蠶蛹蛋白肽酶水解條件優化

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(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047;2.南昌大學食品學院,江西南昌 330047;3.廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所,廣東廣州510610)

蠶蛹蛋白肽酶水解條件優化

黃美佳1,2,程劍鋒2,戴燕2,楊帆1,2,徐玉娟3,鄒宇曉3,李欣1,2,*

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047;2.南昌大學食品學院,江西南昌 330047;3.廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所,廣東廣州510610)

為了降低蠶蛹過敏風險,提高蠶蛹優質蛋白利用價值并制備免疫活性肽,對蠶蛹蛋白進行了酶解優化。本文選用菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶和木瓜蛋白酶這5種酶對脫脂蠶蛹蛋白進行酶解。通過對小鼠脾細胞增殖和水解度的檢測,選取最佳蛋白酶。在此基礎上對最佳蛋白酶的四個單因素(酶和底物量,初始pH,水解溫度和底物濃度)進行優化,從而確定最佳的酶解條件。結果表明，5種蛋白酶中堿性蛋白酶對脫脂蠶蛹蛋白的酶解效果最好。對堿性蛋白酶進一步優化,通過Box-Behnken實驗和回歸分析獲得堿性蛋白酶酶解脫脂蠶蛹蛋白的最佳條件為加酶量=6.0%,溫度=55 ℃,酶解時間=2.00 h,pH=8.0,水∶底物=20∶1,測得的水解度為19.96%±1.02%,免疫活性OD490 nm為0.2512±0.0125。

蠶蛹蛋白,肽,酶解,優化

蠶蛹是一種化學成分含量較為復雜的蠶蛾的蛹,因其所富含人體必需的8種氨基酸且比例均衡[1],符合由世界衛生組織提出的氨基酸最佳組合模式[2],是一種優質的動物蛋白來源,在中國、韓國、日本、泰國和印度等亞洲地區成為了一種較受歡迎的食物[3-4]。此外,它還含有大量油脂[5]、多糖、溶菌酶和激素等生物活性類物質[6]以及鐵、鋅、銅、錳、硒等微量元素[7-8]。蠶蛹具有比較高的營養價值,因此可以將它作為一種生產具備生物活性功能產品的優質原料[9]。

蛋白酶水解蛋白質是指在一定的條件下斷裂蛋白肽鍵,將大分子蛋白水解成小分子肽段的過程,它可以對蛋白質進行特異性位點切割,最終使蛋白質肽鏈長度縮短、極性基團數目增加、疏水基團暴露和平均分子質量降低[10],形成較多的生物活性肽。它是一種具有特殊生理功能的氨基酸肽段,一般由幾個到數十個氨基酸組成[11]。脫脂蠶蛹蛋白富含18種氨基酸以及多種生物活性類物質[12],為了提高蠶蛹蛋白的利用價值,降低蠶蛹過敏風險且獲得活性肽,本文通過酶解優化制備具有特殊生理功能的生物活性肽,也為脫脂蠶蛹的免疫活性肽制備提供理論基礎。酶解可將蛋白分解成肽段,既能降低過敏的風險,又能獲得活性肽。王艷[13]等人研究表明不同蛋白酶水解后,蛋白的致敏性降低。Maria[14]等人研究發現胃腸蛋白酶酶解后,蛋白的潛在致敏性降低。優質的蠶蛹蛋白會引起部分人群過敏,使蠶蛹在食品領域的應用受到限制,本實驗將蠶蛹蛋白進行酶解優化,擴大其在食品領域的應用也為降低潛在致敏性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蠶蛹 廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究院;菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和風味蛋白酶(酶活均為20萬U/g) 南寧龐博生物工程有限公司;低分子量Marker 美國Thermo公司;鄰苯二甲醛 Sigma公司;DTT、考馬斯亮藍G250 上海生工;胎牛血清 美國Gibco公司;RPMI-1640細胞培養基 北京索萊寶公司;NaOH、HCl等常規化學試劑 均為國產分析純。

