苯乳酸與單增李斯特菌和大腸桿菌胞內外基因組的抑菌作用機制

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(錦州醫科大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121000)

苯乳酸與單增李斯特菌和大腸桿菌胞內外基因組的抑菌作用機制

吳漢東,黃云坡,金嫘,查恩輝,孫晶,周銘懿

(錦州醫科大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121000)

為研究苯乳酸與食源性致病菌基因組的相互作用機制,選取單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes10403s)和大腸桿菌(E.coli44752)采用凝膠電泳阻滯實驗法和紫外-可見光譜法研究苯乳酸與胞內、胞外基因組DNA的作用機制。實驗結果表明苯乳酸與單增李斯特菌和大腸桿菌的胞內DNA遷移率和條帶亮度均未發生變化,無相互作用;苯乳酸對單增李斯特菌和大腸桿菌的胞外DNA發生結合作用。單增李斯特菌體外DNA在苯乳酸16～32 mmol/L濃度下,與苯乳酸發生結合作用，結合常數為9.16×105M-1；大腸桿菌體外DNA在苯乳酸2～16 mmol/L的濃度下,與苯乳酸發生結合作用,結合常數為7.36×105M-1。兩者的結合方式為靜電結合和嵌插結合。

苯乳酸,食源性致病菌,紫外光譜,結合作用

苯乳酸(phenyllactic acid,PLA),也稱β-苯乳酸或3-苯基乳酸,可以從蜂蜜和發酵食品中分離得到,是一種新型天然防腐劑[1-3]。2000年,Lavermicocca[4]等人從乳酸菌屬Lactobacillusplantarum21B代謝產物中分離得到苯乳酸,研究發現苯乳酸具有抑菌譜廣、水溶性好、易擴散和來源廣泛等天然優勢,被認為是繼從乳酸菌分離的第一代抑菌物質乳酸、醋酸,第二代抑菌物質如Nisin等細菌素之后,可用于食品體系的新型抑菌物質[2,4]。因此研究其抑菌機理為其更好的開發和應用打下理論基礎。

天然防腐劑是食品安全研究領域的熱點之一,具有高效、廣譜、安全等優點,在未來食品防腐劑中有很高的應用前景。抑菌機理是研究和開發新型天然防腐劑的理論基礎。當前抑菌機制的研究主要集中在細胞壁、細胞膜和酶系統,各種抑菌物質的抑菌機理各有不同[2]。苯乳酸是近年來發現的潛在防腐劑,早在1998年Dieuleveux[5]等就發現苯乳酸的抑菌靶位之一細胞壁,時隔十年2009年孟祥晨[1]課題組得到同樣的結論：細胞壁是苯乳酸的抑菌靶位。那么苯乳酸是否對核酸產生作用,細胞壁是否是苯乳酸的唯一作用位點,目前對此相關報道還很少,因此本文通過研究苯乳酸與食源性致病菌中單增李斯特菌(革蘭氏陽性菌:Listeriamonocytogenes10403s)和大腸桿菌(革蘭氏陰性菌:E.coli44752)基因組胞內和胞外的作用方式探究苯乳酸對核酸的作用機制,為進一步研究苯乳酸與食源性致病菌的抑菌機理打下理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苯乳酸(D-PLA) Sigma公司;單增李斯特菌(L.monocytogenes10403s),大腸桿菌(E.coli44752) 河北科技大學食品生物技術與安全實驗室保藏；細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型,DP302),緩沖液GA、GB、GD及漂洗液PW為產品成分簡稱;其他所用化學試劑 均為國產分析純。

梅特勒-托利多 上海有限公司:EL204分析天平 上海精密儀器有限公司:PHS-3C pH計 美國Bio-rad公司:170-4405EDU瓊脂糖水平電泳儀 美國Thermo公司:Evolution 220紫外分光光度計 美國Wealtec公司:Dolphin-DOC凝膠成像系統。

