二甲雙胍治療多囊卵巢綜合征機制研究

蘆晨宇+秦培鋼++杜函妤++鄔海霞++古麗亞爾·艾合買提+艾麗霞++徐琦

[摘要] 目的 探討二甲雙胍在治療多囊卵巢綜合征（PCOS）中對Treg細胞和Th17細胞的作用及其機制。 方法 雌性Wistar大鼠45只，來曲唑灌胃建立PCOS大鼠模型，隨機抽取5只確立成模后，按完全隨機分組原則分為二甲雙胍組[300 mg/（kg·d）]、達英組[180 mg/（kg·d）]、二甲雙胍[300 mg/（kg·d）]與達英[180 mg（kg·d）]聯合治療組及模型組，每組10只；另選取10只大鼠作為對照組。成模后，各治療組采用相應藥物灌胃治療，模型組給予等量生理鹽水，均連續處理28 d，觀察各組大鼠每周體質量變化。蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察卵巢組織學變化，流式細胞術檢測脾臟中Treg細胞和Th17細胞數量及表型的改變，ELISA法檢測血清中IL-6和TGF-β水平，RT-PCR法測定卵巢組織轉錄因子Foxp3、ROR-γt的表達水平。 結果 模型組大鼠體質量、脾臟中Treg細胞、Th17細胞數量以及Treg/Th17比例、血清中IL-6及TGF-β水平以及卵巢組織中轉錄因子Foxp3的相對表達量顯著高于對照組（P < 0.05）；二甲雙胍組、達英組與聯合治療組體質量與模型組相比顯著降低（P < 0.05），與對照組比較差異無統計學意義（P > 0.05）；二甲雙胍組、達英組及聯合用藥組囊性擴張卵泡較模型組明顯減少；二甲雙胍組脾臟Treg細胞、Th17細胞、血清IL-6水平及卵巢組織中轉錄因子ROR-γt的表達水平較模型組顯著升高（P < 0.05），達英組及聯合用藥組脾臟Th17細胞、血清IL-6水平與模型組相比顯著降低（P < 0.05），而卵巢組織中轉錄因子Foxp3的表達水平較模型組顯著升高（P < 0.05）。 結論 二甲雙胍治療PCOS的作用機制可能是通過影響血清細胞因子IL-6表達水平，調節Treg、Th17細胞的數量及比例，進而改善卵巢組織微環境。

[關鍵詞] 多囊卵巢綜合征；Treg；Th17；二甲雙胍

[中圖分類號] R392.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）11（c）-0017-05

Study on the mechanism of Metformin in the treatment of polycystic ovary syndrome

LU Chenyu QIN Peigang DU Hanyu WU Haixia Aihemaiti·Guliyaer AI Lixia XU Qi

Basic Medical College， Xinjiang Medical University， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830011， China

[Abstract] Objective To investigate the therapeutic mechanism of Metformin on Treg cells and Th17 cells in polycystic ovary syndrome （PCOS）. Methods 45 female Wister rats were gavaged by Letrozole in order to develop PCOS， and randomly chosen 5 rats to confirm the establishment of model. Then rats were divided into Metformin group [300 mg/（kg·d）]， Diane group [180 mg/（kg·d）]， Metformin [300 mg/（kg·d）] combined with Diane [180mg/（kg·d）] group and model group， randomly， each group had 10 rats. The other 10 female rats were arranged as control group. PCOS rats were given corresponding drugs， while control group were administrated with physiological saline， the treatment period of all groups were 28 days. The weight changes of rats weekly were observed. Ovarian histological changes were examined by Yihong-hematoxylin staining （HE）. Flow cytometry was applied to delineate the phenotype of Treg cells and Th17 cells in spleen. ELISA was used to measure IL-6 and TGF-β in serum. The expression levels of Foxp3 and ROR-γt were measured by RT-PCR. Results The weight， the Treg and Th17 in spleen， Treg/Th17 ratio， the levels of IL-6 and TGF-β in serum， the expression of Foxp3 of PCOS model group were higher than control， with statistically significant difference （P < 0.05）. The weight of Metformin group， Diane group and combined group were similar to control group （P > 0.05）， but significantly lower than model group （P < 0.05）. The cystic dilated follicle in Metformin group， Diane group and combined group decreased significantly compared with the model group. Treg cells and Th17 cells in spleen， IL-6 and transcription factor ROR-γt in serum of the Metformin group were significantly higher than the model group （P < 0.05）. Th17 cells in spleen and IL-6 in serum of Diane group and the combined group were significantly lower than the model group （P < 0.05）， but the expressions of transcription factor Foxp3 in ovarian tissue were significantly higher than the model group （P < 0.05）. Conclusion Metformin treatment of PCOS may affect the number and proportion of Treg and Th17 cells by affecting the expression level of the serum IL-6， which can improve the microenvironment of ovarian tissue.endprint