高速冷凍離心機 美國Thermo公司;TU-1901紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;HJ-A6恒溫磁力攪拌水浴鍋 常州邁科諾儀器有限公司;CO2細胞培養箱 日本三洋公司;Mode 1860酶標儀、PowerPac 3000電泳儀、Quantity One凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 最優蛋白酶的篩選 將蠶蛹清洗除油制備脫脂蠶蛹蛋白粉[15],蠶蛹清洗脫脂得到的蠶蛹蛋白粉,用考馬斯亮藍G250測定蛋白濃度為6.9 mg/mL。稱取一定量脫脂蠶蛹蛋白粉,用PBS(20 mmol/L磷酸鹽緩沖液)稀釋后攪拌均勻,用1 mol/L的NaOH(或1 mol/L HCl)調節體系酸度至各蛋白酶最適pH范圍,并于恒溫水浴器上攪拌加熱恒溫至設定溫度。迅速加入己準備好的蛋白酶(菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白酶)溶液進行酶解,酶解過程中不斷滴加HC1或NaOH溶液以保持體系恒定的pH,在水浴中反應15、30、60、90、120、150、180、240 min后取出,沸水浴滅酶10 min后得到蠶蛹蛋白酶解產物[16],冷卻后將酶解液的pH調至7.0,然后以8000 r/min轉速離心20 min,取上清液冷藏備用[17]。表1是說明書推薦的各蛋白酶在蒸餾水中酶解的最適條件以及酶活。

表1 各蛋白酶酶解最適條件Table 1 The optimum conditions of protease hydrolysis

1.2.2 水解度的測定 酶解過程中水解度的測定采用鄰苯二甲醛(OPA)法并加以改進[13,18]。具體方法為:以精氨酸作為標準品,繪制標準曲線。取400 μL樣品溶液加入到盛有3 mL OPA的離心管中,混勻5 s,避光反應2 min,同時做空白對照實驗,未水解樣代替,340 nm下測定吸光值,按標準曲線計算水解度如下:

h=(ht-hc)×DF

DH(%)=h/htot×100

式中,ht-樣品的吸光度從標曲上查得的濃度;hc-對照品(未水解樣品)的吸光度從標曲上查得的濃度;htot-全部酶解液的吸光度從標準曲線上查得的濃度;DH-樣品的水解度;DF-樣品的稀釋倍數。

1.2.3 酶解多肽對小鼠脾細胞增殖檢測 2只5周齡健康的18～20 g BAL B/C小白鼠,頸椎脫臼處死,置于消毒酒精中,10 min后在超靜臺中解剖分離出小鼠脾臟。然后碾碎并過100目尼龍細胞篩,加入10 mL不完全培養基RPMI-1640,轉移至15 mL離心管中,1000 r/min離心5 min后棄上清,重復2次。加入3～4 mL紅細胞裂解液,5 min后加入不完全培養基RPMI-1640重懸脾細胞,1000 r/min離心5 min棄上清,重復1次,加入含0.1 mg/mL胎牛血清的完全培養基RPMI-1640約2 mL。往0.15 mL 0.4%臺盼藍染色液中加入等體積的細胞懸液進行細胞計數。稀釋細胞濃度為1～2×106cell/mL后,加入到96孔無菌細胞培養板中。蠶蛹酶解液經0.22 μm微孔濾膜過濾除菌,以400 μg/mL濃度加入到細胞培養板中刺激脾細胞。同時設置陰性對照組(滅活的酶溶液)和空白對照組(生理鹽水)。培養72 h后每孔加入0.01 mL MTT溶液(0.5%,w/v),繼續在CO2細胞培養箱中培養4 h,1000 r/min離心10 min后小心吸去孔內培養液,每孔加入0.1 mL DMSO后置于搖床上低速振蕩10 min,使結晶物充分溶解。由酶標儀檢測490 nm處的OD值。另設一組陰性對照組和調零孔(不加細胞)。每組設5個復孔,實驗重復3次。

