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(1.山東理工大學實驗管理中心,山東淄博 255000;2.山東理工大學農業工程與食品科學學院,山東淄博 255000)
Nisin對印度樹膠可食性膜性能的影響
趙亞1,張平平2,石啟龍2,*
(1.山東理工大學實驗管理中心,山東淄博 255000;2.山東理工大學農業工程與食品科學學院,山東淄博 255000)
為提高印度樹膠(GG)可食性膜的抑菌性能,以乳酸鏈球菌素(Nisin)為抑菌劑,研究了Nisin的最低抑菌濃度及其抑菌能力;探討了Nisin添加量對GG可食性膜的抑菌特性、物理特性、力學性能與微觀結構的影響。結果表明,Nisin對金黃色葡萄球菌與枯草芽孢桿菌(G+菌)的抑菌效果優于對變形桿菌、大腸桿菌與銅綠假單胞菌(G-菌)。GG膜對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、變形桿菌與銅綠假單胞菌的抑菌效果隨著Nisin的添加而增加,但GG膜對大腸桿菌的抑菌效果受Nisin影響較小(p>0.05)。GG膜的厚度、表面疏水性與水蒸汽透過率隨Nisin添加量的增加而降低,Nisin添加量顯著影響膜的拉伸應力,而Nisin添加對膜的斷裂伸長率影響較小(p>0.05)。本文可為GG膜在食品貯藏保鮮中的應用提供理論依據。
可食性膜,乳酸鏈球菌素,抑菌特性,物理特性,力學性能
微生物生長繁殖是導致生鮮食品腐敗的主要原因之一。可食性涂膜保鮮技術因其有效降低食品表面微生物的生長、延緩食品腐敗變質而逐漸成為人們關注的焦點。Rooney[1]研究表明,可食性膜具有抑制微生物生長與降低pH的能力,能夠改善食品表面環境,減少微生物污染,延長食品的貨架期。可食性抑菌膜是在可食性成膜基質中加入天然抑菌類物質,使其持久防止和抑制多種腐敗菌的生長[2]。天然抑菌類物質中研究較多的是植物精油,盡管其具有較好的抑菌能力,但其中的芳香味物質會影響食品的感官特性。因此,選取一種既具有較好抑菌活性又不會影響產品風味的天然抑菌劑對可食性抑菌膜的制備至關重要。乳酸鏈球菌素(Nisin)是一種高效、無毒的天然食品防腐劑。關于Nisin抑菌機理,Engelke等[3]提出了“孔道形成”理論,即:Nisin可吸附于敏感菌細胞膜上,其C末端侵入膜內形成通透孔道導致細胞膜去極化以及ATP的流失,造成細胞內溶質滲出,細胞自溶而死亡。呂淑霞等[4]認為Nisin的作用位點為細胞膜,能夠破壞細胞膜的完整性。Zhang等[5]研究了不同塑化劑類型和濃度對印度樹膠膜特性的影響,結果表明:塑化劑類型與濃度顯著影響膜特性,甘油塑化效果優于山梨醇,印度樹膠在可食性膜的制備上有很好的應用前景。基于此,本文以印度樹膠、甘油為成膜原料,Nisin為抑菌劑,研究不同Nisin添加量對膜的抑菌性、水蒸氣透過率、表面疏水性與力學性能的影響,為可食性抑菌膜在食品保鮮中的應用提供理論基礎。
印度樹膠(GG)、Nisin(食品級) 購于上海權旺生物科技有限公司;菌種:大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、變形桿菌(Proteusvulgaris)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa) 山東理工大學生命科學學院提供;牛肉膏蛋白胨液體培養基(g/L) 牛肉膏3,蛋白胨10,氯化鈉5,蒸餾水定容至1 L,pH7.4~7.6;牛肉膏蛋白胨固體培養基(g/L) 牛肉膏3,蛋白胨10,氯化鈉5,瓊脂粉18,蒸餾水定容至1 L,pH7.4~7.6;2種培養基均在溫度121 ℃下高壓滅菌20 min,待用。
VS-840-1潔凈工作臺、YXQ-LS-75S11立式壓力滅菌器 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;THI-98A恒溫振蕩箱、DHG-9140A電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;T18 basic型高速分散機 德國IKA公司;1HP-5冷風干燥實驗機 青島歐美亞科技有限公司;SK3310LHC超聲波清洗器 上海科導超聲儀器有限公司;游標卡尺 無錫錫工量具有限公司;WSC-S測色色差計 上海儀電物理光學儀器有限公司;JGW-360A接觸角測定儀 承德市成惠實驗機有限公司;Instron 5969型萬能材料實驗機 美國Instron公司;Sirion200掃描電子顯微鏡 美國FEI公司。
