白腐真菌發酵罐產漆酶條件的優化

劉海霞　張力　喬梁

摘要：選取黃孢原毛平革菌作為漆酶的生產菌株，分別研究攪拌轉速、通氣量、培養溫度、接種量和培養基初始pH值對發酵罐發酵產漆酶的影響；并在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗研究黃孢原毛平革菌發酵產漆酶的最佳條件。結果表明，發酵罐攪拌轉速對漆酶產量影響最大，產漆酶的最優條件如下：溫度28 ℃、轉速300 rmin、通氣量 5 Lmin（通氣比10 vvm）、培養基初始pH值5、接種量15%，得到最高產漆酶水平1486 UmL。

關鍵詞：白腐真菌；黃孢原毛平革菌；發酵罐；漆酶；工業化生產；優化條件

中圖分類號： S188+3文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）21-0305-03

收稿日期：2017-04-03

基金項目：江蘇農牧科技職業學院項目（編號：NSFPT201601）。

作者簡介：劉海霞（1974—），女，山東泰安人，博士，副教授，主要從事草食動物生產研究。E-mail：153558193@qqcom。

農作物秸稈是一種來源廣泛、成本低廉的飼料原料，但其中難以降解的木質素降低了其作為飼料的飼喂價值。因此在處理秸稈使其飼料化過程中，降解木質素成為了極為關鍵的一點。白腐真菌是一種能夠釋放木質素和其他木質組分的降解酶1]。目前，關于白腐真菌所產生的木質素降解酶研究最多的主要有錳過氧化物酶（manganede peroxidase，MnP）、木質素過氧化物酶（lignin peroxidse，LiP）和漆酶（laccase）2-3] 3種。漆酶是一類多酚氧化酶，產生于白腐菌的次生代謝階段，是木質素降解過程中的關鍵酶，難以獲得較高的產量，這也是限制漆酶廣泛應用的主要原因。本研究選取對秸稈降解效果較好的黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium），在5 L的機械攪拌式發酵罐中進行白腐真菌產漆酶試驗，探究攪拌轉速、通氣量、溫度、pH值等主要因素對2種黃孢原毛平革菌的產漆酶影響，為工業化生產以及農作物秸稈的有效利用提供依據。

1材料與方法

11試驗材料

111試驗菌株

黃孢原毛平革菌株由江蘇農牧科技職業學院微生物實驗室保存。

112試驗培養基

PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，自然pH值。液體發酵培養基（1 L）：去皮馬鈴薯200 g，煮沸30 min，紗布過濾，加入20 g蔗糖，融化后補水至1 000 mL，自然pH值，加入10 g葡萄糖，100 mL分裝250 mL三角瓶，121 ℃間歇滅菌。

113試驗主要儀器和設備

高壓滅菌器（上海博迅實業有限公司，YXQ-LS-50SⅡ）；生化培養箱（上海三發科學儀器有限公司，SHP-160）；數顯恒溫振蕩器（上海梅香儀器有限公司，THZ-82A）；發酵罐（江蘇省鎮江東方生物工程設備技術有限責任公司，GBJT-7C）；無油空氣壓縮機（ZW-0057-X）；儲氣罐（浙江省臺州市富芳壓縮機有限公司）。

12試驗方法

121菌種活化

取4株斜面種子管分別接種于PDA培養基上，28 ℃倒置培養5 d。

122種子液制備

選取菌絲長勢旺盛的平板，取菌苔前端接種于液體種子培養基上，28 ℃恒溫搖床（160 rmin）培養 3～5 d，至長出可見的白色菌絲球，即可作為種子液使用。

123接種及發酵罐產酶培養

待液體培養基冷卻后，在火焰保護下打開接種口，將培養好的種子液按比例投放入發酵罐內。按照試驗設計條件，在發酵罐控制器觸控板上設定攪拌轉速、通氣量、溫度、pH值等參數進行發酵培養。

124漆酶活性的測定

每隔24 h取培養液，紗布過濾，4 000 rmin 條件下離心得粗酶液4]，用紫外可見分光光度計測定酶活性5]，觀察各因素對漆酶分泌的影響。

125多因素正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，選取其中對黃孢原毛平革菌發酵罐中產漆酶活性影響較大的因素進行正交試驗，分別測定不同因素水平組合條件下的酶活性，進行多因素共同作用下的優化組合。

2結果與分析

21單因素試驗結果

211發酵罐轉速對漆酶分泌的影響結果

其他條件不變，測定發酵罐轉速分別為200、250、300、350、400 rmin條件下的漆酶活性，結果見表1。由表1可知，發酵罐中液體發酵過程中，攪拌速度以300 rmin較適合黃孢原毛平革菌進行漆酶的分泌，從發酵第1天起各因素間逐漸出現差異，第4 天起其產酶活性相對其他水平有顯著升高，最高在發酵的第7天出現，平均為9783 UmL，并且較其他轉速酶活性水平差異顯著。試驗分析發現，發酵罐在轉速過低時，發酵過程中攪拌的剪切力較弱，導致菌絲體生長過度，菌液黏稠，影響發酵液內小環境，氧分和營養物質分布不均，從而影響菌體細胞正常的代謝分泌產酶；發酵罐轉速過高時，發酵過程中產生的剪切力過強，會影響菌絲體的生長，甚至導致菌絲體細胞的破裂，不能正常進行酶的分泌，產酶水平下降，同時過高的攪拌轉速，對于設備的要求高， 且對于能源有過多的消耗，生產過程中成本過高，不利于規模化發酵工業生產。

