糖皮質激素治療對重癥肌無力患者Tfh細胞亞群的作用

趙旭

（遼寧省海城市中心醫院神經內二科，遼寧 海城 114200）

糖皮質激素治療對重癥肌無力患者Tfh細胞亞群的作用

趙旭

（遼寧省海城市中心醫院神經內二科，遼寧 海城 114200）

目的 觀察糖皮質激素治療前后對重癥肌無力患者Tfh細胞亞群的調控和影響。方法 選取2015年8月～2016年9月于本院由糖皮質激素治療顯著的患者30例以及健康對照組20例，采用流式細胞術的方法檢測對比健康對照組，同一患者治療前后外周血中CD4+T細胞CXCR5,ICOS以及轉錄因子Bcl-6的表達，ELISA的方法比較治療前后血清中細胞因子IL-21的表達水平。結果 ①與健康對照組相比，新發MG患者Tfh細胞顯著升高，而糖皮質激素治療后顯著降低；②新發MG患者相較于健康對照組，ICOS與Bcl-6表達顯著上調，而糖皮質激素治療后可以顯著降低ICOS的表達水平；③新發MG患者血清中IL-21水平顯著增加，糖皮質激素治療后IL-21的水平較治療前顯著下降。結論①Tfh細胞的失衡可能參與重癥肌無力的發病過程，其比例與MG的療效相關。②糖皮質激素可能通過影響Tfh細胞IL-21的表達抑制自身抗體的產生治療重癥肌無力。

Tfh細胞；重癥肌無力；糖皮質激素；IL-21

重癥肌無力（myasthenia gravis,MG）主要發生于神經肌肉接頭處的自身免疫性疾病，其發生機制是由于自身抗體與乙酰膽堿受體AChR或MuSK相結合導致神經肌肉傳導受損最終導致肌肉無力[1-2]，因此自身反應性的B細胞及其產生的病理性抗體在MG發生發展過程中扮演著重要的角色[3-4]。而自身免疫性抗體的產生離不開CD4+T細胞的輔助。

Tfh（Follicular helper T cells），是最近發現的輔助性CD4+T細胞亞群，它主要存在于次級淋巴組織中，在生發中心與B細胞相互作用促進B細胞的亞型轉化和抗體的產生。其分化依賴于轉錄因子Bcl-6，而發揮作用主要依賴于其產生的細胞因子IL-21[5-6]。Tfh細胞目前被報道參與多種自身免疫性疾病的發生[7-8]。糖皮質激素是重癥肌無力目前臨床上廣泛采用的方法，但其作用機制目前仍然未知。本文擬通過比較新發重癥肌無力與糖皮質激素治療后患者外周血中Tfh細胞亞群，表型，轉錄因子以及細胞因子的分泌，初步了解重癥肌無力中Tfh細胞亞群的變化與臨床指標的相關性，并進一步了解MG的發病機制，深入研究糖皮質激素的作用機理。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年8月～2016年9月于本院神經內科就診的確診為重癥肌無力患者30例，其中男19例，女11例，平均年齡（41.3±6.2）歲，納入標準[9]：①晨起暮重的典型的重癥肌無力臨床癥狀；②疲勞實驗及新斯的明實驗為陽性；③接受糖皮質激素治療后效果顯著者。排除標準：①在接受糖皮質激素治療前有過其它如免疫抑制劑或胸腺切除的治療史；②明顯肝腎功能不全者，嚴重感染（如HIV感染）、自身免疫性疾病以及惡性腫瘤者。另外納入20例同期于本院保健科接收健康體檢者作為正常對照，其中男12例，女8例，平均年齡（40.2±8.3）歲，兩組患者在性別和年齡統計上差異無統計學意義，且所有納入的患者均簽訂相應的知情同意書。

1.2 Tfh細胞的標記和染色 就診當天空腹采集納入重癥肌無力患者治療前和治療后以及健康對照組EDTA抗凝的靜脈血2 mL，分離外周血單個核細胞后，分別將購自BD公司的Alexa-488-anti-CXCR5，PE-anti-ICOS，PerCP-Cy5.5-anti-CD4對所分離的淋巴細胞室溫標記，20分鐘后對細胞進行固定、穿膜（利用購自eBiosciences的穿膜打孔試劑盒），取APC-anti-Bcl-6抗體室溫避光穿孔1 h后，加入200 μL Hank’s緩沖液重懸細胞，于BD FACS Calibur流式細胞儀上機檢測，并用Flowjo軟件對所得結果進行分析。

1.3 ELISA檢測血漿中IL-21表達水平 將上述采集的靜脈血離心后分離血漿，分裝至EP管中凍于-80℃冰箱保存，根據購自北京達科為公司的人IL-21 ELISA試劑盒說明書操作，檢測患者和健康對照組血漿中IL-21的表達水平。

1.4 統計學方法 應用SPSS 19.0軟件對所得的數據進行處理，計量資料采用“x±s”表示，組間比較采用t檢驗；計數資料用例數（n）表示，組間率（%）的比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 糖皮質激素治療后MG患者外周血Tfh細胞比例變化觀察新發MG患者與健康對照組相比，表1的結果顯示，外周血CD4+細胞中，CXCR5的表達水平顯著上調[（12.8±2.9）%vs（9.2±2.5）%]，且兩者之間差異具有統計學意義（P＜0.05）。糖皮質激素治療后MG患者與自身治療前相比，外周血中CXCR5的表達水平顯著下調，且差異具有統計學意義（P＜0.05）。