1.2.1 菌懸液的制備 用無菌接種環從固體斜面培養基上挑取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌種子,接種到液體培養基上,置于37 ℃恒溫培養箱中富集培養24 h[6]。通過平板菌落計數得到菌落生成單位數為106CFU/mL的種子液,用于抑菌性實驗。
1.2.2 Nisin最低抑菌濃度 參照Iturriaga等[6]方法,略作改動。用無菌水配制質量濃度分別為12.5、25、50、100、200 mg/mL的Nisin溶液,各取1 mL注入無菌培養皿中,然后倒入9 mL冷卻后的牛肉膏蛋白胨固體培養基,混勻,靜置凝固后,取0.1 mL菌落數為106CFU/mL的菌液注入培養基并使其均勻分布于表面,干燥5 min后,37 ℃培養24 h。以完全沒有菌落生長的最低濃度為Nisin最低抑菌濃度(MIC)。
1.2.3 Nisin抑菌性能 采用濾紙片法。取1 mL細菌培養液(含菌量為106CFU/mL)注入培養基中,涂布平板后干燥5 min。在培養基中放置滅菌后的直徑為6 mm的濾紙片,吸取不同濃度的Nisin溶液5 μL均勻滴入濾紙片表面,以無菌水作為對照組,干燥5 min后,37 ℃培養24 h,測定抑菌圈直徑,每組做3個平行,結果取平均值。
1.2.4 膜的制備 參照Zhang等與Ali等[5,7]方法。將質量濃度為7.5 g/L的GG溶液40 ℃加熱60 min,冷卻至室溫。以GG固形物計,添加質量分數為30%的甘油并攪拌均勻,然后添加質量分數分別為0%、5%、10%、15%的Nisin,超聲波處理30 min,50 mL膜溶液倒入直徑為12 cm培養皿中,置于冷風干燥實驗機中,25 ℃干燥24 h,揭膜后于25 ℃、53%相對濕度(RH)下平衡2 d,用于膜性能測定。
1.2.5 膜的抑菌特性 采用抑菌圈法[8]。取1 mL細菌培養液(含菌量為106CFU/mL)注入培養基中,涂布均勻,干燥5 min。在培養基上貼直徑為6 mm含有不同Nisin添加量的抑菌膜,以不添加Nisin的膜為對照組,37 ℃培養24 h,測抑菌圈直徑,每組做3個平行,結果取平均值。
1.2.6 膜的物理特性測定
1.2.6.1 厚度 將膜折成4層,采用游標卡尺選4個點測其厚度,求平均值D。
1.2.6.2 接觸角 參照Jouki等[9-10]方法,略作改動。將膜裁成4 cm×4 cm,用微量進樣器吸取5 μL蒸餾水進行實驗。0°為液體,180°為絕干物體。接觸角越大,表面疏水性越強;反之,接觸角越小,親水性越強。每個膜樣品做6次平行實驗。
1.2.6.3 水蒸汽透過率 參照ASTM法測定[11]。將干燥器底部放入NaCl飽和溶液(25 ℃時,NaCl飽和鹽液平衡相對濕度為75%)。稱取3.00 g烘干后的CaCl2,放入完全干燥的稱量瓶中。將膜緊密覆蓋在瓶口,并用石蠟膜固定,放入盛有NaCl飽和鹽液的干燥器中,每隔2 h稱一次質量。
膜的水蒸汽透過率(water vapor permeability,WVP)按以下公式計算[9,11]:

式(1)
式中:D為膜厚度,mm;A為膜的面積,m2;Δm/Δt為膜在單位時間內的質量變化,g/h;ΔP為膜兩側的水蒸氣壓差,1.75355×103kPa。
1.2.6.4 力學性能 力學性能包括拉伸應力(tensile strength,TS)和斷裂伸長率(elongation at break,EAB),參照ASTM法測定[11]。將膜裁成1×10 cm2,設定夾距為5 cm,拉伸速度為1 mm/s。每組至少重復5次。TS與EAB的計算方法如公式(2)、(3)所示[12]:
式(2)
式(3)
式中:F為膜斷裂時的最大張力,N;L為膜的厚度,mm;W為膜的寬度,mm;l1為膜斷后的長度,mm,l0為膜斷裂前的長度,mm。
1.2.6.5 色澤 膜的色澤采用色差計測定。膜的色差(ΔE)與白度指數(WI)值的計算方法見公式(4)和(5)[9]:

式(4)
式(5)
式中:L、a和b為膜的參數值,L*、a*和b*為標準白板的值。
1.2.7 膜結構掃描電鏡分析 GG膜在45 ℃下干燥12 h。用刀將膜裁成2 mm×2 mm,分別以水平和垂直方向固定在樣品臺上,真空狀態下鍍金15 min。將樣品放入掃描電子顯微鏡中抽真空20 min,觀察膜的表面結構和截面結構[14]。

表2 Nisin質量分數對GG膜抑菌性能的影響Table 2 Effect of Nisin mass fraction on antimicrobial activity of GG films
注:“-”表示無抑菌效果。
