益腎祛濁方對PCOS—IR大鼠Ghrelin、SHBG及VF的影響

張曉丹+++蔡云+++許昕

[摘要] 目的 探討益腎祛濁方對多囊卵巢綜合征胰島素抵抗（PCOS-IR）模型大鼠胃動素相關肽（Ghrelin）、性激素結合球蛋白（SHBG）及血清內脂素（VF）水平的影響。 方法 將84只6周齡SD雌性大鼠完全隨機化分組分為7組，每組各12只，具體如下：空白組、模型組、益腎祛濁方高劑量組、益腎祛濁方中劑量組、益腎祛濁方低劑量組、益腎組及二甲雙胍組。造模成功后，灌服不同劑量益腎祛濁方或益腎方（益腎祛濁方高劑量組6460 mg/kg，益腎祛濁方中劑量組3230 mg/kg，益腎祛濁方低劑量組1615 mg/kg，益腎組1400 mg/kg，空白組灌服生理鹽水），以二甲雙胍作對照，觀察用藥后各組大鼠Ghrelin、SHBG及VF水平的變化。 結果 模型組Ghrelin水平較空白組顯著降低（P < 0.05），益腎祛濁方各劑量組及益腎組Ghrelin水平較模型組升高，差異有統計學意義（P < 0.05）。模型組SHBG水平較空白組降低（P < 0.05），各治療組SHBG水平較模型組升高，差異有統計學意義（P < 0.05）。模型組VF水平較空白組升高（P < 0.05），各治療組VF水平較模型組降低，差異有統計學意義（P < 0.05）。模型組睪酮（T）、黃體生成素/卵泡刺激素（LH/FSH）比值與空腹胰島素（FINS）較空白組顯著升高（P < 0.05），益腎祛濁方各劑量組T及LH/FSH比值較模型組降低，益腎組T水平較模型組降低，益腎祛濁方各劑量組及二甲雙胍組FINS較模型組降低，差異有統計學意義（P < 0.05）。 結論 益腎祛濁方能通過改善PCOS-IR模型大鼠的胰島素抵抗相關因子，抑制雄激素合成增加，恢復機體糖、脂代謝平衡，遏制PCOS-IR的惡性循環，達到治療PCOS-IR的目的。

[關鍵詞] 多囊卵巢綜合征胰島素抵抗；益腎祛濁方；胃動素相關肽；性激素結合球蛋白；內脂素

[中圖分類號] R711.75 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）11（c）-0009-05

Effects of Yishen Quzhuo Decoction on the expression of Ghrelin， SHBG and VF in rats with PCOS-IR

ZHANG Xiaodan1 CAI Yun2 XU Xin1

1.Department of Gynecology， Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University， Beijing 100010， China； 2.Department of Gynecology， Beijing Tongzhou Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Beijing 100142， China

