群體感應抑制劑3,4二溴2(5H)呋喃酮對熒光假單胞菌生物膜形成的抑制作用

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(1.寧波市食品檢驗檢測研究院,浙江寧波 315000;2.中國計量大學生命科學學院,浙江杭州 310018)

邢家溧1,2,陳珊珊2,周子焱1,沈堅1,傅曉1,馬超毅2,陸昭君2,施悅嵐2,汪藝2,戴賢君2,鄭睿行1,*

(1.寧波市食品檢驗檢測研究院,浙江寧波 315000;2.中國計量大學生命科學學院,浙江杭州 310018)

為了研究3,4-二溴-2(5H)-呋喃酮(3,4-dibromo-2(5H)-furanone,DF)對熒光假單胞菌生物膜形成的抑制作用。通過在24孔板和硅膠片上構建生物膜模型,CFU計數法測定DF對熒光假單胞菌的最低抑制濃度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)和最低殺菌濃度(Minimum Bacterial Concentration,MBC)以及生物膜生長曲線,在1倍MIC和5倍MIC的DF作用下的熒光假單胞菌生物膜形成率和細菌群集運動能力,并探討DF對熒光假單胞菌總蛋白合成及多糖含量的影響。結果表明,DF對熒光假單胞菌作用的MIC和MBC值分別為12.5 μg/mL和800 μg/mL;在DF濃度為1 MIC和5 MIC時,作用于熒光假單胞菌24 h生物膜形成抑制率分別為20.59%±2.91%和99.54%±1.83%,并能明顯抑制熒光假單胞菌的群集運動能力,干擾熒光假單胞菌群體感應(Quorum sensing,QS)系統而影響其總蛋白合成及多糖的含量,24 h時5 MIC的DF對熒光假單胞菌總蛋白和菌多糖合成量的抑制率分別為8.04%±0.37%和51.08%±2.71%。本研究對DF影響熒光假單胞菌生物膜形成的原因,DF對熒光假單胞菌生物膜形成的抑制作用及其對QS通路的干擾具有良好的理論和實踐參考。

3,4-二溴-2(5H)-呋喃酮,熒光假單胞菌,生物膜,抑制作用

細菌生物膜(Biofilm,BF)的形成是細菌在營養物質缺乏時,通過群體感應(Quorum sensing,QS)系統在信號分子的調控下分泌的細胞外基質物質如多糖、蛋白質和DNA等多聚物質[1],BF將細菌本身包裹于其中,從而使細菌易粘附于惰性或活性材料表面,如加工設備等[2]。據美國國立衛生研究院(National Institutes of Health,NIH)統計發現,超過八成的細菌性疾病是由于菌體生物膜的形成[3]。在食品工業中,由于生物膜的普遍性、形態結構和生化特性的特殊性,食源性病原菌和腐敗菌往往能黏附于廠房地板和天花板、輸送管道、不銹鋼等材料表面形成生物膜,有效避開宿主免疫作用、抗生素殺傷作用,并且產生耐藥性,成為潛在的食品污染源,是食品安全的重大隱患[4]。

熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)屬于假單胞菌屬的無芽孢、無莢膜、有極端鞭毛的革蘭氏陰性菌[5],作為嗜冷菌,在生活生產中應用廣泛,能產生抗生素、水解酶等代謝產物,可以通過形成生物膜減少來自外界的影響,是冷藏食品腐敗的優勢菌,是牛奶中危害最大的微生物,此外熒光假單胞菌在生產設備表面形成的生物膜難以清除,對食品生產可能帶來持續污染[6]。因此,防治熒光假單胞菌生物膜的形成及其相關危害成為目前研究的前沿和熱點。

研究表明,3,4-二溴-2(5H)-呋喃酮(3,4-dibromo-2(5H)-furanone,DF)可以與細菌分泌的自誘導物競爭性結合自誘導物受體,通過作用于細菌的QS系統影響細菌生物膜的形成,是一種QS通路抑制劑[5,7]。本研究旨在通過研究DF對熒光假單胞菌生物膜形成的影響,探究其對熒光假單胞菌生物膜形成的抑制作用和效果及其對QS通路的干擾。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