1.2.4 最優酶解條件的優化

1.2.4.1 初始pH對蠶蛹蛋白酶解制備活性多肽的影響 取2.5 g 蠶蛹蛋白于250 mL三角瓶中,加入50 mL緩沖液,混合攪拌均勻,使用1 mol/L的NaOH(或1 mol/L HCl)調節體系pH分別為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0,并于恒溫水浴器上攪拌加熱恒溫至設定溫度,50 ℃下分別加入E0/S0為5.0%的酶進行酶解,1.5 h后取出,滅酶后得到蠶蛹蛋白酶解產物,冷卻后將酶解液的pH調至7.0,然后以8000 r/min轉速離心20 min,取上清液冷藏備用。測定各酶解液的水解度和對淋巴細胞的增殖。

1.2.4.2 加酶量對蠶蛹蛋白酶解制備活性多肽的影響 取2.5 g 蠶蛹蛋白于250 mL三角瓶中,加入50 mL緩沖液,混合攪拌均勻,使用 1 mol/L 的NaOH(或1 mol/L HCl)調節體系酸度至各蛋白酶最適pH,并于恒溫水浴器上攪拌加熱恒溫至設定溫度。50 ℃下分別加入E0/S0為1.5%、3.0%、4.5%、6.0%、7.5%的酶進行酶解,1.5 h后取出,滅酶后得到蠶蛹蛋白酶解產物,冷卻后將酶解液的pH調至7.0,然后以8000 r/min轉速離心20 min,取上清液冷藏備用。測定各酶解液的水解度和對淋巴細胞的增殖。

1.2.4.3 料水比對蠶蛹蛋白酶解制備活性多肽的影響 取2.5 g蠶蛹蛋白于250 mL三角瓶中,分別與緩沖液以1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的比例,混合攪拌均勻,使用1 mol/L的NaOH(或1 mol/L HCl)調節體系酸度至各蛋白酶最適pH,并于恒溫水浴器上攪拌加熱恒溫至設定溫度。在50 ℃下加入E0/S0為5.0%的酶進行酶解,1.5 h后取出,滅酶后得到蠶蛹蛋白酶解產物,冷卻后將酶解液的pH調至7.0,然后以8000 r/min轉速離心20 min,取上清液冷藏備用。測定各酶解液的水解度和對淋巴細胞的增殖。

圖2 風味蛋白酶對脫脂蠶蛹蛋白的水解度和免疫活性的影響以及SDS-PAGE圖譜Fig.2 Effects of the degree of hydrolysis and immune activity of flavourzyme to hydrolyze the defatted silkworm pupa protein and SDS-PAGE patterns

1.2.4.4 水解溫度對蠶蛹蛋白酶解制備活性多肽的影響 取2.5 g蠶蛹蛋白于250 mL三角瓶中,加入50 mL緩沖液,混合攪拌均勻,使用1 mol/L的NaOH(或1 mol/L HCl)調節體系酸度至各蛋白酶最適pH,并于恒溫水浴器上攪拌加熱恒溫至設定溫度。分別在45、50、55、60、65 ℃下加入E0/S0為5.0%的酶進行酶解,1.5 h后取出,滅酶后得到蠶蛹蛋白酶解產物,冷卻后將酶解液的pH調至7.0,然后以8000 r/min轉速離心20 min,取上清液冷藏備用。測定各酶解液的水解度和對淋巴細胞的增殖。

1.2.5 Box-Behnken中心組合實驗設計 對pH、酶解時間(h)和水/底物三個因素設計Box-Behnken中心組合實驗,因素和水平表如表2所示。

表2 Box-Behnken中心組合實驗的因素和水平表Table 2 Factors and levels table of the Box-Behnken center combination experiment

1.3 數據處理

所有數據都以平均值的形式表示,每個測試都重復三次,結果采用SPSS statistical軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 最優蛋白酶的篩選