[Abstract] Objective To observe the effects of Yishen Quzhuo Decoction on the expression of Ghrelin， sex hormone-binding globulin （SHBG） and visfatin （VF） in rats with polycystic ovarian syndrome-insulin resistance （PCOS-IR）. Methods Eighty-four female SD rats aged 6-week old were completely randomized into 7 groups， with 12 rats in each group， the groups were as followed： blank group， model group， high dose of Yishen Quzhuo Decoction group， middle dose of Yishen Quzhuo Decoction group， low dose of Yishen Quzhuo Decoction group， Yishen group and Metformin group. After the model was established successfully， different doses of Yishen Quzhuo Decoction or Yishen Decoction were given by gavage （high dose of Yishen Quzhuo Decoction group： 6460 mg/kg； middle dose of Yishen Quzhuo Decoction group： 3230 mg/kg； low dose of Yishen Quzhuo Decoction group： 1615 mg/kg； Yishen group： 1400 mg/kg； blank group： normal saline）， Metformin was taken as control， the level changes of Ghrelin， SHBG and VF in rats of each group after medication were observed. Results The level of Ghrelin in the model group was significantly lower than that of blank group （P < 0.05）， while the levels of Ghrelin in each dose of Yishen Quzhuo Decoction group and Yishen group were significantly higher than that of model group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The level of SHBG in the model group was significantly lower than that of blank group （P < 0.05）， while the levels of SHBG in each treatment group were significantly higher than that of model group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The level of VF in the model group was significantly higher than that of blank group （P < 0.05）， while the levels of VF in each treatment group were significantly lower than that of model group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The levels of testosterone （T）， luteinizing hormone/follicle stimulating hormone （LH/FSH）， fasting insulin （FINS） were significantly higher than those of blank group （P < 0.05）， the levels of T， LH/FSH in each dose of Yishen Quzhuo Decoction group were lower than those of model group， the level of T in Yishen group was lower than that of model group， the levels of FINS in each dose of Yishen Quzhuo Decoction group and Metformin group were lower than that of model group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Yishen Quzhuo Decoction can improve the factors related to insulin resistance of rats with PCOS-IR， inhibit the increase of androgen synthesis， restore the balance of glycometabolism and lipid metabolism， contain the vicious circle of PCOS-IR， so as to achieve the purpose of treating PCOS-IR.endprint

[Key words] Polycystic ovarian syndrome-insulin resistance； Yishen Quzhuo Decoction； Ghrelin； Sex hormone-binding globulin； Visfatin

多囊卵巢綜合征（PCOS）是青春期及育齡期女性常見的內分泌和代謝紊亂性疾病，以稀發排卵或持續無排卵、高雄激素和/或高胰島素血癥、卵巢多囊樣變為主要特征，常見月經失調或閉經、不孕、多毛、肥胖、胰島素抵抗（IR）等[1]。IR是指各種原因使胰島素促進組織細胞對葡萄糖攝取和利用的效率下降，機體代償性分泌過多胰島素產生高胰島素血癥以維持代謝狀態所需血糖水平，是機體靶細胞對正常水平胰島素反應低下的一種病理改變[2]，特點為空腹血糖值正常而空腹胰島素（FINS）水平升高。1980年，Berger等[3]發現PCOS肥胖婦女血清胰島素與睪酮、雄烯二酮有明顯相關性，推測高胰島素血癥與PCOS發病有關。調查發現，PCOS患者IR發生率為50%～70%[4]。多項研究顯示，胃動素相關肽（Ghrelin）、性激素結合球蛋白（SHBG）、血清內脂素（VF）與PCOS-IR密切相關。本研究基于“沖脈隸于陽明”“腎主生殖”等中醫經典理論，在前期研究[5]及動物實驗[6]基礎上，進一步驗證益腎祛濁方（國家專利申請號20170368825.2）對PCOS-IR模型大鼠Ghrelin、SHBG、VF等IR相關因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

取84只6周齡SD雌性大鼠，體重約150 g，將其完全隨機化分為七組，每組12只，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，實驗動物合格證書編號：11401300038666；在北京市中醫研究所屏蔽動物房飼養，許可證編號：SCXX（京）2009-0017。

1.2 實驗用藥

鹽酸二甲雙胍腸溶片（北京利齡恒泰藥業有限公司，批號H11021560）；羥甲纖維素鈉（安徽山河藥用輔料股份有限公司，批號160301）；來曲唑（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號HI9991001）。

益腎祛濁方由續斷、桑寄生、敗醬草等12味中藥組成。制備成中藥水煎劑，按成人用量折算成大鼠用量（每天正常人給藥劑量/成人體重×6.25，默認成人體重60 kg），設為中劑量（3230 mg/kg）。中劑量濃度為低劑量濃度的2倍（6460 mg/kg），高劑量濃度為中劑量濃度的2倍（1615 mg/kg）。益腎方由續斷、桑寄生等6味中藥組成，制備成中劑量以作對照（1400 mg/kg）。