熒光假單胞菌 由本實驗室分離鑒定并保存于中國計量大學生物檢測與食品安全研究所;L-肉湯培養基(LB) 杭州百思生物技術有限公司;DF Sigma公司;醫用硅膠片、移液槍、0.45 μm微孔濾膜、24孔板、二甲亞砜、0.4%結晶紫、PBS(pH7.3)、2.5%戊二醛PBS溶液、飽和氯化鈣溶液、5%硝酸銀溶液 杭州米克化工有限公司。

CR60DF立式自動壓力蒸汽滅菌器 廈門致薇儀器有限公司;BJ-2CD超凈工作臺 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;I3型紫外可見分光光度計 濟南荷能儀器股份有限公司;LT-BIX低溫生化培養箱 上海立德泰勀科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的活化和硅膠引導片的處理

1.2.1.1 菌株的活化 熒光假單胞菌在含30%(v/v)甘油的LB培養基中,-80 ℃凍存。使用前按1%(v/v)接種量接于LB液體培養基,28 ℃靜置培養18 h,連續活化2次。

1.2.1.2 硅膠引導片的處理 將1 cm×1 cm醫用硅膠引導片先用去離子水沖洗,再于丙酮中60 W超聲15 min;然后把它們放在75%的乙醇中浸泡30 min,洗滌劑清洗,并用蒸餾水沖洗干凈,最后121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 DF作用熒光假單胞菌的最低抑制濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)的測定 采用二倍稀釋法,將不同濃度的DF(6.25、12.5、25、50、100、200、400、800和1000 μg/mL,50 μg)加入到含熒光假單胞菌(初始OD為0.05,50 μL)的5 mL LB液體培養基的試管中,28 ℃下培養24 h后,測其OD600,平行測定3次。

1.2.3 DF對熒光假單胞菌生物膜影響

1.2.3.1 DF對熒光假單胞菌浮游菌生長曲線及生物膜生長曲線的影響 取培養24 h處于對數生長期的熒光假單胞菌液稀釋成菌懸液,OD600為0.5,取1%接種于5 mL培養液中,并分別加入0.05 mL的1MIC與5MIC的DF,以不加DF的為對照組,28 ℃恒溫振蕩培養,每隔4 h測菌落OD600,繪制浮游菌菌落生長曲線,平行實驗3次;

取培養24 h處于對數生長期的熒光假單胞菌液稀釋成菌懸液,OD600為0.5,24孔板每孔接種1 mL 1%菌液,分別加入0.05 mL的1MIC與5 MIC的DF,同等大小硅膠片一片。28 ℃培養,分別于0、6、12、24、36、48、72 h取出硅膠引導片置于試管中,加3 mL無菌水超聲20 min,渦旋3 min,測OD600,并在倍比稀釋后進行CFU計數,平行實驗3次,繪制生物膜曲線。

1.2.3.2 群集運動能力測定 制備測定群集運動能力平板,添加0.05 mL 5 MIC的DF為實驗組,以不含DF的培養基作為空白對照。用滅菌牙簽挑取固體LB培養基上過夜培養的單菌落,扎透培養基,將細菌接種到培養基下面的塑料平皿上,28 ℃下恒溫培養24 h。

1.2.3.3 DF作用下的熒光假單胞菌生物膜銀染鑒定及抑制率 向24孔板中每孔加入1 mL LB培養基、滅菌硅膠引導片、10 μL菌液(OD600為0.5),分別加入10 μL的1MIC與5MIC的DF為實驗組,以不含DF的培養基作為對照組,28 ℃培養24 h后取出菌懸液,測其OD600,然后輕輕洗孔,室溫干燥30 min,加入1 mL 1%結晶紫染色,室溫放置15 min后取出染液,蒸餾水洗孔兩次,室溫干燥30 min,加入1 mL的95%乙醇進行溶解,測其OD600,用銀染法鑒定熒光假單胞菌生物膜的狀態[8]。

1.2.4 DF對細菌總蛋白合成、生物膜胞外多糖含量的影響 取培養24 h處于對數生長期的熒光假單胞菌液稀釋成菌懸液,OD600為0.5,取1%接種于5 mL培養液中,加入0.05 mL的1MIC與5 MIC的DF,28 ℃恒溫振蕩培養,每隔4 h提菌總蛋白并用考馬斯亮藍法測定[9],繪制總蛋白含量曲線;取培養24 h處于對數生長期的熒光假單胞菌液稀釋成菌懸液,OD600為0.5,取1%接種于5 mL培養液中,加入0.05 mL的1MIC與5MIC的DF,28 ℃恒溫振蕩培養,每隔4 h用EDTA溶劑法提取多糖,采用苯酚硫酸法測定多糖含量[10],繪制多糖含量曲線。