1.2 實驗方法

1.2.1 苯乳酸與細菌DNA的凝膠阻滯實驗

1.2.1.1 基因組DNA的提取 采用CTAB提取法提取食源性致病菌的DNA[6-7],步驟如下:

吸取1.5 mL對數期細菌溶液注入離心管中,8000 r/min離心5 min。

向沉淀中加入200 μL GA或者對于單增用溶菌酶進行破壁處理,具體方法為:加入180 μL緩沖液(20 mmol/L Tris,pH8.0,2 mmol/L Na2-EDTA,1.2% Triton);終濃度為20 mg/mL的溶菌酶(溶菌酶必須用溶菌酶干粉溶解在緩沖液中進行配制),37 ℃處理30 min以上。

加入4 μL RNaseA(100 mg/mL)溶液,振蕩15 s,室溫放置5 min。

向管中加入20 μL蛋白酶K,混勻;加入220 μL GB,于70 ℃水浴中靜置10 min,離心30 s。

加入220 μL無水乙醇,8000 r/min離心30 s除去管蓋內壁的水珠。

將上一步所得的溶液和沉淀都加入到套有收集管的吸附柱CB3中,12000 r/min離心30 s,棄掉液體,將吸附柱子CB3放回收集管中;向CB3中加500 μL的GD,12000 r/min離心30 s,棄掉液體,將吸附柱子CB3放回收集管中;向CB3中加700 μL的PW,12000 r/min離心30 s,棄掉液體,將吸附柱子CB3放回收集管中;向CB3中加500 μL的漂洗液PW,12000 r/min離心30 s,棄掉液體,將吸附柱子CB3放回收集管中;紫外檢測DNA溶液的濃度,OD260值為l相當于大約50 pg/mL雙鏈DNA,OD260/OD280比值應為1.7～1.9。

1.2.1.2 凝膠電泳法測定 苯乳酸與胞外食源性致病菌基因組DNA的相互作用 凝膠的制備:采用1%瓊脂糖(內加2 μL EB/10 mL膠,0.5 μg/mL溴化乙錠)(瓊脂糖的濃度跟分子量大小有關,根據單增DNA的分子量可以采用0.5%～1.0%瓊脂糖凝膠電泳)。0.5 g瓊脂糖溶于50 mL TAE中,加熱,攪拌均勻,倒板前先插好電泳槽和梳子,30 min左右晾干后點樣。

制樣:將苯乳酸與DNA溶液等體積混合得到相同DNA濃度下,苯乳酸濃度分別為1～32 mmol/L的終濃度作用0.5 h。

上樣:DNA混合物樣品中加入loading buffer,混勻后,加入到樣品孔中。點樣量為10 μL一個孔即可。

電泳:電泳壓力為95 V,時間為40 min。

成像:用凝膠成像分析系統記錄電泳結果。

分析:將凝膠成像系統拍下的圖像進行分析。

1.2.2 苯乳酸與食源性致病菌胞內DNA的凝膠電泳實驗 先將苯乳酸配成濃度為1、2、4、8、16 mmol/L的溶液,在該濃度下與革蘭氏陽性菌(L.monocytogenes10403s)革蘭氏陰性菌(E.coli44752)菌懸液相互作用1 h(菌體生長的延滯期),菌懸液濃度為1×108CFU/mL,作用條件為37 ℃恒溫箱中培養。將混合液離心,棄掉上清,用磷酸緩沖液懸起,采用CTAB法提取菌體DNA,進行凝膠電泳,成像分析,方法見1.2.1。

1.2.3 紫外光譜法測定苯乳酸與DNA的相互作用方式

1.2.3.1 苯乳酸紫外光譜檢出限的測定 采用紫外分光光度計(Evolution 220)紫外掃描測定不同濃度的苯乳酸溶液圖譜。波長范圍200～350 nm。

1.2.3.2 苯乳酸與DNA相互作用的紫外光譜法測定 不同濃度的PLA(0.25、0.5、1 mg/mL)與DNA(126.2 μmol/L)等體積混合后,在37 ℃下相互作用30 min,然后采用紫外光譜掃描法分析混合體系在200～350 nm下的紫外光譜;選取2.5 mg/mL濃度的PLA與DNA(126.2 μmol/L)等體積混合后,分別相互作用15、30、45 min、1、2、3 h后,同樣的掃描條件分析200～350 nm下的紫外光譜變化。