1.3 實驗試劑

Ghrelin酶聯免疫試劑盒（Phoenix Pharmaceuticals，貨號PK-031-31）、SHBG酶聯免疫試劑盒（CLOUD-CLONE CORP，貨號SEA396Ra）、VF酶聯免疫試劑盒（CLOUD-CLONE CORP，貨號SEA638Ra），卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、睪酮（T）、FINS放射免疫試劑盒，由北京北方生物技術研究所有限公司提供。

1.4 造模方法

參考蔡云等[7]的來曲唑聯合高脂飼料造模法，建立PCOS-IR大鼠模型。該實驗結果顯示：來曲唑聯合高脂飼料喂養大鼠30 d，大鼠體重顯著增加，血清T、LH/FSH比值、FINS等均異常升高，空腹血糖值正常，大鼠卵巢可見多囊樣改變，所有數據符合PCOS-IR典型病理特征，證實造模成功。

1.5 治療方法

七組大鼠分組情況如下：空白組、模型組、益腎祛濁方高劑量組、益腎祛濁方中劑量組、益腎祛濁方低劑量組、益腎組、二甲雙胍組。造模成功后，各治療組大鼠給予相應劑量藥物灌胃，空白組及模型組大鼠給予等量生理鹽水灌胃，連續灌服15 d。其間空白組大鼠予普通飼料喂養，其余各組大鼠予高脂飼料喂養。

1.6 觀察指標

各組大鼠于灌胃結束后禁食水24 h后，以2%戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g）腹腔注射麻醉，取大鼠腹主動脈血，離心并收集血清。Ghrelin、SHBG、VF等均用酶聯免疫吸附法測定，嚴格按試劑盒說明書操作。

1.7 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件進行分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，組間比較用單因素方差分析。各指標經正態檢驗及方差齊性檢驗，符合正態分布及具備方差齊性，采用Tukey法作組間多重比較，方差不齊時用Dunnett T3法作組間多重比較。衡量變量間密切程度用Pearson相關性分析。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

所有實驗大鼠灌胃后，各項生命體征正常，試驗周期內無大鼠死亡。

2.2 益腎祛濁方對PCOS-IR大鼠Ghrelin、SHBG及VF的影響

模型組Ghrelin、SHBG水平較空白組降低，VF水平較空白組升高，差異有統計學意義（P < 0.05）。益腎祛濁方各劑量組及益腎組Ghrelin水平較模型組升高，差異有統計學意義（P < 0.05）；益腎祛濁方高劑量組Ghrelin水平較二甲雙胍組明顯升高，差異有統計學意義（P < 0.05）。各治療組SHBG水平較模型組升高，差異有統計學意義（P < 0.05）；各治療組VF水平較模型組降低，差異有統計學意義（P < 0.05）；益腎祛濁方中劑量組及益腎組VF水平較二甲雙胍組顯著降低，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.3 益腎祛濁方對PCOS-IR大鼠T、LH/FSH、FINS的影響

模型組T、LH/FSH及FINS水平較空白組明顯升高，差異有統計學意義（P < 0.05）。益腎祛濁方各劑量組及益腎組T水平明顯低于模型組；益腎祛濁方各劑量組LH/FSH比值明顯低于模型組；益腎祛濁方高劑量組、益腎祛濁方中劑量組及二甲雙胍組FINS水平明顯低于模型組，差異有統計學意義（P < 0.05）。二甲雙胍組各激素指標與模型組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見表2。endprint

2.4 Ghrelin、SHBG、VF與T、LH/FSH及FINS的相關性

2.4.1 空白組及益腎祛濁方各劑量組Ghrelin與T水平顯著相關；模型組、二甲雙胍組、益腎組Ghrelin與T水平無顯著相關性。各組SHBG與T水平顯著相關。各組VF與T水平無顯著相關性。見表3。

2.4.3 空白組、益腎祛濁方各劑量組及益腎組Ghrelin與FINS水平顯著相關。各組SHBG與FINS水平無顯著相關性?？瞻捉M、益腎祛濁方各劑量組及二甲雙胍組VF與FINS水平顯著相關，益腎組VF與FINS水平無顯著相關性。見表5。