[Key words] PCOS； Treg； Th17； Metformin

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一種常見于青春期及育齡婦女的內分泌紊亂性疾病，其主要表現為月經失調、持續性無排卵及不孕，常伴有肥胖、高胰島素血癥和胰島素抵抗等癥狀[1]。PCOS在我國的患病率約為6.5%，且有逐年升高趨勢[2]。研究表明，慢性炎癥能介導胰島素抵抗（IR）的發生發展，是PCOS可能的發病因素之一[3]。Tregs和Th17是新近發現的T細胞亞群，Treg能影響腫瘤及免疫生殖功能轉歸，Th17則通過分泌IL-17介導機體炎性反應，干預腫瘤發生和轉移，Treg/Th17細胞之間的平衡影響多種腫瘤和炎癥性疾病的發生發展[4]。二甲雙胍作為胰島素增敏劑，用于伴有胰島素抵抗的PCOS[5-6]，但其對Treg細胞和Th17細胞的作用機制尚不清楚。本研究擬通過建立PCOS大鼠模型，觀察二甲雙胍對Treg細胞和Th17細胞的影響，從而進一步深入探討二甲雙胍治療PCOS的可能機制，為臨床上該藥物的應用及配伍提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物造模與分組

健康雌性SPF級Wistar大鼠，6周齡，平均體重180 g，購自新疆醫科大學動物實驗中心，使用合格證號：65000700000624。55只大鼠適應性飼養3 d后編號，對照組10只，PCOS模型大鼠45只。PCOS模型大鼠給予來曲唑1 mg/（kg·d）連續灌胃30 d[7]，對照組正常飼養，每周記錄體質量變化。造模完成后隨機抽取5只大鼠，通過陰道涂片監測其動情周期、雙側卵巢病理組織學改變評價造模效果。隨后將成模大鼠按完全隨機原則分為二甲雙胍組[300 mg/（kg·d）]、達英組[180 mg/（kg·d）]、二甲雙胍[300 mg/（kg·d）]+達英[180 mg/（kg·d）]聯合用藥組及模型組，每組10只。各治療組分別使用相應藥物每日1次，連續灌胃28 d；模型組給予等量生理鹽水；對照組正常飼養，第28天檢測各組體質量后，處死大鼠，取卵巢，電子天平稱取質量。

1.2 實驗藥物與試劑

羧甲基醋酸纖維購自美國Sigma-Aldrich公司；來曲唑購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號：H1999 1001；二甲雙胍購自中美上海施貴寶制藥有限公司，批號：H20023370；炔雌醇環丙孕酮片（達英-35）購自拜耳醫藥保健有限公司，批號：J20140114。酶聯免疫試劑盒均購自Ebioscience公司；流式細胞術抗體、破膜劑和固定劑均購自美國eBioscience 公司；RNase-Free DNase I、TaKaRa SYBR？誖Premix Ex TaqTM Ⅱ購自天根生化科技有限公司。

1.3 儀器

流式細胞儀（LSRII，BD公司）；PCR擴增儀（Bio-Rad公司）；實時定量PCR儀（Bio-Rad公司）；熒光定量PCR檢測系統（MyiQTM2 Two color Real-Time PCR Detection，Bio-Rad公司）；全波段酶標儀（Bio-Rad公司）；倒置顯微鏡（Olympus）等。

1.4 HE染色

處死大鼠，取卵巢，多聚甲醛中固定24 h后進行脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，切片并進行HE染色，固定切片后，Ehrlich蘇木精染色15 min，鹽酸酒精溶液分色35 s，伊紅染色10 min，90%乙醇分色40 s，封片，置于倒置顯微鏡下觀察。

1.5 酶聯免疫吸附實驗

收集血清，按照ELISA試劑盒操作步驟進行IL-6和TGF-β檢測。用特異性抗體包被96孔板，4℃冰箱過夜，加封閉液封閉非特異性結合位點，洗滌3次后加標準品及待測血清，室溫孵育2 h，洗滌后加入相應酶標二抗，室溫1 h，洗滌后加入底物、顯色劑。酶標儀檢測450 nm處的吸光度（A）值。