1.2.4 苯乳酸與DNA相互作用的紫外結合常數的計算 紫外吸收下的結合常數Kb是確定結合穩定性的一個指標,結合常數越大,表示結合越穩定,結合公式為:

式(1)

式(1)中,C:溶液中DNA的濃度(μmol/L);εα:結合狀態下DNA的摩爾吸光系數;εb:該濃度吸光值與抑菌劑的濃度的比值;εf:自由狀態下DNA的摩爾吸光系數;Kb:紫外的結合常數(M-1)[8-9]。

1.2.5 數據處理 每份樣品重復測定3次,取其平均值。以Origin(Origin Pro.8.0)作圖軟件對實驗數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 苯乳酸與基因組DNA的凝膠電泳實驗

2.1.1 苯乳酸與體外基因組的凝膠電泳實驗 不同濃度的苯乳酸對一定濃度的L.monocytogenes10403s和E.coli44752的體外DNA的凝膠電泳成像結果見圖1和圖2。凝膠電泳實驗中,遷移率是否改變說明PLA是否與DNA發生作用,相對分子質量影響遷移率,遷移率的改變與相對分子質量成反比[10],苯乳酸在16、32 mmol/L濃度下,L.monocytogenes10403s DNA條帶的遷移率與對照組相比有明顯的降低,亮度與對照組相比增加,相對分子質量有所增加,熒光強度有增加;苯乳酸在2～16 mmol/L濃度下,E.coli44752 DNA條帶的遷移率與對照組相比有明顯的降低,亮度與對照組相比隨著濃度的增加而增加。苯乳酸與體外DNA產生了一定的結合作用,并且隨著濃度的增加而結合作用越明顯。

圖1 苯乳酸與L. monocytogenes 10403s基因組體外作用后的凝膠電泳圖像Fig.1 Gel electrophoresis of PLA with different concentration interact with L. monocytogenes 10403s DNA in vitro注:從左至右,數字分別代表空白、32、16、8、4、2、1 mmol/L的苯乳酸與63.2 μmol/L DNA相互作用1 h。

圖2 苯乳酸與E. coli 44752基因組體外作用后的凝膠電泳圖Fig.2 Gel electrophoresis of PLA with different concentration interact with E. coli 44752 DNA in vitro注:從左到右,數字分別代表空白、1、2、4、8、16、32 mmol/L的苯乳酸與63.2 μmol/L DNA相互作用1 h。

2.1.2 苯乳酸與體內DNA的相互作用實驗分析 不同濃度的苯乳酸對一定濃度的L.monocytogenes10403s和E.coli44752菌體的體內DNA凝膠電泳成像結果見圖3和圖4。可以看出,實驗組2～6與對照組1相比較,條帶的遷移率和亮度均無明顯變化,說明苯乳酸在與L.monocytogenes10403s和E.coli44752 菌體發生抑菌作用時,并未與體內DNA發生直接作用。前人研究苯乳酸能夠破壞單增李斯特菌的細胞壁[1],本實驗佐證了苯乳酸的抑菌機理與體內DNA無直接關系,完善了苯乳酸的抑菌作用機理。

圖3 苯乳酸與L. monocytogenes 10403s作用后提取DNA的凝膠電泳圖像Fig.3 Gel electrophoresis of PLA with different concentration interact with L. monocytogenes 10403s DNA注:1～6分別代表空白、1、2、4、8、16 mmol/L的苯乳酸與63.2 μmol/L DNA相互作用1 h。