圖1為本實驗所選用的5種蛋白酶酶液和脫脂蠶蛹蛋白酶解前液以及PBS對小鼠脾淋巴細胞免疫活性在OD490處的吸光值。從圖1可知,5種蛋白酶液、脫脂蠶蛹蛋白酶解前液以及PBS對小鼠脾淋巴細胞的免疫活性均不高,統計分析表明,酶解前液與堿性蛋白酶、中性蛋白酶及菠蘿蛋白酶相比存在顯著性差異(p<0.05),這為后續的實驗提供了一個空白參考。近年來,李高揚[19]等人選用5種不同的酶酶解蠶蛹蛋白,以DPPH清除能力為指標對酶解過程進行分析。楊梅琳[20]選用6種蛋白酶對蠶蛹蛋白酶解,酶解后的多肽通過對其水解度和清除自由基的能力的測定來選擇最優酶。而本文通過測定水解度和免疫活性來確定最優條件。

圖1 不同蛋白酶液、脫脂蠶蛹蛋白酶解前液以及PBS的免疫活性Fig.1 The immunological activity of different protease solutions,pre-enzymatic hydrolysis of defatted silkworm pupa and PBS

圖3 菠蘿蛋白酶對脫脂蠶蛹蛋白的水解度和免疫活性的影響以及SDS-PAGE圖譜Fig.3 Effects of the degree of hydrolysis and immune activity of bromelain to hydrolyze the defatted silkworm pupa protein and SDS-PAGE patterns

圖4 堿性蛋白酶對脫脂蠶蛹蛋白的水解度和免疫活性的影響以及SDS-PAGE圖譜Fig.4 Effects of the degree of hydrolysis and immune activity of alkaline protease to hydrolyze the defatted silkworm pupa protein and SDS-PAGE patterns

圖5 木瓜蛋白酶對脫脂蠶蛹蛋白的水解度和免疫活性的影響以及SDS-PAGE圖譜Fig.5 Effects of the degree of hydrolysis and immune activity of papain to hydrolyze the defatted silkworm pupa protein and SDS-PAGE patterns

圖6 中性蛋白酶對脫脂蠶蛹蛋白的水解度和免疫活性的影響以及SDS-PAGE圖譜Fig.6 Effects of the degree of hydrolysis and immune activity of neutral protease to hydrolyze the defatted silkworm pupa protein and SDS-PAGE patterns

圖2～圖6分別為風味蛋白酶、菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶對脫脂蠶蛹蛋白在15、30、60、90、120、150、180、240 min時的水解度和免疫活性及SDS-PAGE圖譜(圖2中風味蛋白酶做了0 min時的SDS-PAGE圖譜,其他酶的0 min與其相同)。從圖中可以看出,風味蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶對脫脂蠶蛹蛋白的水解度明顯高于菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶,其中以堿性蛋白酶對脫脂蠶蛹蛋白的水解度略高于風味蛋白酶、中性蛋白酶。而對于酶解脫脂蠶蛹蛋白肽的免疫活性,堿性蛋白酶和中性蛋白酶明顯高于其他三種蛋白酶,其中堿性蛋白酶最大值略高于中性蛋白酶,綜合考慮水解度和酶解肽的免疫活性,本實驗選用堿性蛋白酶作為酶解脫脂蠶蛹蛋白的優勢酶。并由圖4可知,當酶解時間選用90 min時,酶解脫脂蠶蛹蛋白肽的免疫活性最強,因此,在后續的對酶解條件的初步優化過程中,我們將選用該酶解時間進行對其它實驗條件進行優化。采用SPSS statistical軟件分析得到:風味蛋白酶在酶解90 min時水解度與其他各時間都存在顯著性差異(p<0.05),免疫活性在60、90 min與150、180、240 min存在顯著性差異(p<0.05);菠蘿蛋白酶在酶解60、90 min與150、180、240 min的水解度存在顯著性差異(p<0.05),180 min時免疫活性與其他存在顯著性差異(p<0.05);堿性蛋白酶各時間的水解度均存在顯著性差異,90 min與其他各時間的免疫活性存在顯著性差異(p<0.05);木瓜蛋白酶60、90 min與150、180、240 min的水解度存在顯著性差異,免疫活性60 min與15、240 min存在顯著性差異(p<0.05);中性蛋白酶在90 min的水解度與其他存在顯著性差異,15 min免疫活性與其他存在顯著性差異(p<0.05)。