表1 溴代呋喃酮對熒光假單胞菌的1MIC和MBC值Table 1 1MIC and MBC values of bromo-furanone inhibiting the growth of Pseudomonas fluorescens

1.3 數據處理

采用Excel 2003和SPSS 13.0數據統計軟件處理實驗數據,每個實驗重復3次。采用SPSS的單因素方差分析(ANOVA)樣品的顯著性差異。單因素ANOVA分析用SPSS和Fisher’s least significant difference(LSD)表明樣品間顯著差異,只有當p<0.05時被認定為數據具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 溴代呋喃酮對熒光假單胞菌抑制作用的MIC和MBC值

通過溴代呋喃酮對熒光假單胞菌抑制作用的MIC和MBC值測定,從表1可以看出,當DF濃度低于12.5 μg/mL時,6.25 μg/mL的OD600與對照組無顯著差異(p>0.05),而12.5 μg/mL的OD600顯著(p<0.05)低于對照組,這表明低于12.5 μg/mL的DF對熒光假單胞菌無抑制作用,當DF濃度高于800 μg/mL時,DF對熒光假單胞菌的抑制作用不再增強,因此可以確定DF對熒光假單胞菌的MIC值為12.5 μg/mL,MBC值為800 μg/mL。在郭嘉亮等[11]的研究中采用1/2 MIC溴代2-(5H)-呋喃酮的化合物濃度對綠膿桿菌進行實驗,而在本實驗中探索到1MIC(12.5 μg/mL)、5 MIC(800 μg/mL)DF對熒光假單胞菌的作用,因此在后續實驗分別選擇1MIC和5 MIC作為工作濃度。

2.2 DF對生物膜的抑制作用

2.2.1 DF作用下的熒光假單胞菌生物膜與浮游菌生長曲線 生物膜生長為非線性生長模型,易黏附在硅膠引導片上[12]。如圖1A所示,0～12 h為生物膜菌落數快速增長期。12～48 h為生物膜快速增長期,形成成熟的生物膜,此時菌落形態良好,最接近最大活菌數。48～72 h生物膜生長的停滯期,菌落分泌大量胞外聚合物,出現菌落融合成片現象,導致可數菌落數不再增多甚至減少,這也與前人研究結果相似[13]。通過對比熒光假單胞菌生長曲線可以看出,1MIC組熒光假單胞菌與對照組趨勢基本一致,在48 h后出現生長顯著降低(p<0.05),而5 MIC組從6 h開始細菌總量就明顯低于1MIC組和對照組,表明DF能夠抑制熒光假單胞菌的生長,這種抑制作用隨DF的作用時間和濃度而改變。

圖1B為熒光假單胞菌的浮游細菌數變化,在1MIC濃度DF作用下,浮游細菌數增長趨勢與對照組基本一致,但在5 MIC濃度作用下,DF延緩了細菌進入快速增長期與平穩期的時間點,可見5 MIC濃度DF的抑菌效果較明顯。

QS系統全程調節細菌生物膜的形成,根據本實驗結果顯示,在1MIC和5 MIC時,DF作用于熒光假單胞菌72 h的生物膜形成抑制率(9.63%±0.46%,23.5%±4.32%)均明顯高于其對浮游細菌24 h的抑制率(8.48%±0.42%,18.02%±2.49%),這表明作為QS通路抑制劑的DF可通過干擾其QS系統而影響細菌生物膜的形成。

圖1 溴代呋喃酮作用下熒光假單胞菌生物膜細菌與浮游菌生長曲線Fig.1 Growth curve of Pseudomonas fluorescens biofilm and planktonic colonies on the effect of bromo-furanone注：A為生物膜細菌,B為浮游細菌。