1.6 流式細胞術

收集各組脾細胞懸液，分離獲得單個核細胞后熒光抗體染色：將1×106細胞中分別加入抗大鼠PE標記的CD3抗體、FITC標記CD4抗體、PE-cy7標記的CD25抗體或抗大鼠PE標記的CD3抗體、FITC標記CD4抗體進行表染，之后加固定劑孵育、離心，隨后加入破膜劑孵育20 min，離心后重懸細胞，分別加入抗大鼠PerCP-Cyanine 5.5標記的Foxp3抗體或PE-cy7標記的IL-17抗體，孵育20 min后離心重懸細胞；同時每個樣品管均設同型對照。樣品置于流式細胞儀上檢測，檢測結果以CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞、CD4+IL-17+Th17細胞亞群的數量以及Treg/Th17比值表示。

1.7 實時熒光定量PCR

卵巢組織中Foxp3、ROR-γt的引物設計參照genebank提供的引物序列：ROR-γt正鏈：5′-TCTGGAAGCTGTGGGATAGA-3′，負鏈：5′-GAGGAGCCTGTGGAGAAATAC-3′；Foxp3正鏈：5′-ACCGTATC？鄄TCCTGAGTTCCAT-3′，負鏈：5′-GTCCAGCTTGACCAC？鄄AGTTTAT-3′；GAPDH正鏈：5′-CCTCGTCTCATAGACAAGATGGT-3′，負鏈：5′-GGGTAGAGTCATACTGGA？鄄ACATG-3′，由上海生工生物有限公司合成。提取大鼠卵巢組織總RNA，PCR擴增后[13]，用凝膠成像系統行光密度掃描半定量，與GAPDH密度掃描值之比，作為評價mRNA相對表達量的指標。

1.8 統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。endprint

2 結果

2.1 各組大鼠造模后一般情況

造模12 d后，大鼠陰道涂片從規律動情周期轉變為無周期性，說明無排卵；對照組大鼠未出現動情周期改變。模型組大鼠平均體質量大于對照組（P < 0.05）；二甲雙胍組、達英組及聯合用藥組大鼠平均體質量較模型組顯著降低（P < 0.05），與對照組相比差異無統計學意義（P > 0.05）；各治療組大鼠體質量比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠卵巢質量比較及形態學觀察

卵巢大體可見，對照組卵巢色澤紅、表面光滑；模型組卵巢質量較對照組增大（P < 0.05），且組織表面較蒼白，可見大量囊狀卵泡。二甲雙胍組、達英組及聯合用藥組大鼠卵巢質量與模型組相比顯著減小（P < 0.05），且達英組及聯合用藥組卵巢質量與對照組相比顯著減小，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表1。

卵巢HE染色可見，模型組卵巢中卵泡數目較對照組明顯減少，卵泡多呈囊性擴張，閉鎖卵泡數目增多且直徑較大。二甲雙胍組、達英組及聯合用藥組囊性擴張卵泡較模型組明顯減少，各級卵泡和黃體數量顯著增加，顆粒細胞層增厚，白膜層變薄。見圖1。

2.3 各組大鼠脾臟中Treg及Th17數量及表型變化

模型組脾臟中Treg細胞、Th17細胞數量以及Treg/Th17比例較對照組顯著升高，差異有統計學意義（P < 0.05）。二甲雙胍組及聯合用藥組脾臟中Treg細胞、Th17細胞數量較對照組顯著升高（P < 0.05），其中二甲雙胍組Treg細胞數量較模型組升高，差異有統計學意義（P < 0.05）；達英組脾臟中Treg細胞及Th17細胞數量與對照組相比差異無統計學意義（P > 0.05），與模型組相比顯著降低，差異有統計學意義（P < 0.05）；二甲雙胍組及達英組Treg/Th17比例與對照組相比差異無統計學意義（P > 0.05），而與模型組相比顯著降低（P < 0.05）。見表2。

2.4 各組大鼠血清IL-6、TGF-β水平變化

模型組、二甲雙胍組大鼠血清中IL-6及TGF-β水平顯著高于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）；且二甲雙胍及聯合用藥組血清IL-6水平顯著高于模型組（P < 0.05）；達英組血清中IL-6水平與對照組相比差異無統計學意義（P > 0.05），但顯著低于模型組（P < 0.05）；聯合用藥組血清TGF-β水平與模型組相比顯著降低，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表3。