2.2 堿性蛋白酶酶解脫脂蠶蛹蛋白粉的初步優化

通過以上對幾種蛋白酶的酶解分析,選用堿性蛋白酶對其進行單因素實驗,且圖4確定堿性蛋白酶最佳酶解時間為90 min。劉旭輝[21]也用堿性蛋白酶通過單因素實驗得出蠶蛹蛋白肽酶解最優工藝條件。圖7～圖10分別為pH、加酶量、料水比和溫度對脫脂蠶蛹蛋白在90 min時堿性蛋白酶的水解度和免疫活性及SDS-PAGE圖譜。脫脂蠶蛹蛋白在pH7.0～9.0范圍內的水解度以及水解肽的免疫活性變化如圖7所示,由圖7可知,水解度以及水解肽的免疫活性都呈先上升后下降的趨勢,且在pH8.0處達到最大值。水解度在pH7.0、7.5與pH8.0時存在顯著性差異(p<0.05),免疫活性無顯著性差異。

脫脂蠶蛹蛋白在加酶量1.5%～7.5%范圍內的水解度以及水解肽的免疫活性變化如圖8所示,由圖8可知,水解度以及水解肽的免疫活均以先上升后平穩的趨勢,經過單因素實驗得出,堿性蛋白酶酶解脫脂蠶蛹蛋白的最優加酶量為6.0%。水解度和免疫活性均無顯著性差異。

脫脂蠶蛹蛋白在料水比1∶10～1∶30范圍內的水解度以及水解肽的免疫活性變化如圖9所示,由圖9可知,水解肽的免疫活性變化趨勢不明顯,略有先上升后下降的趨勢,且在料水比1∶20處略高于1∶15和1∶25,然而對于水解度則呈現明顯的先上升后下降趨勢,在1∶20處達到最大值。水解度在1∶20、1∶15、1∶25與1∶30存在顯著性差異(p<0.05);免疫活性不存在顯著性差異。由結果推斷當料水比過高時,蛋白濃度太高酶解表位可能疊在一起,影響其作用效果:當料水比過低時,酶濃度就會相應降低,影響其水解度。

最后一組(圖10)為脫脂蠶蛹蛋白在溫度45～65 ℃范圍內的水解度以及水解肽的免疫活性變化趨勢,由圖10可知,水解度以及水解肽的免疫活性對這區間溫度的變化并不十分明顯,總體有上升后下降的趨勢,經過此單因素實驗得出,堿性蛋白酶酶解脫脂蠶蛹蛋白的最優溫度為55 ℃。水解度在55 ℃與65 ℃存在顯著性差異(p<0.05),免疫活性均無顯著性差異。

圖7 不同 pH對脫脂蠶蛹蛋白的水解度和免疫活性的影響以及SDS-PAGE圖譜Fig.7 Effects of the degree of hydrolysis and immune activity of the defatted silkworm pupa protein at different pH conditions and SDS-PAGE patterns

圖8 加酶量對脫脂蠶蛹蛋白的水解度和免疫活性的影響以及SDS-PAGE圖譜Fig.8 Effects of the degree of hydrolysis and immune activity of the defatted silkworm pupa protein at different enzymatic contents and SDS-PAGE patterns

圖9 料水比對脫脂蠶蛹蛋白的水解度和免疫活性的影響以及SDS-PAGE圖譜Fig.9 Effects of the degree of hydrolysis and immune activity of the defatted silkworm pupa protein at the different proportion of substrate and water conditions and SDS-PAGE patterns

