酸性α—淀粉酶菌種產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

郭宏文　江成英　王路　郭建華　景艷　孫美佳

摘要：以從實(shí)驗(yàn)室白酒酒醅中分離篩選并經(jīng)誘變育種得到的高產(chǎn)酸性α-淀粉酶的菌株F21為試驗(yàn)對(duì)象，利用單因素及正交試驗(yàn)法進(jìn)行液態(tài)產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，結(jié)果表明，菌株F21的最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為麩皮20%、豆餅粉 15%、MgSO4·7H2O 005%、K2HPO4 01%，最佳培養(yǎng)條件：初始pH值為60、250 mL三角瓶中裝液量為30 mL、接種量為8%、40 ℃ 200 rmin搖床培養(yǎng)48 h，此時(shí)酶活性達(dá)到2 3059 UmL，比優(yōu)化前的初始酶活性（9873 UmL）提高 134 倍。

關(guān)鍵詞：酸性α-淀粉酶；液態(tài)發(fā)酵；產(chǎn)酶條件；優(yōu)化；正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào)： S188+3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）21-0308-03

收稿日期：2017-05-05

基金項(xiàng)目：黑龍江省教育廳面上項(xiàng)目（編號(hào)：135109263）；黑龍江省齊齊哈爾市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃（編號(hào)：NYGG-201426）。

作者簡介：郭宏文（1973—），男，河北深縣人，碩士，副教授，主要從事微生物遺傳研究。Tel：（0452）2742731；E-mail：ghw666@126com。

酸性α-淀粉酶是一種重要的工業(yè)酶制劑，能夠在酸性條件下水解淀粉，保持高活性，被廣泛應(yīng)用于食品、發(fā)酵、紡織、制藥和飼料等工業(yè)領(lǐng)域。近年來，隨著我國國民經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，對(duì)酸性α-淀粉酶的需求也日益增加，研究并開發(fā)新型的酸性α-淀粉酶具有較高的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。自1963年日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)可以用黑曲霉生產(chǎn)耐酸性α-淀粉酶1]以來，許多國家對(duì)其相繼開展了相關(guān)研究，而我國學(xué)者從20世紀(jì)90年代始，在酸性α-淀粉酶工業(yè)菌種選育方面開展了相應(yīng)的研究工作2-5]。齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院從北大倉酒廠白酒酒醅中分離篩選得到產(chǎn)酸性α-淀粉酶的菌株6]，并經(jīng)誘變育種得到高產(chǎn)酶突變株F21。本研究以菌株F21為試驗(yàn)對(duì)象，利用單因素及正交試驗(yàn)法對(duì)其最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成及液態(tài)產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，以進(jìn)一步提高菌株的產(chǎn)酶能力。

1材料與方法

11試驗(yàn)材料

枯草芽孢桿菌F21，分離自白酒酒醅并經(jīng)誘變處理得到。斜面保藏培養(yǎng)基：可溶性淀粉12%、蛋白胨08%、酵母粉02%、MgSO4·7H2O 005%、K2HPO4 01%、瓊脂18%，pH值為70。產(chǎn)酶種子培養(yǎng)基：可溶性淀粉12%、蛋白胨 08%、酵母粉02%、MgSO4·7H2O 005%、K2HPO4 01%，pH值為70。產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉15%、蛋白胨 10%、酵母粉05%、MgSO4·7H2O 005%、K2HPO4 01%，pH值為70。麩皮、玉米粉、豆餅粉為市售，試驗(yàn)用試劑均為分析純。

12試驗(yàn)方法

菌種活化，接種到裝有25 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在搖床中36 ℃ 180 rmin培養(yǎng)18 h；取2 mL接到裝有25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，在搖床中36 ℃ 180 rmin培養(yǎng)48 h；4層紗布過濾，離心，參照Yoo等的改良法7-8]測(cè)定上清液酶活性。采用單因素法及正交試驗(yàn)法9]研究確定菌株最佳產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基的組成及發(fā)酵條件。

2結(jié)果與分析

21菌株最佳培養(yǎng)基單因素試驗(yàn)

211培養(yǎng)基中不同碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響培養(yǎng)基分別添加可溶性淀粉、玉米淀粉、玉米粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖及麩皮為碳源，發(fā)酵后測(cè)定酶活性，制作產(chǎn)酶關(guān)系曲線。由圖1可知，以蔗糖、麩皮為碳源，菌株F21的產(chǎn)酶能力相對(duì)較高，酶活性分別為1 2471、1 2084 UmL。考慮麩皮相對(duì)較為低廉，因此選擇麩皮作為菌株F21發(fā)酵的碳源。

FK（W11]TPGHW1tif]

212培養(yǎng)基碳源含量對(duì)產(chǎn)酶的影響由圖2可知，隨麩皮含量的增加，酶活性呈先升高后降低趨勢(shì)，麩皮含量為2%時(shí)的酶活性相對(duì)最高，為1 380 UmL。因此，2%為最佳碳源含量。