3 討論

自1980年Berger首次提出IR參與PCOS發病，研究證實IR是PCOS發病的中心環節和致病基礎[9]。西醫治療PCOS-IR首選二甲雙胍，該藥通過促進腸道對葡萄糖的吸收，抑制糖原分解，減少肝糖原異生，提高外周組織對葡萄糖的敏感性[10]。二甲雙胍治療PCOS-IR，可降低胰島素水平，糾正高雄激素血癥，改善排卵功能，但遠期效果不夠理想，且伴有胃腸道不良反應[11]。中醫藥治療PCOS，可顯著降低睪酮水平，恢復月經周期，提高患者排卵功能，療效優于達英-35，且不良反應少[12]。本研究提示，益腎祛濁方對PCOS-IR模型大鼠具有良好的治療作用，療效優于二甲雙胍。

Ghrelin是一種具有強促生長激素釋放功能的活性多肽，在中樞、卵巢及胃腸道發揮多種調控作用[13-14]。研究證明，PCOS患者經治療后，血FINS水平明顯下降，而Ghrelin水平顯著升高[15]，由此可知FINS與Ghrelin之間存在負相關關系。SHBG能特異性結合并轉運性激素，調控性激素濃度，影響其生物利用度[16]。血中性激素水平可影響SHBG在肝臟的合成過程[17]，LH異常升高可刺激卵泡膜細胞產生過多雄激素，高濃度睪酮抑制肝臟合成SHBG；SHBG缺乏會導致游離睪酮增多，進而轉化為過多雌酮，E1>E2反饋性刺激LH分泌增多，誘發高胰島素血癥，形成惡性循環。VF是一種脂肪細胞因子，具有類胰島素的降糖活性[18-20]，參與組織局部炎性反應等。VF可促使脂肪細胞分化和存儲以調節脂代謝，通過類胰島素樣作用調節糖代謝[21]。現有研究認為，PCOS與全身低度反應炎癥有關，是一種慢性炎癥過程[22]，而PCOS-IR是PCOS發展到代謝紊亂的嚴重階段，VF水平升高，也是PCOS-IR的重要病機之一。

根據PCOS-IR的特征及證候，中醫婦科學將其歸屬于“閉經”“不孕”“崩漏”等范疇。本病以腎虛、脾虛痰濕、陽明濁熱蓄積等病機為主，涉及三焦、胃腸、腎等多個臟腑；本研究治法為補腎健脾，祛濁調經。前期實驗結果證實益腎祛濁方能夠改善PCOS-IR大鼠高雄激素血癥，糾正LH/FSH比值異常等內分泌紊亂狀態，降低FINS水平，改善卵巢多囊樣變，綜合療效較二甲雙胍更具優勢[6]。本研究結果提示，益腎祛濁方能使低水平Ghrelin升高，提高SHBG濃度，糾正高雄激素狀態，改善內分泌紊亂，恢復生殖軸功能；同時降低異常升高的FINS與VF水平，改善脂代謝及體內慢性炎癥狀態，遏制PCOS-IR高雄激素及高胰島素血癥糖脂代謝紊亂的惡性循環，達到治愈疾病的目的。通過分析各因子間相關性可證實，PCOS-IR破壞了機體內分泌與脂代謝平衡，益腎祛濁方可使性激素及IR相關因子恢復平衡狀態，且效果優于益腎方。鑒于Ghrelin與T和FINS的雙重顯著相關性，考慮其是兼能觀察內分泌和脂代謝紊亂與否的敏感指標。

[參考文獻]

[1] 喬杰.多囊卵巢綜合征[M].北京：北京大學醫學出版社，2009.

[2] 封全靈，律歡歡，張林東，等.胰島素抵抗與子宮內膜息肉發生的相關性研究[J].中國婦幼保健，2017，32（4）：665-668.

