酶活的50%。YPL26的蛋白酶在45～75 ℃內(nèi)具有較高酶活(最高酶活的90%以上)。因此,YPL20和YPL26的胞外蛋白酶具有良好的耐熱性,其中YPL26蛋白酶的耐熱性更好。

圖2 YPL20和YPL26蛋白酶的最適反應(yīng)溫度Fig.2 The optimum temperature for protease activities of YPL20 and YPL26

從圖3可以看出,YPL20的蛋白酶在30 ℃具有良好的穩(wěn)定性,在50 ℃隨著處理時(shí)間增加酶活逐漸降低,處理60 min后蛋白酶活性降低31%。在70、90 ℃處理出現(xiàn)瞬時(shí)失活效應(yīng),即放置20 min后,蛋白酶活性降低了約46%,延長(zhǎng)放置時(shí)間,蛋白酶活力基本不變。YPL26的蛋白酶在30、50 ℃具有良好的穩(wěn)定性,在70、90 ℃隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)酶活逐漸降低。70 ℃放置60 min后,蛋白酶活力降低16%;90 ℃放置60 min,蛋白酶活力降低28%。因此,YPL20和YPL26的胞外蛋白酶具有一定的熱穩(wěn)定性,與最適反應(yīng)溫度結(jié)果類似,YPL26胞外蛋白酶的熱穩(wěn)定性優(yōu)于YPL20。蛋白酶良好的耐熱性和熱穩(wěn)定性對(duì)于工業(yè)應(yīng)用非常重要,因?yàn)楹芏喙I(yè)過程,如食品發(fā)酵過程,均需要維持一定溫度。

圖3 不同溫度處理對(duì)YPL20(a)和YPL26(b)蛋白酶活力的影響Fig.3 Effect of pre-incubation at different temperatures on protease activities of YPL20(a)and YPL26(b)

2.3.2 最適反應(yīng)pH與酸堿穩(wěn)定性 從圖4可以看出,YPL20和YPL26的胞外蛋白酶在pH6.0～11.0范圍內(nèi)均具有一定的活性,隨著pH的升高,酶活先升高后降低。YPL20蛋白酶的最適反應(yīng)pH為9.0。pH為11時(shí),酶活力最低,為最高酶活的53%。YPL26胞外蛋白酶的最適pH為7.0～9.0,當(dāng)pH低于或高于最適pH時(shí),蛋白酶活力迅速降低。YPL20和YPL26的胞外蛋白酶均屬于堿性蛋白酶。

圖4 YPL20和YPL26蛋白酶的最適反應(yīng)pHFig.4 The optimum pH for protease activities of YPL20 and YPL26

圖5 不同pH處理對(duì)YPL20(a)和YPL26(b)蛋白酶活力的影響Fig.5 Effect of pre-incubation at different pH values on protease activities of YPL20(a)and YPL26(b)

從圖5可以看出,YPL20和YPL26的胞外蛋白酶在pH6.0～10.0處理60 min酶活均沒有顯著變化,說明YPL20和YPL26的蛋白酶具有良好的酸堿穩(wěn)定性,將具有廣泛的應(yīng)用前景。

2.3.3 最適反應(yīng)NaCl濃度與鹽度穩(wěn)定性 普通的蛋白酶在高鹽條件下會(huì)變性失活,而嗜鹽古菌蛋白質(zhì)通過增加蛋白表面的酸性氨基酸殘基以形成負(fù)電屏蔽,從而在蛋白周圍形成一層水化層來維持在高鹽環(huán)境中的活性和穩(wěn)定性[12]。從圖6可以看出,YPL20和YPL26蛋白酶在0～3 mol/L NaCl濃度范圍內(nèi)均具有一定的活力。YPL20蛋白酶的最適反應(yīng)NaCl濃度為0 mol/L,隨著NaCl濃度升高,蛋白酶活性下降。當(dāng)NaCl濃度升至3 mol/L時(shí),其活性降為最高活性的43%。YPL26蛋白酶活力隨著NaCl濃度增加先升高后降低,最適反應(yīng)NaCl濃度為2.5 mol/L,在1.5～3.0 mol/L NaCl濃度范圍內(nèi),具有較高活性(最高酶活的80%以上)。目前報(bào)道的很多嗜鹽古菌胞外蛋白酶僅能在高鹽條件下發(fā)揮催化活性,在低鹽條件下會(huì)失活,如HalogeometricumborinquenseTSS101[13]、Natronococcusoccultus[14]的胞外蛋白酶在不存在NaCl的條件下不具有酶活力。相比而言,YPL20和YPL26的蛋白酶具有較廣的鹽濃度適應(yīng)性。

圖6 YPL20和YPL26蛋白酶的最適反應(yīng)NaCl濃度Fig.6 The optimum NaCl concentration for protease activities of YPL20 and YPL26

從圖7可以看出,YPL20胞外蛋白酶在0、1.0、2.0 mol/L NaCl中具有良好的穩(wěn)定性,在3 mol/L NaCl中隨著處理時(shí)間增加,酶活力稍有降低,處理40～60 min后,酶活降低約13%。YPL26胞外蛋白酶在0、1.0、2.0、3.0 mol/L NaCl中均具有良好的穩(wěn)定性。YPL20和YPL26胞外蛋白酶對(duì)低鹽和高鹽濃度均有較好的耐受性,因而應(yīng)用范圍更為廣泛。