實驗數據采用平均值±標準差表示,采用SPSS 19.0軟件進行方差分析。
MIC是測定抗菌劑抗菌活性大小的指標,測定Nisin的MIC,可為制備GG抑菌膜提供理論基礎。如表1所示,Nisin對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、變形桿菌的MIC的分別為100、50、200 mg/mL,而對大腸桿菌和銅綠假單胞菌雖然起到抑制作用,但其MIC明顯高于其它3種供試菌。根據MIC值可初步判斷Nisin對5種供試菌的抗菌活性大小為:枯草芽孢桿菌>金黃色葡萄球菌>變形桿菌,對大腸桿菌和銅綠假單胞菌的抗菌活性最小。

表1 Nisin的最小抑菌濃度Table 1 MIC of Nisin obtained by mixed culture method
注:“空白”為無菌水,“-”表示無菌生長,“+”表示菌體生長弱,“++”表示菌體生長較強,“+++”表示生長很強。
圖1為Nisin對5種供試菌抑菌能力的測定結果。可以看出,對照中各供試菌生長良好(濾紙片直徑為6 mm)。Nisin濃度為50~200 mg/mL時,對5種供試菌均表現出較好的抑菌效果,且抑菌效果隨Nisin濃度增加而逐漸增強。當Nisin濃度為200 mg/mL時,抑菌圈直徑達到最大。此時Nisin對5種供試菌抑菌圈直徑大小為:金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌>變形桿菌>大腸桿菌>銅綠假單胞菌。這是由于Nisin對革蘭氏陽性菌(G+)的抑菌效果高于革蘭氏陰性菌(G-)。G+和G-菌在結構上的差異主要表現在細胞壁結構上。G+菌細胞壁厚,肽聚糖含量豐富,但組成簡單;而G-菌的細胞壁比G+菌薄,肽聚糖含量少,但層次多且成分復雜,僅允許分子量小于600 Da的分子通過[4]。Nisin的分子量為3500 Da左右,無法正常通過革蘭氏陰性菌細胞壁作用于細胞膜使細菌裂解[4]。因此,Nisin對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌(G+菌)的抑菌效果優于對變形桿菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌(G-菌)的抑菌效果。

圖1 Nisin濃度對抑菌能力的影響Fig.1 Effect of Nisin concentration on antimicrobial activity of tested bacterias
抑菌劑的添加量會影響可食性膜的抑菌性[15]。Nisin添加量對GG膜抑菌性能的影響如表2所示。可以看出,GG膜本身對金黃色葡萄球菌有明顯抑制作用,而對其它4種供試菌抑制作用不明顯,其原因有待于進一步研究。隨Nisin添加量的增加,當膜與細菌直接接觸24 h后,對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、變形桿菌和銅綠假單胞菌的抑菌圈直徑逐漸增大;當Nisin添加量增加至15%時,抑菌圈直徑分別達到最大值。但Nisin的添加并沒有影響膜對大腸桿菌的抑菌效果,其原因有待于進一步研究。根據Nisin對5種供試菌的MIC值和抑菌能力的研究結果,Nisin對G+菌(金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌)的抑菌活性要明顯高于G-菌(大腸桿菌和銅綠假單胞菌)。由此可知,Nisin添加到GG膜中時,膜對大腸桿菌和銅綠假單胞菌的抑菌活性要明顯低于其它3種菌。

表3 Nisin質量分數對GG膜物理性能的影響Table 3 Effect of Nisin mass fraction on physical properties of GG films
注:同一列不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。
Nisin添加量對膜物理性能的影響如表3所示。可以看出,隨Nisin添加量的增加,膜的厚度從0.040 mm逐漸降低到0.033 mm,但Nisin添加量0~10%、5%~15%范圍內時,膜厚度隨Nisin添加量變化不顯著(p>0.05),這說明Nisin添加量會降低膜的厚度,但降低幅度不顯著,這可能是由于Nisin分子與GG膜基質分子間鍵合,導致膜結構更為緊實,因此厚度降低,這需要進一步探討。