圖4 苯乳酸與E. coli 44752作用后提取DNA的凝膠電泳圖Fig.4 Gel electrophoresis of PLA with different concentration interact with E.coli 44752 DNA注:1代表空白,2～6分別1、2、4、8、16 mmol/L的苯乳酸與63.2 μmol/L DNA相互作用1 h。

2.2 紫外分光光度法分析苯乳酸與單增李斯特菌和大腸桿菌基因組的結合方式

苯乳酸具有苯環的有機酸小分子,通過紫外的全波長掃描發現苯乳酸具有紫外吸收,如圖5所示。苯乳酸的紫外檢出限為10 μg/mL～10 mg/mL,峰值在257.1 nm處。

圖5 不同濃度的苯乳酸紫外分光光度計掃描光譜Fig.5 The ultravlolet spectrophotometer scanning spectrum by different concentrations of PLA 注:箭頭所指方向為苯乳酸濃度逐漸增加。

圖6 苯乳酸與L. monocytogenes 10403s DNA相互作用后的紫外光譜掃描Fig.6 UV spectroscopy scanning after PLA interact with L. monocytogenes 10403s DNA注:右上角圖為苯乳酸與DNA相互作用的結合常數；圖7同。

如圖6紫外光譜圖所示,DNA濃度不變的情況下,隨著苯乳酸含量的增加,260.0 nm處的紫外吸收值增加,產生增色效應,且峰值由260.0 nm微移動到257.8 nm處,有2.2 nm的藍移。

紫外結合常數的計算,如圖6、圖7中右上角的直線圖,采用式(1),通過不同濃度的DNA與一定濃度苯乳酸作用后,取其峰值吸光度值,計算得到C/(εα-εb)與C的線性關系,其斜率即為小分子物質與DNA的紫外結合常數,該結合常數一般在1×105～1×107之間,常數越大表示結合越穩定[8-9]。圖6為苯乳酸與L.monocytogenes10403s基因組的紫外光譜圖,其結合常數為9.16×105M-1。圖7為苯乳酸與E.coli4752基因組的紫外光譜圖,其結合常數計算為7.36×105M-1。

圖7 苯乳酸與E. coli 4752 DNA相互作用后的紫外光譜掃描Fig.7 UV spectroscopy scanning after PLA interact with E. coli 4752 DNA

3 討論

早在1992年,Yonezawa等人從鱟中提取一種天然抗菌肽tachyplesin對DNA發生結合作用[10];2013年,李莉蓉等人發現天然抗菌肽ppTG20衍生的P7對DNA也有結合作用[11]。本實驗從凝膠電泳結果中發現苯乳酸對DNA發生了作用從而使核酸的遷移率較對照組降低,這與MDpep9[12],茶多酚[13],天然多糖[14]和蜂蜜中的多酚提取物[15]與DNA作用的結果是一致的,值得注意的是,苯乳酸的酸性很強,在體外實驗中,32 mmol/L的濃度下,E.coli44752 DNA發生了完全降解,推測是低pH對核酸的降解具有輔助作用。通過凝膠電泳的結果我們很難判斷DNA與苯乳酸的結合方式,為了深入探討,我們采用了紫外光譜法來分析,發現苯乳酸與DNA 作用發生了增色效應和微小的藍移(260.0～257.8 nm),這與彭俊峰等人[16]的研究是一致的,根據Long理論,增色效應是該物質與DNA發生嵌插作用的標志,是小分子與DNA堿基相互作用的結果[17-19]。Muhammad Sirajuddin通過公式得到結合常數,客觀的提供小分子物質與DNA的結合能力判斷[20-21]。苯乳酸與DNA不僅發生了結合,且結合方式為靜電和嵌插結合,并可能伴隨著范德華力。

目前雖然已開發出了數十種天然食品抑菌劑,但是對食品抑菌劑的抑菌機理仍缺乏系統完整的理論基礎,需要分子生物學,醫藥化工等多門學科做指導。目前研究防腐劑的抑菌機理大多在細胞壁、細胞膜、酶系統、能量供應和抑制核酸合成等方面[22-24],研究其與核酸的相互作用是補充和完善抑菌機制的重要環節。