213培養(yǎng)基中不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響以蛋白胨、酵母粉、豆餅粉、硫酸銨、尿素為單一氮源及以不同比例的蛋白胨+酵母粉、豆餅粉+酵母粉為復(fù)合氮源進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定酶活

FK（W11]TPGHW2tif]

性。由圖3可知，以15%豆餅粉為有機(jī)氮源時(shí)酶活性相對(duì)最高，為1 5026 UmL；配比為1%豆餅粉+05%酵母粉的復(fù)合有機(jī)氮源酶活性次之，為1 4378 UmL；15%尿素作單一無機(jī)氮源時(shí)酶活性相對(duì)最低。因此，15%豆餅粉為培養(yǎng)基最佳氮源。

214培養(yǎng)基氮源含量對(duì)產(chǎn)酶的影響由圖4可知，隨豆餅粉含量的增加，酶活性呈先升高后降低趨勢(shì)，豆餅粉含量為 15%時(shí)的酶活性相對(duì)最高，為1 5146 UmL；隨著豆餅粉含量的繼續(xù)增加，酶活性開始降低。因此，15%為最佳氮源含量。

215培養(yǎng)基中添加金屬離子對(duì)產(chǎn)酶的影響以沒有鎂離子的發(fā)酶培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基（對(duì)照），在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入一定量不同的金屬離子，發(fā)酵測(cè)酶活性。由圖5可知，添加Mg2+對(duì)產(chǎn)酶有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，酶活性較對(duì)照提高137%；添加Mn2+對(duì)產(chǎn)酶也有一定的促進(jìn)作用，但酶活性提高極小；添加Cu2+、Fe2+、Zn2+、Ca2+對(duì)產(chǎn)酶有一定的抑制作用，Cu2+、Zn2+的抑制作用相對(duì)較強(qiáng)，而Fe2+、Ca2+對(duì)產(chǎn)酶的抑制作用相對(duì)較弱。因此，選擇在培養(yǎng)基中添加Mg2+以提高菌種的產(chǎn)

酶能力。

22最適培養(yǎng)基正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以麩皮、豆餅粉、Mg2+為試驗(yàn)因素，以酶活性為指標(biāo)，采用L9（33）方案9]設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。由表1、表2可知，麩皮（碳源因素）對(duì)酶活性的影響相對(duì)最大，豆餅粉（氮源）次之，Mg2+影響相對(duì)最小，碳源因素對(duì)產(chǎn)酶的影響顯著；最佳的三因素配比為A2B2C2，即培養(yǎng)基中添加20%麩皮、15%豆餅粉，Mg2+濃度為005%。endprint

23產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

231培養(yǎng)基初始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響由圖6可知，培養(yǎng)基pH值為60時(shí)的酶活性相對(duì)最高，為1 6958 UmL。因此，菌株F21發(fā)酵初始的pH為偏酸性為好，最適初始pH值為 60。

232培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響由圖7可知，隨培養(yǎng)溫度的增加，酶活性呈先升高后降低趨勢(shì)；培養(yǎng)溫度為40 ℃時(shí)酶活性相對(duì)最高，為1 8890 UmL。因此，選擇40 ℃為培養(yǎng)基最適培養(yǎng)溫度。

233裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響在250 mL三角瓶中分別裝入15～50 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定酶活性。由圖8可知，裝液量為30 mL時(shí)的酶活性相對(duì)最高，為2 0838 UmL。因此，三角瓶中的最適裝液量為30 mL。

234接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響由圖9可知，接種量為8%時(shí)的酶活性相對(duì)最高，為2 1955 UmL，接種量超過8%酶活性下降。因此，選擇8%為最佳接種量。

235轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶的影響由圖10可知，轉(zhuǎn)速為200 rmin時(shí)的酶活性相對(duì)最高，為2 3059 UmL。因此，選擇搖床轉(zhuǎn)速為200 rmin進(jìn)行發(fā)酵。

3結(jié)論

對(duì)產(chǎn)酸性α-淀粉酶菌株F21進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化，研究碳源、氮源、金屬離子等培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)基初始pH值、培養(yǎng)溫度、裝液量、接種量、轉(zhuǎn)速等條件對(duì)產(chǎn)酶的影響，以確定菌株產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件。結(jié)果表明，使用價(jià)格比較低廉的20%麩皮為碳源、15%豆餅粉為氮源，同時(shí)添加005% MgSO4·7H2O、01% K2HPO4作為培養(yǎng)基，在培養(yǎng)條件為250 mL三角瓶中裝液量為 30 mL、接種量為8%、培養(yǎng)基pH值為60、培養(yǎng)溫度為40 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為 200 rmin 的情況下培養(yǎng)48 h，菌株F21產(chǎn)酸性α-淀粉酶的活性相對(duì)最高，此時(shí)酶活性為2 3059 UmL，比優(yōu)化前初始酶活性（9873 UmL）提高134倍。

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