接觸角大小反映膜的親水性強弱[9]。如表3所示,隨Nisin添加量的增加,膜的接觸角值由73.25°降到68°,表明膜的親水性有所增強。可能原因:Nisin作為一種小分子多肽,可與GG膜基質相容,其分子中的極性基團可打破GG膜中的大分子結構,使更多的親水基團暴露,故當接觸水分子時能迅速吸收水分子,從而導致接觸角值降低[9-10];Nisin比GG的親水性更強,這需要進一步驗證。GG膜的接觸角值均低于90°,說明膜具有部分潤濕性。
WVP是可食性膜的重要特性之一,膜的WVP值越小,阻濕性能越好。阻濕性決定了包裝材料能否達到預期的包裝效果[16-17]。如表3所示,與對照組相比,添加Nisin的膜的WVP值要低于對照組膜,但差異不顯著,只有添加15% Nisin的膜的WVP值顯著低于對照組膜。整體來看,隨Nisin添加量的增加,WVP值呈逐漸降低的趨勢,當Nisin添加量為15%時,WVP達到最小值4.187×10-11g/ms Pa。影響膜WVP的因素包括膜厚度、對水分子敏感性、微觀結構如結晶度[18]。Nisin的加入打破了原有的分子結構,形成了更多分子間相互作用力,得到更加堅固的晶態結構,所以WVP值降低[18]。相關研究表明,膜結構中的親水、疏水基團比例是影響WVP的因素之一,一般來說,親水基團越多,膜的親水性就越強,但膜的WVP值與親水性的關系并不一定呈正相關。Aguirre等[15]研究表明,黑小麥蛋白膜的WVP值隨牛至精油添加量的增加呈上升的趨勢,但差異不顯著(p>0.05)。Atarés等[19]對添加肉桂精油和生姜提取物的大豆分離蛋白膜的相關特性進行了研究,結果表明,兩種精油的添加并不能顯著降低膜的WVP值。劉婧等[20]以尼泊金酯為抑菌劑、殼聚糖為成膜基質,研究了尼泊金酯添加量對共混膜相關特性的影響,得出WVP值隨尼泊金酯濃度的增大呈先降低后升高的趨勢。綜上,可以看出,膜的WVP受到膜基質種類、添加物成分與濃度等因素影響,這些因素導致膜無定形/結晶態、親水/疏水基團比例改變,進而影響膜WVP值。
膜的顏色是影響其應用的一個重要因素,而塑化劑、成膜條件和貯藏環境是影響膜顏色的重要因素。GG膜的色澤參數如表3所示。a值隨Nisin添加量增加顯著降低,b值則隨Nisin添加量增加顯著增加,但是Nisin添加對膜L值無顯著影響。Nisin添加量可使膜的ΔE值顯著增加,WI值顯著降低。這可能是由于Nisin進入GG膜基質中,使膜的內部結構發生改變致使膜內組分的折射率發生改變,從而影響了膜的色澤。

圖2 Nisin質量分數對GG膜力學性能的影響Fig.2 Effect of Nisin mass fraction on mechanical properties of GG films
TS和EAB是評價包裝材料力學性能的重要指標,包裝材料需要具有一定的機械強度才能承受流動過程中的壓力,塑化劑、抑菌劑、抗氧化劑等成分的添加會對膜的力學性能造成不同程度的影響[21]。圖2為Nisin添加量對GG膜力學性能的影響。可以看出,膜的TS隨Nisin添加顯著增加至最大值,繼而隨著Nisin添加量增加而降低;膜的EAB值隨Nisin添加的增加變化不明顯(p>0.05)。成膜基質、成膜條件以及抑菌劑種類不同,添加物對膜特性的影響效果也不同。趙丹[22]研究了天然抑菌類物質的添加對玉米淀粉膜特性的影響,結果表明,殼聚糖、溶菌酶和肉桂精油的添加能有效提高膜的TS值和EAB值。鄒小波等[23]研究了不同來源的花青素對殼聚糖明膠復合膜相關特性的影響,結果表明添加25%玫瑰花青素的膜具有最高的拉伸強度值和最低的斷裂伸長率值,分別為27.03 MPa和37.66%。
膜的微觀結構反映了膜的均一性和致密性,一般而言,膜的均一性和致密性越高,其抗拉強度就越高[21,24]。根據圖3膜的表面形貌,可以看出,所有膜的表面都是均勻、光滑、連續的,沒有明顯的裂痕和孔洞出現。從膜的橫截面結構來看,所有膜都具有緊密而均一的橫截面形態,添加Nisin的膜的截面比對照組更加緊實,說明Nisin與膜的相容性很好。

圖3 Nisin質量分數對膜微觀結構的影響Fig.3 Effect of Nisin mass fraction on micro structure of GG films注:(a)對照膜表面;(b)對照膜截面;(c)10% Nisin-GG膜表面;(d)10% Nisin-GG膜截面。
Nisin的添加對GG膜的性能影響存在差異。添加Nisin可顯著提高GG膜的抑菌能力(p<0.05),降低膜的厚度、表面疏水性及WVP值。GG膜TS隨Nisin添加呈先增加而后降低趨勢(p<0.05),但EAB隨Nisin添加無顯著變化(p>0.05)。膜的b與ΔE值隨Nisin添加量的增加而升高,而a與WI值則隨Nisin添加量的增加而降低(p<0.05);但L值隨Nisin添加無顯著變化(p>0.05)。Nisin與GG分子具有較好的相容性。Nisin可用于制備可食性抑菌膜。