進一步觀察糖皮質激素治療對MG患者外周血Tfh細胞表型ICOS以及轉錄因子Bcl-6的表達的影響。相比于健康對照組，新發MG患者外周血CD4+細胞表面ICOS的表達顯著上調，而治療后，顯著下降。新發MG患者Tfh細胞轉錄因子Bcl-6的表達水平較對照組顯著升高，而治療后雖有下降趨勢，差異無統計學意義，見表1。

表1 糖皮質激素治療后Tfh細胞比例變化（x±s）Table 1 The Change of Tfh cells Percentage after Glucocorticoid Treatment(x±s)

2.2 糖皮質激素治療后血漿中細胞因子IL-21表達水平的變化 采用雙抗夾心法檢測MG患者治療前后血漿細胞因子IL-21的濃度，新發MG患者血漿中IL-21的濃度（210.8±80.3）pg/mL顯著高于對照組（85.8±50.9）pg/mL（P＜0.05）。治療后血漿中IL-21（160.5±60.2）pg/mL的表達水平顯著降低（P＜0.05），見表2。

表2 糖皮質激素治療后血漿IL-21表達水平的變化（x±s）Table 2 The Change of Plasma IL-21 after Glucocorticoid Treatment(x±s)

3 討論

濾泡輔助性T細胞作為最近新發現的輔助性T細胞亞群，在次級淋巴器官中可以誘導并輔助B細胞進入生發中心增殖分化形成漿細胞，并產生抗體[10]。研究發現，類風濕性關節炎，系統性紅斑狼瘡等自身免疫病中均會出現Tfh的數量或者功能發生異常，且增高程度也與自身免疫病的嚴重程度呈現正相關的關系[11-12]。國外通過動物模型和臨床樣本的實驗均發現，重癥肌無力患者中Tfh細胞的分化均出現異常，而病情緩解后，會伴隨著Tfh細胞比例恢復至正常水平[13-14]。

口服糖皮質激素目前廣泛應用于MG患者的臨床治療，其作用的主要機制是降低細胞因子的分泌和抑制抗原提呈，抑制淋巴細胞的增殖和分化。本文通過比較新發MG患者與健康對照組以及同一患者糖皮質激素治療前后Tfh細胞的比例、表型、轉錄因子Bcl6的表達以及血漿中IL-21的水平發現，新發MG患者中，相較于健康對照組，Tfh細胞比例，表面ICOS分子，轉錄因子Bcl6的表達顯著上調，而治療顯著后Tfh細胞明顯降低。暗示著Tfh細胞可能參與到重癥肌無力的發病過程中。

轉錄因子Bcl-6被報道可以參與促進Tfh細胞的分化，本實驗的結果發現，新發的MG患者Tfh細胞轉錄因子Bcl-6的表達相較于健康對照組顯著升高，而糖皮質激素治療后并降低Tfh細胞中轉錄因子Bcl-6的表達。而國內崔亞杰等最近研究發現，在口服潑尼松治療有效的MG患者中，外周血Bcl-6的mRNA表達水平顯著下調[15]。暗示著潑尼松的治療可能是通過抑制Bcl-6的表達抑制Tfh細胞的分化來抑制Tfh細胞產生，而我們的文章中糖皮質激素治療后雖然Bcl-6的表達水平呈現顯著下降的趨勢，但并未有顯著性差異，其是否是與潑尼松的作用機制相類似，還有待接下來進一步研究。

IL-21主要由Tfh細胞產生，促進B細胞發育成熟以及抗體的產生。在本實驗的研究中發現，新發MG患者血清中IL-21的水平顯著高于健康對照組，而糖皮質激素治療后顯著下降，暗示著糖皮質激素治療可能是通過抑制Tfh細胞產生IL-21，減少漿細胞的分化以及自身免疫性抗體的產生。

綜上所述，我們的研究發現Tfh細胞可能參與MG患者發病的過程，而糖皮質激素治療效果顯著的患者中Tfh細胞顯著降低，暗示著Tfh細胞的變化與臨床療效有顯著相關性。

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doi:10.3969/j.issn.1009-4393.2017.35.014

The Impact of Glucocorticoid Treatment on Tfh Cell in Myasthenia Gravis Patients

Zhao Xu
(Haicheng Central Hospital,department of internal neurology,Haicheng,Liaoning,114200,China)

Objective To explore the potential effects of glucocorticoid treatment on Tfh cell population in myasthenia gravis patients.Methods 30 patients newly diagnosed with myasthenia gravis and treated in our hospital as well as 20 healthy controls from Oct 2015 to Sep 2016 were given oral glucocorticoid treatment.Changes of CXCR5,ICOS and transcriptional factor Bcl-6 were determined by flow cytometry.Serum IL-21 was measured by ELISA.Results①Compared with healthy controls,the percentage of Tfh cells were significantly elevated and decreased after glucocorticoid treatment;②The expression of ICOS and Bcl-6 was significantly higher in MG patients compared with healthy controls,however,only the level of ICOS was significantly down-regulated after glucocorticoid therapy;③Serum IL-21 was significantly higher in MG patients compared with control littermates and glucocorticoid treatment could obviously returns to normal level.Conclusion①The imbalance of Tfh cells may take part in the pathogenesis of MG occurrence and correlated with clinical therapeutic outcome;②Glucocorticoid treatment may inhibit autoantibody production through inhibiting the secretion of IL-21 by Tfh cells.

Tfh cells;Myasthenia gravis;glucocorticoid;IL-21