圖7 不同NaCl濃度處理對(duì)YPL20(a)和YPL26(b)蛋白酶活力的影響Fig.7 Effect of pre-incubation at different NaCl concentrations on protease activities of YPL20(a)and YPL26(b)

2.3.4 金屬離子對(duì)蛋白酶活性的影響 不同的金屬離子對(duì)不同的蛋白酶活力影響不同。從圖8可以看出,K+、Mg2+對(duì)YPL20蛋白酶活力沒有顯著影響(p>0.05),Ca2+、Mn2+使YPL20胞外蛋白酶活力分別提高了39%和72%,Zn2+、Cu2+、Fe2+使蛋白酶活力分別降低了49%、63%和69%。K+、Mg2+、Fe2+對(duì)YPL26胞外蛋白酶活力沒有顯著影響(p>0.05)。Ca2+、Mn2+使YPL26胞外蛋白酶活性分別提高了22%和102%。Zn2+、Cu2+使YPL26蛋白酶活性分別降低了51%和69%。因此,在工業(yè)應(yīng)用中可以通過添加Ca2+、Mn2+提高YPL20和YPL26蛋白酶酶活。

圖8 金屬離子對(duì)YPL20和YPL26蛋白酶活力的影響Fig.8 Effect of metal ions on protease activities of YPL20 and YPL26

2.3.5 抑制劑對(duì)蛋白酶活性的影響 根據(jù)活性中心的功能基團(tuán),蛋白酶主要分為絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶[15]。從圖9可以看出,絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF使YPL20和YPL26胞外蛋白酶完全失活(p<0.01),說明YPL20和YPL26的胞外蛋白酶可能是絲氨酸蛋白酶。半胱氨酸蛋白酶抑制劑PCMB使YPL20和YPL26胞外蛋白酶活力分別降低了97%和75%,表明半胱氨酸對(duì)于YPL20和YPL26蛋白酶活性具有非常重要的作用。金屬蛋白酶抑制劑EDTA使YPL20和YPL26胞外蛋白酶活力分別降低了40%和29%,可能通過螯合Ca2+、Mn2+等金屬離子使酶活性中心失去輔因子從而抑制酶活。天冬氨酸蛋白酶抑制劑Pepstatin A對(duì)酶活沒有顯著影響(p>0.05)。因此,YPL20和YPL26的胞外蛋白酶可能是絲氨酸蛋白酶,目前報(bào)道的嗜鹽古菌胞外蛋白酶多為絲氨酸蛋白酶[16]。

圖9 抑制劑對(duì)YPL20和YPL26蛋白酶活力的影響Fig.9 Effect of inhibitors on protease activities of YPL20 and YPL26

3 結(jié)論

從分離自云南一平浪鹽礦的嗜鹽古菌中篩選出兩株高產(chǎn)胞外蛋白酶嗜鹽古菌YPL20和YPL26,經(jīng)16S rRNA和rpoB′基因序列分析鑒定為鹽礦鹽古球菌(Halococcussalifodinae)。YPL20胞外蛋白酶最適反應(yīng)條件為50 ℃,pH9.0和0 mol/L NaCl。YPL26胞外蛋白酶最適反應(yīng)條件為50 ℃,pH7.0～9.0和2.5 mol/L NaCl。它們具有良好的耐熱性、酸堿穩(wěn)定性,對(duì)低鹽和高鹽濃度均有較好的耐受性,因而具有廣泛的應(yīng)用前景。Mn2+、Ca2+對(duì)YPL20和YPL26的蛋白酶活性均有促進(jìn)作用。YPL20和YPL26胞外蛋白酶可能是絲氨酸蛋白酶,半胱氨酸對(duì)于活性發(fā)揮也有著重要的作用。YPL20和YPL26胞外蛋白酶酶學(xué)特性的研究為其進(jìn)一步分離純化及在工業(yè)技術(shù)領(lǐng)域的潛在應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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IdentificationofhalophilicarchaeaproducingproteasefromYipinglangsaltmineanditsenzymaticproperties

HOUJing,XUJia-qi,LIYang,ZHOUYao,CUIHeng-lin*

(School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China)

Haloarchaeal strains isolated from Yipinglang salt mine were screened for extracellular protease production. Their enzyme properties were studied. The results showed that YPL20 and YPL26 showed the highest protease activity,and were identified asHalococcussalifodinaestrains. The maximal protease activity of YPL20 occurred at 50 ℃,pH9.0,and 0 mol/L NaCl. The YPL26 protease exhibited optimal activity at 50 ℃,pH7.0～9.0,and 2.5 mol/L NaCl. The YPL20 and YPL26 proteases were highly stable over wide ranges of temperatures,pH values and NaCl concentrations. Mn2+and Ca2+significantly enhanced protease activity of YPL20 and YPL26. Cu2+and Zn2+significantly inhibited the protease activities. The protease activities were completely inhibited by serine protease inhibitor,indicating that YPL20 and YPL26 proteases may be serine proteases.

extracellular protease;halophilic archaea;enzyme properties;Halococcussalifodinae

2017-06-13

侯靖(1988-)，女，博士，講師，研究方向：食品微生物資源，E-mail：houjing@ujs.edu.cn。

*通訊作者:崔恒林(1970-)，男，博士，教授，研究方向：食品微生物多樣性與安全性，E-mail：cuihenglin@ujs.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31600002)；中國(guó)博士后科學(xué)基金(2015M581728)；江蘇省博士后科研資助計(jì)劃(1501069C)；江蘇大學(xué)高級(jí)人才科研啟動(dòng)基金(15JDG062)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)23-0124-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.025