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《食品工業科技》
愿為企業鋪路、搭橋!
EffectofNisinonthepropertiesofediblefilmspreparedbygumghatti
ZHAOYa1,ZHANGPing-ping2,SHIQi-long2,*
(1.Experiment Management Center of Shandong University of Technology,Zibo 255000,China;2.School of Agricultural Engineering and Food Science,Shandong University of Technology,Zibo 255000,China)
In order to increase the antibacterial ability of gum ghatti(GG)film,lactic acid streptococcus(Nisin)was selected as a natural antibacterial agent in the test,and its minimum inhibitory concentration(MIC)and antibacterial ability were determined. The effect of Nisin on the antibacterial properties,physical properties,mechanical properties and microstructure were determined and analyzed. As a result,Nisin had better ability in inhibitingStaphylococcusaureusandBacillussubtilis(gram positive bacteria)than that ofProteusvulgaris,EscherichiacoliandPseudomonasaeruginosabacteria(gram negative bacteria). The antibacterial effect of GG film onStaphylococcusaureus,Bacillussubtilis,BacillussubtilisandPseudomonasaeruginosaincreased with the increase of Nisin,but not obvious effect was observed onEscherichiacoli. The thickness,surface hydrophobicity and water vapor permeability(WVP)values of films decreased with increasing Nisin concentration. Nisin concentration had significantly effect on tensile stress. However,Nisin concentration had little effect on the elongation at break of GG film(p>0.05). The results will provide theoretical basis for the application of GG edible film in food storage and preservation.
edible film;Nisin;antimicrobial property;physical property;mechanical property
2017-05-09
趙亞(1974-),女,碩士,實驗師,研究方向:農產品加工與貯藏,E-mail:zy0028014@sdut.edu.cn。
*通訊作者:石啟龍(1974-),男,博士,教授,研究方向:果蔬/水產品加工與貯藏,E-mail:qilongshi@sdut.edu.cn。
TS206.4
A
1002-0306(2017)23-0069-06
10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.015