2.2.2 DF作用下的熒光假單胞菌群集運動能力 細菌的群集運動是其依賴鞭毛以及強大的生物膜表面活性物質的遷移運動,是細菌表面遷移的最快形式[11],QS系統通過對鞭毛操縱子的調控來調控細菌的群集運動[14]。DF通過抑制QS系統來抑制菌體的群集能力,從而影響菌體的運動能力[15]。根據圖2A與2B對比發現,DF能夠顯著的抑制熒光假單胞菌菌體群集運動,進而破壞菌體生物膜的形成。這表明DF通過對熒光假單胞菌群集運動能力的抑制作用進一步影響了其生物膜的形成。

圖2 溴代呋喃酮對熒光假單胞菌群集運動能力的影響Fig.2 The effect of bromo-furanone on swarming motility capacity of Pseudomonas fluorescens注：A:對照;B:5MIC組。

2.2.3 DF作用下的熒光假單胞菌生物膜銀染法鑒定 由圖3A可見,培養24 h的硅膠片經銀染后,硅膠表面形成密集的菌落,可以觀察到有黑色的棉絮樣團塊狀物,表明此時熒光假單胞菌生物膜形成較為成熟。當加入1MIC的DF(圖3B),細菌多以分散的較為密集的形式存在;加入5 MIC的DF(圖2C),其抑制菌體生長較為顯著,部分區域只發現稀少的塊狀分布,以單個菌落或碎片形式存在。在郭嘉亮等[16]的研究中發現DF對綠膿桿菌也有同樣的抑制作用,DF通過抑制熒光假單胞菌信號聯導分子的產生,阻止細菌聚集在一起,從而阻止生物膜的形成。通過OD值比較細菌群落總數計算1MIC和5 MIC的DF對熒光假單胞菌生物膜形成,抑制率分別為20.59%±2.91%和99.54%±1.83%。

圖3 不同濃度DF作用下的熒光假單胞菌生物膜Fig.3 Biofilms of Pseudomonas fluorescens at different concentrations of bromo-furanone注：A、B、C分別為對照組、DF的1MIC組、DF的5MIC組。

2.3 DF對熒光假單胞菌生物膜總蛋白、生物膜胞外多糖含量的影響

菌體在QS過程中產生一類信息素AHLs,能與LuxI蛋白和LuxR蛋白結合并激活細胞基因的轉錄表達[4,17]。DF為AHLs的類似物,在其低濃度時就能影響受體蛋白與信號分子結合,抑制QS系統啟動它所調控的基因表達,從而對菌分泌蛋白的合成起到一定的抑制作用,且濃度越大抑制效果越明顯。如圖4對照組所示,熒光假單胞菌菌體在8 h后進入了快速生長期,細菌大量繁殖,總蛋白合成量增多;20 h后,菌體進入穩定期,細菌數達到最大值,總蛋白合成量最大。隨著時間的變化,熒光假單胞菌總蛋白合成波動起伏,但總體呈現增長的趨勢,加入DF后,假單胞菌總蛋白合成總體呈現增長的趨勢,但是增長幅度明顯低于對照組,而且濃度越高抑制效果越明顯,24 h時5 MIC的DF對熒光假單胞菌總蛋白合成量的抑制率(8.04%±0.37%)顯著高于(p<0.05)1MIC的(2.77%±0.08%),這表明DF可以抑制熒光假單胞菌總蛋白合成。

QS通過刺激細菌胞外多糖分泌影響細菌生物膜形成[18]。胞外多糖通過降解一些高分子物質以被菌體利用進而包裹細菌提高生物膜結構穩定性,QS可以調控胞外多糖的產生量及成分變化,從而對細菌粘附性產生影響,繼而影響生物膜結構[19]。結果顯示,DF具有明顯抑制胞外多糖分泌的效果,這表明DF通過抑制QS系統的胞外多糖分泌來抑制細菌生物膜的形成。如圖5對照組所示,熒光假單胞菌多糖的分泌與蛋白的分泌趨勢是一致的,都是隨著時間延長,分泌量呈現增加的趨勢。從8 h開始細菌進入快速增長期;20 h后多糖含量穩定,菌體增長速度減緩,生物膜形成漸趨成熟,與對照組相比,24 h時1MIC和5 MIC濃度DF對細菌多糖分泌具有抑制效果,5 MIC(51.08%±2.71%)抑制熒光假單胞菌多糖的分泌強于MIC(25.51%±1.54%),表明DF濃度越高,對熒光假單胞菌多糖的分泌抑制作用就越強,但是多糖和蛋白并不能代表DF抑制QS系統的全部抑制因子,這也就是1MIC組雖然對多糖和蛋白都有明顯抑制作用,但是在細菌生物膜形成的抑制中作用并不明顯,但是當1MIC濃度達到5 MIC時,抑制作用就非常明顯,這表明細菌生物膜的抑制作用與DF的濃度有關。