2.5 各組大鼠卵巢組織中轉錄因子Foxp3及ROR-γt的表達

模型組、達英組大鼠卵巢組織中轉錄因子Foxp3的相對表達量與對照組相比顯著增高，而轉錄因子ROR-γt顯著降低，差異有統計學意義（P < 0.05），且達英組轉錄因子Foxp3的相對表達量較模型組亦顯著升高（P < 0.01）。二甲雙胍組及聯合用藥組卵巢中轉錄因子Foxp3與ROR-γt的相對表達量與對照組及模型組相比均顯著升高（P < 0.05）。見表4。

3 討論

PCOS是育齡期婦女最常見的內分泌紊亂性疾病[8]，基于該疾病存在高雄激素血癥、胰島素抵抗及脂代謝異常等改變，目前治療主要以降低血清雄激素、改善胰島素抵抗為主要目標[9]。二甲雙胍是臨床上應用較為廣泛的胰島素增敏劑之一，可有效降低高胰島素血癥及胰島素抵抗[10]。達英-35可抑制雄激素分泌，加快其清除和代謝。研究表明，二甲雙胍聯合達英-35治療PCOS能有效改善患者激素水平和胰島素抵抗，從而改善臨床癥狀，提高排卵率、妊娠率及治療效果[11-12]。本研究應用二甲雙胍或/和達英干預PCOS大鼠結果顯示，二甲雙胍組、達英組與聯合用藥組大鼠體質量較模型組顯著降低（P < 0.05），與對照組無顯著性差異，說明二甲雙胍在改善胰島素抵抗、輔助改善高雄激素癥狀基礎上能夠有效降低體質量，但其與達英-35引起的體質量降低并無協同效應；同時二甲雙胍能夠使PCOS大鼠卵巢中擴張卵泡明顯減少，各級卵泡和黃體數量顯著增加。

有研究表明，PCOS可能是一種慢性炎癥，而機體Treg細胞和Th17細胞及其比例是反映體內免疫穩態的指標，其平衡失調與炎癥性疾病密切相關[13]。有研究顯示，PCOS患者外周血中Treg細胞含量降低[14]，Treg/CD4+T細胞比例[15]、Th17/CD4+T細胞比例[16]均明顯高于健康婦女，表明Treg/Th17失衡的狀態參與PCOS的發生發展[15]。本研究結果顯示，模型組大鼠脾臟中Treg細胞、Th17細胞以及Treg/Th17比率較對照組顯著升高；卵巢組織中Treg細胞轉錄因子Foxp3[17]較對照組顯著升高，而Th17細胞轉錄因子ROR-γt[18]較對照組顯著降低；提示PCOS模型中Treg/Th17平衡的破壞可能是其的重要發病機制之一。TGF-β和IL-6是Treg細胞和Th17細胞兩者之間的橋梁[19]。本研究顯示，模型組大鼠血清IL-6和TGF-β表達水平較對照組顯著升高（P < 0.05）；二甲雙胍組與達英組均可通過調節TGF-β和IL-6的表達水平來調控脾臟中Treg和Th17細胞，其中，達英組與對照組相比細胞因子IL-6、TGF-β、脾臟中Treg細胞、Th17細胞、Treg/Th17比例無顯著性差異，提示其對細胞因子及Treg及Th17的調控是其治療PCOS的作用機制之一。二甲雙胍組IL-6的表達水平明顯高于模型組，同時脾臟中Treg、Th17細胞數量、卵巢組織中轉錄因子Foxp3、ROR-γt較模型組相比增加顯著，提示二甲雙胍組可能通過IL-6、TGF-β的表達水平調控機體Treg細胞及Th17細胞的數量，使Treg/Th17的比例與對照組相似，從而影響PCOS的發生及轉歸，同時提示達英與二甲雙胍可能通過不同的作用機制調節機體Treg/Th17細胞平衡。而IL-2、干擾素-γ等炎性因子主要與Th1/Th2細胞及其分化有關，本研究并未涉及[20]。由于卵巢組織中只檢測了Treg和Th17細胞轉錄因子mRNA的表達水平，尚未了解其蛋白分泌情況，所以對于藥物對卵巢的影響還需進一步的分析確證。endprint

綜上所述，二甲雙胍可降低PCOS大鼠體質量，減輕卵巢組織病理變化，其作用機制可能是通過影響血清細胞因子IL-6表達水平，調節Treg、Th17細胞數量及比例，進而改善卵巢組織微環境。本研究初步探討了二甲雙胍在治療PCOS中對Treg/Th17的影響，為臨床進一步尋找治療PCOS新策略及利用二甲雙胍治療提供了理論依據。

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（收稿日期：2017-07-20 本文編輯：程 銘）endprint