探討PCR—RFLP檢測亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性與子癇前期發病機制的關系

姜欣　舒俊俊　舒如明

[摘要]目的 探討限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應（cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites，PCR-RFLP）檢測亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性與子癇前期發病機制的關系，為子癇前期的防治提供依據。方法 選取2016年5月～2017年6月我院收治的子癇前期患者100例（病例組）、健康孕婦500例（對照組）作為研究對象，進行亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性分析、基因多態性檢測，并進行血液生化指標分析，調查基本資料，進行因素分析。結果 病例組患者所有測序都獲得成功，對照組測序成功498例。兩組患者的基因型頻率、等位基因頻率比較，差異有統計學意義（P<0.05）。兩組患者的初中及以下文化水平、有計劃妊娠、有計劃控制飲食與補充營養、增補葉酸、補充過維生素D、營養不良等因素的例數比較，差異有統計學意義（P<0.05）。病例組患者的APPT低于對照組，Hcy高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。多因素分析采用Logistic回歸分析，結果提示，等位基因TT、增補葉酸、孕期有計劃的運動成為獨立危險因素（P<0.05），TT型與Hcy、APPT存在顯著相關性（P<0.05）。結論 亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性與子癲前期有關且存在獨立作用，可能與其可提高Hcy有關。

[關鍵詞]子癇前期；GC基因；基因多態性；發病機制

[中圖分類號] R714.245 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）11（b）-0086-04

[Abstract]Objective To investigate the restriction fragment length polymorphism polymerase chain reaction （cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites，PCR-RFLP） in testing the relationship between methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphism and the pathogenesis of pre eclampsia，provide the basis for the prevention and treatment of preeclampsia.Methods 100 preeclampsia （the case group） and 500 healthy pregnant women （the control group） from May 2016 to June 2017 treated in our hospital were selected as subjects to conduct polymorphism analysis of methylenetetrahydrofolate reductase gene and detect of gene polymorphism.Blood biochemical indexes were analyzed，basic data was investigated and factors were analyzed.Results All cases were successfully sequenced in the case group，and 498 cases were successfully sequenced in the control group.The genotype frequency and allele frequency of the case group were compared，and the differences were statistically significant （P<0.05）.The the number of junior high school degree and below level，planned pregnancy，planned to control diet and nutritional supplements，folic acid，vitamin D supplements，the proportion of malnutrition were compared，and the differences were statistically significant （P<0.05）.APPT in the case group was lower than that in control group，and Hcy was higher than that in control group，the differences were statistically significant （P<0.05）.Logistic regression analysis was used for multivariate analysis.The results showed that allele TT，folic acid supplementation and planned exercise during pregnancy were independent risk factors （P<0.05）.There was significant correlation between TT type and Hcy and APPT （P<0.05）.Conclusion Methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphisms are associated with preeclampsia and have independent effects，which may be related to the elevation of Hcy.endprint

[Key words]Preeclampsia；GC gene；Gene polymorphism；Pathogenesis

子癇前期是人類妊娠期特有疾病，發生率為7%～12%，我國平均為9.4%，嚴重威脅母嬰健康，是導致怒因死亡的主要原因之一[1]。子癇前期的病因尚未被闡明，可能與遺傳、免疫失衡、血管內皮損失、纖溶系統失衡、氧化應激、胰島素抵抗等因素有關。葉酸與鈣磷代謝、骨礦物化、免疫功能等因素關系密切，有報道顯示其與子癇前期關系密切，葉酸缺乏孕婦更容易出現子癇前期[2-3]。故，有理由認為葉酸代謝相關通路的基因及其多態性可能會影響子癇前期發生風險[4-5]。本研究選取我院收治的子癇前期100例、健康孕婦500例作為研究對象，進行亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性分析和基因多態性監測，分析基因多態性是否起到獨立作用，嘗試分析基因多態性與維生素D、子癇前期之間的關系，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2016年5月～2017年6月我院收治的子癇前期患者100例、健康孕婦500例作為研究對象。子癇前期患者100例納入病例組，年齡（29.4±2.5）歲，孕次（1.9±0.7）次，采血周（14.4±1.2）周。健康孕婦500例納入對照組，年齡（29.0±3.2）歲，孕次（1.8±0.5）次，采血周（14.2±1.5）周。納入標準：①臨床確診；②年齡18～45歲；③妊娠8～12周確認并建立圍生期保健卡對象；④成功分娩；⑤無認知精神障礙，否熱重大疾病史。排除標準：①軀體疾病或其他急慢性疾??；②懷孕前恐懼癥、強迫癥等精神心理疾病；③無法閱讀問卷的內容，無法配合調查。兩組一般資料比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。本研究經我院醫學倫理委員會審核及同意，患者均知曉本研究情況并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1血樣采集與其他指標分析 采血前夜22：00禁食，次日晨起8：00采血，采用真空采血法，采集肘部靜脈血5 ml，平均分為3份。1份不進行抗凝，先進行血脂監檢測，檢測患者總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）等指標。同時采用問卷調查方法，在產后調查孕婦的孕期保健情況，包括增補葉酸情況、維生素D補充情況、接觸毒害物質情況等。