4 結論

苯乳酸對L.monocytogenes10403s體外DNA發生一定的結合作用,苯乳酸濃度16～32 mmol/L遷移率降低,隨著苯乳酸濃度的增加,條帶亮度有增加;苯乳酸對E.coli4752體外DNA發生一定的結合作用,苯乳酸濃度2～16 mmol/L遷移率降低,亮度隨著苯乳酸濃度的增加而增加。不同濃度的苯乳酸對L.monocytogenes10403s和E.coli4752菌體的體內DNA均未發生相互作用,凝膠電泳的條帶遷移率和明亮度與對照組一致。

紫外光譜法發現苯乳酸作用L.monocytogenes10403s和E.coli44752的DNA發生增色效應和微小的藍移(260.0 nm移動到257.8 nm),即苯乳酸與DNA發生了結合作用,結合方式為靜電結合和嵌插結合。得到苯乳酸與DNA的結合常數:苯乳酸與L.monocytogenes10403s基因組的結合常數為9.16×105M-1;苯乳酸與和E.coli44752基因組結合常數為7.36×105M-1。

[1]袁景環,貢漢生,孟祥晨.苯乳酸的抗菌作用及其抗菌機理的初步研究[J]. 食品工業,2009(5):14-17.

[2]李興峰. 乳桿菌生物合成苯乳酸的研究[D].無錫:江南大學,2008.

[3]Ryan LAM,Bello FD,Czerny M,et al.Quantification of Phenyllactic Acid in Wheat Sourdough Using High Resolution Gas Chromatography-Mass Spectrometry[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2009,57(3):1060-1064.

[4]Lavermicocca P,Valerio F,Evidente A,et al.Purification and Characterization of Novel Antifungal Compounds from the SourdoughLactobacillusplantarumStrain 21B[J]. Applied and Environmental Microbiology,2000,66(9):4084-4090.

[5]Dieuleveux V,Gueguen M. Antimicrobial Effects of D-3-Phenyllactic Acid on Listeria Monocytogenes in Tsb-Ye Medium,Milk,and Cheese[J]. Journal of Food Protection,1998,61(10):1281-1285.

[6]汪莉君,邵華. DNA加合物檢測技術研究進展[J]. 中國公共衛生,2008(2):187-188.

[7]汪莉君. DNA化學損傷機制模式的研究[D].濟南:山東省醫學科學院,2008.

[8]Dey S,Sarkar S,Paul H,et al.Copper(II)complex with tridentate N donor ligand:Synthesis,crystal structure,reactivity and DNA binding study[J]. Polyhedron,2010,29(6):1583-1587.

[9]Selim M,Chowdhury S R,Mukherjea K K.DNA binding and nuclease activity of a one-dimensional heterometallic nitrosyl complex[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2007,41(5):579-583.

[10]王鏡巖. 生物化學[M].北京:高等教育出版社,2008.

[11]Brogden K A,Antimicrobial peptides:pore formers or metabolic inhibitors in bacteria?[J]. Nat Rev Micro,2005,3(3):238-250.

[12]Li LR,Shi YL,Le GW. Antibacterial activity and mechanisms of a new peptide derived from cell-penetrating peptide][J]. Wei sheng wu xue bao. Acta microbiologica Sinica,2013,53(9):950-956.

[13]Tang YL,Shi YH,Zhao W,et al.Interaction of MDpep9,a novel antimicrobial peptide from Chinese traditional edible larvae of housefly,withEscherichiacoligenomic DNA[J]. Food Chemistry,2009,115(3):867-872.

[14]錢麗紅,陶妍,謝晶. 茶多酚對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌機理[J]. 微生物學通報,2010(11):1628-1633.

[15]He F,Yang Y,Yang G,et al. Studies on antibacterial activity and antibacterial mechanism of a novel polysaccharide fromStreptomycesvirginiaH03[J]. Food Control,2010,21(9):1257-1262.