圖10 溫度對脫脂蠶蛹蛋白的水解度和免疫活性的影響以及SDS-PAGE圖譜Fig.10 Effects of the degree of hydrolysis and immune activity of the defatted silkworm pupa protein at the different temperature conditions and SDS-PAGE patterns

2.3 堿性蛋白酶酶解脫脂蠶蛹蛋白條件的進一步優化

因選用酶解溫度在55 ℃上下以及加酶量在6.0%上下對實驗結果影響不大,所以選用酶解時間、酶解pH和料水比三個因素作為優化的因素,以脫脂蠶蛹蛋白的水解度和免疫活性(OD490)作為結果值。Box-Behnken實驗[22-23]結果如表3所示,利用軟件Design-Expert 8.0對實驗數據進行二次多項回歸擬合,得到水解度R1和免疫活性R2對酶解時間(A)、酶解pH(B)和水/底物(C)三個因素的回歸方程:

R1=17.70+3.55A-0.71B-1.15C+0.42AB+0.16AC+0.59BC-0.061A2-1.12B2-2.03C2

R2=0.26+0.00714A+0.0000388B+0.000208C+0.00358AB+0.00463AC+0.00214BC-0.011A2-0.013B2-0.00798C2

表3 Box-Behnken 實驗設計和結果Table 3 Experimental design and results of Box-Behnken

由回歸分析結果(表4、表5)可知,水解度和免疫活性兩個回歸模型的p值均小于0.01,說明該模型具有高度顯著水平(p<0.01),水解度的相關系數為R2=0.9175,免疫活性的相關系數為R2=0.9076,這說明該兩個回歸方程的可信度高,水解度的失擬項p=0.3257>0.05以及免疫活性的失擬項p=0.3218>0.05,均為不顯著,說明該回歸方程的擬合度高。由模型的顯著性檢驗可知,對于水解度模型,酶解時間的一次項以及水與底物比的二次項為極顯著(p<0.01),水/底物的一次項以及pH的二次項為顯著(p<0.05);對于免疫活性模型,酶解時間的一次項和二次項以及pH和水/底物的二次項為極顯著(p<0.01)。由回歸方程R1和R2可知,三個因素A、B、C的一次項回歸系數的絕對值大小均為A>C>B,這說明酶解時間對堿性蛋白酶酶解脫脂蠶蛹蛋白的水解度以及免疫活性的影響最大,其次為水/底物,pH影響最小。

表4 水解度回歸分析Table 4 Regression analysis results of degree of hydrolysis

表5 免疫活性回歸分析Table 5 Regression analysis results of immune activity

根據圖11和圖12可知,酶解時間對于水解度的影響逐漸增加,而對酶解液的免疫活性則是先升高,而后下降,而對于pH和料水比,不管是對于水解度還是免疫活性,都呈拋物線形式,先升高后回落。

由軟件Design-Expert 8.0對兩回歸曲線的精確計算,得到堿性蛋白酶酶解脫脂蠶蛹蛋白的最佳工藝參數為:酶解時間=1.96 h,pH=8.03,料水比=1∶20.16,且在此最佳條件下,預測酶解脫脂蠶蛹蛋白的水解度為20.87%,免疫活性OD490為0.2598。為了驗證預測結果的準確性并方便實驗條件,在酶解溫度=55 ℃,加酶量=6.0%,酶解時間=2.00 h,pH=8.0,水∶底物=20∶1的條件下對脫脂蠶蛹蛋白進行了三次酶解實驗,測得的平均水解度為19.96%±1.02%;平均免疫活性OD490為0.2512±0.0125,與模型預測值的相對誤差在0.09%以下。因此,該響應面對酶解條件的優化準確可靠。