1.2.2基因多態性分析 ①提取DNA：采用天根公司提供的DNA，按照說明書進行操作，監測DNA純度，取1 μl DNA樣本，采用紫外分光光度計測定DNA OD260 nm/280 nm值，在標準范圍1.7～2.0內為合格的樣本，可進行PCR檢查，否則需要重新提取。②PCR-RFLP檢測：通過dbSNP數據庫確定MTHFR多態位點相關信息，選擇內切酶在線分析軟件，選擇對應限制內切酶，進行PCR-RFLP檢測，MTHFR（rs4846049），引物序列F：5′-CCCCTTCAGTCACAAGTAGGTGG-3′，R：5′-CCTCC AGAGCCAGCCTGAGAC-3′，擴增片段長度177 bp。③提取凝膠中的目的DNA，進行PCR產物測序。PCR擴增條件：首先配置Superminx，混勻到反應管中，每管24 μl，加入DNA模版液1 μl。PCR反應體系總量50 μl，內含10×PCR緩沖液2.5 μl，10 mM dNTP混合液0.5 μl，50 mM MgCl2 0.8 μl，PrimerF（5 uM）1 μl，PrimerR（5 uM）=1 μl，DNA模板液1 μl，PlatinumR.Taq DNA聚合酶0.2 μl，滅菌蒸餾水補足至25 μl。PCR反應條件：94℃預變性2 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環30次，72℃終末延伸5 min，4℃保存。④PCR產物鑒定以及測序，2%瓊脂凝膠鑒定，采用DNA測序儀進行測序。

1.3觀察指標

比較兩組GC通路上不同位點的多態性結果。分析多因素分析中有統計學意義位點多態性是否起到獨立作用，起到獨立作用的位點多態性在糾正年齡等因素后，是否與維生素D等指標存在相關性[6]。

1.4統計學方法

采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗，多因素分析采用Logistic回歸分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1兩組患者基因型頻率、等位基因頻率的比較

病例組所有測序都獲得成功，溶解濃度0.10～0.25 μg/μl，DNA分子量>50 kb，對照組測序成功498例。兩組的基因型頻率、等位基因頻率比較，差異有統計學意義（P<0.05）（表1）。

2.2 Logistic回歸多因素分析

2.2.1兩組單因素分析

兩組的初中及以下文化水平、有計劃妊娠、有計劃控制飲食與補充營養、增補葉酸、補充過維生素D、營養不良等因素的例數比較，差異有統計學意義（P<0.05）（表2）。

2.2.2兩組患者各因素的比較

病例組APPT低于對照組、Hcy高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）（表3）。

將以上因素作為自變量，是賦值為2，否賦值為1，基因型頻率賦值方法CC=1，CT=2，TT=3，APPT、葉酸則采用原值賦值，以是否為子癇前期作為因變量，是賦值為2，否賦值為1，采用Logistic回歸進行多因素分析。結果提示，等位基因TT[OR=1.26，95%CI（1.54～1.46），P=0.014]、增補葉酸[OR=0.67，95%CI（0.42～1.10）]，孕期有計劃的運動[OR=0.47，95%CI（0.48～1.37）]成為獨立危險因素（P<0.05）。endprint

2.3 TT型與Hcy、APPT的相關性分析

經分析，TT型與Hcy、APPT存在顯著相關性（P<0.05）（表4）。

3討論

本研究結果提示，子癇前期是多因素共同作用的結果，與基因多態性、孕期保健情況等因素有關[7]。亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性與子癇前期發病存在顯著相關性，且起到了獨立的作用，等位基因TT[OR=1.26，95%CI（1.54～1.46），P=0.014]成為獨立危險因素（P<0.05）。TT型與Hcy、APPT存在顯著相關性（P<0.05）。提示，亞甲基四氫葉酸還原酶基因TT型可能對子癇前期起到促進作用，且可能與其能夠抬高HCY、誘導凝血功能紊亂有關[8-10]。有報道顯示，亞甲基四氫葉酸還原酶變異型會導致相關通路的阻塞，使血液中的同型半胱氨酸的濃度增加，從而引起血管壁損傷，誘發溶血[11]。同時還可能導致葉酸缺乏，引起一系列不良反應[12]。Meta分析也證實MTHFRC677T基因多態性與妊高癥、復發性自然流程有關，提示改基因多態性可能導致不良妊娠結局發生[13-15]。

綜上所述，亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性與子癲前期有關且存在獨立作用，可能與其可提高Hcy有關。

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（收稿日期：2017-08-28 本文編輯：孟慶卿）endprint