圖4 不同濃度溴代呋喃酮作用下熒光假單胞菌蛋白含量的變化曲線Fig.4 Total protein content of Pseudomonas fluorescens under the effect of BF

圖5 不同濃度溴代呋喃酮作用下熒光假單胞菌總糖含量的變化曲線Fig.5 Polysaccharide content of Pseudomonas fluorescens under the effect of BF

3 結論

細菌生物膜是一種具有協調性、功能性和高度結構性的膜狀復合物[20],其表面包被多聚糖基質,內部包含眾多輸送養料的管道,適應能力強,是細菌對抗生素耐藥的主要原因,據估計超過60%的微生物感染是由細菌的生物被膜引起的[21]。本文通過DF對熒光假單胞菌生物膜形成研究和定性觀察,探討了DF影響熒光假單胞菌生物膜的形成規律和外部條件,研究發現DF濃度為MIC和5 MIC時,DF作用于熒光假單胞菌24 h,銀染法鑒定生物膜形成抑制率分別為20.59%±2.91%和99.54%±1.83%,并能明顯抑制熒光假單胞菌的群集運動能力,干擾熒光假單胞菌QS系統而影響其總蛋白合成及多糖的含量,可為預防或抑制生物膜在食品中的形成提供參考,為尋找新型抗菌藥提供實驗依據,但DF改變QS抑制生物膜形成的具體機制仍有待進一步研究。

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Effectof3,4-dibromo-2(5H)-furanoneasanaturalquorumsensinginhibitoronbiofilmformationofPseudomonasFluourcens

XINGJia-li1,2,CHENShan-shan2,ZHOUZi-yan1,SHENJian1,MAChao-yi2,LUZhao-jun2,SHIYue-lan2,WANGYi2,DAIXian-jun2,ZHENGRui-hang1,*

(1.Ningbo Institute for Food Control,Ningbo315000,China;2.College of Life Science,China Jiliang University,Hangzhou310018,China)

In order to research the inhibiting effect of3,4-dibromo-2(5H)-furanone(DF)on biofilm formation ofPseudomonasFluourcens.The effect of DF on minimum inhibitory concentration(MIC),minimum bacterial concentration(MBC)values and growth curve ofPseudomonasfluorescensaccording the biofilm model of24orifice plate and silicon rubber were calculated by CFU counting method.The biofilmand the cluster movement ability of bacteria was studied at MIC and5MIC of DF,and the inhibiting rate of formation the contents of total protein synthesis and polysaccharide were examined. The results showed that the MIC and MBC values of DF onPseudomonasfluorescenswere12.5μg/mL and800μg/mL,respectively. The inhibitting rates of biofilm formation ofPseudomonasfluorescenswere20.59%±2.91% and99.54%±1.83% on24h at the concentration of1MIC and5MIC of DF. DF could inhibite the cluster movement and disturb the quorum sensing,there by had an effect on the total protein and extracellular polysaccharides content ofPseudomonasfluorescens. The inhibitting rates of total protein and extracellular polysaccharides content ofPseudomonasfluorescenswere8.04%±0.37% and51.08%±2.71% on24h at the concentration of5MIC of DF.In this paper,the reason of DF’s effect on the formation ofPseudomonasfluorescensbiofilm was studied.The inhibition of DF onPseudomonasaeruginosabiofilm formation and its interference with QS pathway have good theoretical and practical reference.

3,4-dibromo-2(5H)-furanone;Pseudomonasfluorescen;biofilm;inhibiting effect

2017-05-02

邢家溧(1988-)，女，博士，研究方向：食品質量安全檢驗，E-mail:hellojiali77@gmail.com。

*通訊作者:鄭睿行(1982-)，男，碩士，高級工程師，研究方向：食品質量安全檢驗，E-mail:13865867@qq.com。

浙江省食品藥品監管系統科技計劃項目(SP201617)；浙江省科技項目(2012C03009-2)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)23-0114-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.023