圖11 三因素對酶解脫脂蠶蛹蛋白的水解度三維響應面圖Fig.11 Three-dimensional response surface of three factors to the degree of hydrolysis of the defatted silkworm pupa protein注:A:固定水/底物為20∶1;B:固定pH為8.0;C:固定酶解時間為1.5 h。

圖12 三因素對酶解脫脂蠶蛹蛋白的免疫活性三維響應面圖Fig.12 Three-dimensional response surface of three factors to the immune activity of the defatted silkworm pupa protein注:A:固定水/底物為20∶1;B:固定pH為8.0;C:固定酶解時間為1.5 h。

3 結論

選用了5種不同的酶來酶解脫脂蠶蛹蛋白,綜合考慮水解度和酶解肽的免疫活性,選用堿性蛋白酶作為酶解脫脂蠶蛹蛋白的優勢酶。在單因素實驗的基礎上,通過Box-Behnken實驗和回歸分析,得出堿性蛋白酶酶解脫脂蠶蛹蛋白的最佳工藝參數為:加酶量6.0%,溫度55 ℃,酶解時間=2.00 h,pH=8.0,水∶底物=20∶1,在此條件下平均水解度為19.96%±1.02%;平均免疫活性OD490為0.2512±0.0125。酶解可將蠶蛹蛋白分解成小肽段,可能大量破壞其結合表位,既能降低過敏的風險,又能獲得活性肽。因此,實驗對蠶蛹蛋白的酶解條件對潛在致敏性的研究有重要意義,同時給低致敏蠶蛹食品提供一定的理論依據,為后續脫脂蠶蛹的免疫活性肽制備提供理論基礎。

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[22]金文剛,吳海濤,朱蓓薇，等.響應面優化蝦夷扇貝生殖腺多肽-Ca2+螯合物制備工藝[J].食品科學,2013,34(16):11-16.

[23]趙鴻霞,朱蓓薇,周大勇，等.響應面法優化牡蠣酶解工藝[J].大連工業大學學報,2010,29(6):421-425.

權威·核心·領先·實用·全面

Optimizationofthepeptidefromsilkwormpupaproteinbyenzymatichydrolysis

HUANGMei-jia1,2,CHENGJian-feng2,DAIYan2,YANGFan1,2,XUYu-juan3,ZOUYu-xiao3,LIXin1,2,*

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China;2.Department of Food Science,Nanchang University,Nanchang 330047,China; 3.Sericultural and Agri-Food Research Institute GAAS,Guangzhou 510610,China)

In order to reduce the risk of silkworm allergic reaction,to improve the use of high-quality protein and the preparation of immunoactive peptide,the enzymatic hydrolysis of silkworm pupa protein was optimized. For the preparation of immunoactive peptide,the five kinds of enzymes(bromelain,alkaline protease,neutral protease,flavourzyme,papain)were selected to hydrolyze the defatted silkworm pupa protein. By the detection of spleen cell proliferation and the degree of hydrolysis,the optimal enzyme were determined. On the basis of that,the optimal condition was identified with four singe-factors of hydrolysis(E0/S0,pH,temperature and substrate concentration). The results showed that alkaline protease was the optimal enzyme and the optimum conditions of defatted silkworm pupa protein by alkaline protease enzyme was as that of the amount of enzyme=6.0%,temperature=55 ℃,enzymolysis time=2.00 h,pH=8.0,water∶substrate=20∶1.The degree of hydrolysis was 19.96%±1.02% and immunoreactive OD490 nmwas 0.2512±0.0125.

silkworm pupa protein;peptide;enzymatic hydrolysis;optimization

2017-04-11

黃美佳(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：食品科學與工程，E-mail:1049850344@qq.com。

*通訊作者:李欣(1980-)，女，博士，教授，研究方向：食品生物技術，E-mail:zhizilixin@ncu.edu.cn。

2013年廣東省教育部產學研專項資金(2013B090600060)；國家高技術研究發展計劃(863計劃)(2013AA102205)； 國家自然科學基金青年科學基金項目(31260204，31301522)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)23-0092-08

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.019