[16]Brudzynski K,Abubaker K,Miotto D. Unraveling a mechanism of honey antibacterial action:Polyphenol/H2O2-induced oxidative effect on bacterial cell growth and on DNA degradation[J]. Food Chemistry,2012,133(2):329-336.

[17]彭俊峰,凌建亞,張晗星,等. 蟲草素與DNA作用的光譜研究[J]. 光譜學與光譜分析,2004(7):858-861.

[18]Huang R,Wang LR,Guo LH. Highly sensitive electrochemiluminescence displacement method for the study of DNA/small molecule binding interactions[J]. Analytica Chimica Acta,2010,676(1-2):41-45.

[19]Rauf S,Gooding JJ,Akhtar K,et al. Electrochemical approach of anticancer drugs-DNA interaction[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2005,37(2):205-217.

[20]李興峰,黃云坡,王志新,等. DNA:天然防腐劑抑菌作用的新靶位[J]. 中國食品學報,2015(4):130-135.

[21]Sirajuddin M,Ali S,Badshah A. Drug-DNA interactions and their study by UV-Visible,fluorescence spectroscopies and cyclic voltametry[J]. Journal of Photochemistry and Photobiology B:Biology,2013,124(0):1-19.

[22]李興峰,江波,潘蓓蕾,等. 產苯乳酸的乳酸菌分離篩選及菌種鑒定[J]. 食品與發酵工業,2007(2):1-4.

[23]Sikdar S,Mukherjee A,Ghosh S,et al. Condurango glycoside-rich components stimulate DNA damage-induced cell cycle arrest and ROS-mediated caspase-3 dependent apoptosis through inhibition of cell-proliferation in lung cancer,invitroandinvivo[J]. Environmental Toxicology and Pharmacology,2014,37(1):300-314.

[24]Lakshmipraba J,Arunachalam S,Riyasdeen A,et al.DNA/RNA binding and anticancer/antimicrobial activities of polymer-copper(II)complexes[J]. Spectrochimica Acta Part A:Molecular and Biomolecular Spectroscopy,2013,109(0):23-31.

[25]Ashwini Kumar K,Reddy KL,Vidhisha S,et al. Synthesis,characterization and DNA binding and photocleavage studies of[Ru(bpy)2BDPPZ]2+,[Ru(dmb)2BDPPZ]2+and[Ru(phen)2BDPPZ]2+complexes and their antimicrobial activity[J]. Applied Organometallic Chemistry,2009,23(10):409-420.

ThebacteriostaticmechanismofphenyllacticacidwithListeriamonocytogenesandEscherichiacoligenomeDNA

WUHan-dong,HUANGYun-po,JINLei,ZHAEn-hui,SUNJing,ZHOUMing-yi

(College of Food Science and Engineering,Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000,China)

The interaction between phenyllactic acid(PLA)and Foodborne pathogenic bacteria genome(Listeriamonocytogenes10403s andE.coli44752)invivo/vitrowas studied by agarose gel electrophoresis and UV spectra. The results showed that there was no apparent interaction between PLA and the intracellular DNA ofListeriamonocytogenes10403s andE.coli44752. The absorption UV spectra demonstrated that PLA could interact with bacterial genomic DNAinvitroin the manner of intercalation and groove binding. The binding constant K of PLA(16～32 mmol/L)was 9.16×105M-1forListeriamonocytogenes10403s and the binding constant of PLA(2～16 mmol/L)K=7.36×105M-1forE.coli44752.The combination of PLA with DNAinvitrodemonstrated that was static interaction and intercalation.

phenyllactic acid;foodborne pathogenic bacteria genome;ultraviolet spectrum;fluorescence spectrum;interaction

2017-03-22

吳漢東(1975-)，男，碩士，副教授，研究方向：動物性產品精深加工技術，E-mail:whd9518@163.com。

TS201.3

A

1002-0306(2017)23-0110-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.022