[3] Berger MJ，Taymor ML，Patton WC. Gonadotropin levels and secretory patterns in patients with typical and atypical polycystic ovarian disease [J]. Fertil Steril，1980，26（7）：619-626.

[4] Dumitrescu R，Mehedintu C，Briceag I，et al. The Polycystic ovary syndrome：an update on metabolic and hormonal mechanisms [J]. Med Life，2015，8（2）：142-145.

[5] 高征，許昕.益腎助陽活血化濁方加味對多囊卵巢綜合征患者卵巢多囊樣改變的影響[J].中國中醫藥信息雜志，2015，22（6）：35-38.

[6] 蔡云，許昕.益腎祛濁方對PCOS模型大鼠胰島素抵抗及性激素的影響[J].環球中醫藥，2017，10（6）：550-554.

[7] 蔡云，許昕.來曲唑聯合高脂飼料建立PCOS-IR大鼠模型實驗研究[J].首都醫科大學學報，2017，38（2）：244-248.

[8] Kafali H，Iriadam M，Ozardali I，et al. Letrozole-induced polycystic ovaries in the rat：a new model for cystic ovarian disease [J]. Arch Med Res，2004，35（2）：103-108.

[9] Farrell K，Antoni MH. Insulin resistance，obesity，inflammation，and depression in polycystic ovary syndrome：biobehavioral mechanisms and interventions [J]. Fertil Steril，2010， 94（5）：1565-1574.endprint

[10] 歐幸甘，覃秋萍.二甲雙胍治療多囊卵巢綜合征的臨床效果觀察[J].當代醫學，2010，16（26）：66-67.

[11] 高琳，孫臨華，蘇振麗，等.羅格列酮結合二甲雙胍對多囊卵巢綜合征胰島素抵抗指數的影響及臨床療效[J].現代生物醫學進展，2017，17（13）：2517-2520.

[12] 高征，許昕，梁靜翹.益腎助陽活血化濁法對多囊卵巢綜合征患者激素及排卵功能影響[J].環球中醫藥，2015， 8（6）：675-678.

[13] 張曉晨，崔璨.多囊卵巢綜合征患者GLP-1、Ghrelin、Obestatin的變化[J].東南大學學報：醫學版，2016，35（2）：275-278.

[14] 王煉煉，李聰，楊曦，等.Ghrelin基因在多囊卵巢綜合征患者卵巢顆粒細胞中的表達[J].重慶醫科大學學報，2015，40（2）：239-242.

[15] Shaker M，AL Mashhadani ZI，Mehdi AA. Effect of treatment with metformin on omentin-1，ghrelin and other Biochemical，Clinical Features in PCOS patients [J]. Oman Med J，2010，25（4）：289-293.

[16] 孫靜蕾，史惠蓉.性激素結合球蛋白與多囊卵巢綜合征的相關研究進展[J].中國計劃生育和婦產科，2015，7（12）：4-10.

[17] 王文清，王道娟，王勇.雄激素對卵巢顆粒細胞性激素結合球蛋白表達的調節[J].醫學研究生學報，2017，30（5）：453-458.

[18] 張妍，張慧英.內脂素在多囊卵巢綜合征中的研究進展[J].國際生殖健康/計劃生育雜志，2016，35（6）：506-509.

[19] 陳嫣，殷一紅.青春期多囊卵巢綜合征性激素和血生化水平與中醫情志證素的相關性研究[J].中國現代醫生，2016，54（33）：34-36，46.

[20] 李霞，彭璇，段娟，等.多囊卵巢綜合征患者的糖脂代謝特點分析[J].中國現代醫生，2016，54（12）：17-21.

[21] 李穎，翁錫全，林文弢.高脂飲食誘導胰島素抵抗模型大鼠血清內脂素變化[J].中國組織工程研究于臨床康復，2008，12（24）：4693-4696.

[22] 王澤.多囊卵巢綜合征與慢性炎癥因子[J].實用婦產科雜志，2014，30（5）：339-341.

（收稿日期：2017-08-04 本文編輯：張瑜杰）endprint