212通氣量對發酵罐中漆酶分泌的影響結果

其他條件不變，分別在通氣量為3、4、5、6、7 Lmin條件下進行發酵試驗，觀察通氣量對漆酶分泌的影響，結果見表2。從表2可以看出，通氣量相對轉速對于產酶水平的影響略低，在發酵后第4 天開始不同通氣量間大部分表現出顯著差異，其中發酵后第5、第6天在通氣量為6 、7 Lmin時產酶水平差異不顯著。在通氣量為5 Lmin時，漆酶活性最高，第7天出現最高活性9180 UmL，遠高于在其他條件下的漆酶活性。不同通氣量的產酶水平在前4 d差異均不明顯，證明通氣量對產酶水平的影響小于轉速對產酶水平的影響，其產酶的前低后高的特點也符合白腐真菌生產漆酶的時間順序。黃孢原毛平革菌發酵過程是一個好氧發酵過程，因此當通氣量過低時，會影響菌絲體在前期的生長，從而影響后期的產酶水平；當通氣量過高時，會有大量泡沫產生，影響菌絲體后期安靜產酶，同時通氣裝置的連續高強度運轉，增加了整個發酵過程的能耗，對設備也提出了更高的要求，因此最適通氣量為5 Lmin，轉換為通氣比為10 vvm。endprint

213溫度對發酵罐中漆酶分泌的影響結果

其他條件不變，分別在溫度為26、28、30、32、34 ℃條件下進行發酵試驗，觀察溫度對漆酶分泌的影響，結果見表3。從表3可以看出，與轉速和通氣量相比，溫度對于產酶的影響相對較小，不同溫度下的產酶水平始終有不顯著差異存在。當溫度為28 ℃時，發酵的第7天漆酶活性達到最高，為8880 UmL；其次為 30 ℃，達到8770 UmL；34 ℃條件下產酶水平最低，為 7640 UmL，說明28 ℃為黃孢原毛平革菌的最適發酵溫度。但有研究報道，在南方地區夏季比較炎熱，當設定發酵溫度為28 ℃時，發酵設備須要供應冷水進行發酵液的降溫處理，增加生產成本，同時對設備也提出了更高的要求，因此在實際生產過程中應從適合于大規模工業化生產水平的效率上綜合考慮。

214pH值對發酵罐中漆酶分泌的影響結果

其他條件不變，分別在培養基初始pH值為40、45、50、55、60條件下進行發酵試驗，觀察培養基pH值對漆酶分泌的影響，結果見表4。表4表明，培養基的初始pH值對于漆酶的分泌影響并不大，不同水平間產生的差距不明顯。當培養基初始pH值為50時，黃孢原毛平革菌活性在發酵后第7天達到最高水平，為9253 UmL，較其他產酶水平差異顯著，pH值過高或過低均會使產酶水平降低。培養基pH值過小時，酸度過大，菌體生長困難，影響產酶水平；當培養基的初始pH值為弱酸性時，菌體生長不受影響。

215接種量對發酵罐中漆酶分泌的影響

其他條件不變，分別在接種量為5%、10%、15%、20%、25%條件下進行發酵試驗，觀察黃孢原毛平革菌接種量對漆酶分泌的影響，結果見表5。由表5得知，當接種量為15%時，發酵后第7天產酶水平達到了最高，為9657 UmL，較其他產酶水平差異顯著。在發酵的第5天，各水平間開始出現相互的顯著性差異。試驗分析發現，菌種接種量過低，不能充分利用培養基中的養分， 無法達到最高產酶水平；接種量過高，空間和營養的匱乏反而影響了菌絲體的生長，從而使產酶水平降低。

22多因素正交試驗結果

結合單因素影響的試驗結果，選取攪拌轉速、通氣量、pH值、接種量作為影響白腐真菌發酵罐中產漆酶活性的主要因素，進行L9（34）正交試驗，因素水平見表6，試驗結果見表7。

從表7可以看出，多因素正交優化試驗最優組合為A2B2C2D2，即轉速為300 rmin、通氣量為5 Lmin（通氣比 10 vvm）、pH值為5、接種量為15%，此結果與單因素結果相符合。從極差分析來看，影響最大的因素為轉速，其次為通氣量，pH值對產酶水平的影響相對最小，該結果符合單因素試驗結果。

3討論與結論

本研究通過單因素和多因素正交試驗對黃孢原毛平革菌在發酵罐中液體發酵生產漆酶的條件進行優化，綜合考慮產酶水平與大規模生產的實際條件和成本，得出黃孢原毛平革菌最佳發酵生產漆酶條件：溫度30 ℃、轉速320 rmin、通氣量5 Lmin（通氣比10 vvm）、pH值5、接種量15%。由試驗結果分析發現，發酵罐的旋轉攪拌和通氣改善了搖瓶發酵氧氣量少和菌液不均勻的缺點，使培養基得到充分的養分，白腐真菌液體發酵前期主要是菌絲體生長，產酶水平較低，后期為產酶時期，產酶水平上升且不同條件下差異顯著。這與近年來研究報道相符合，通過最優條件進行發酵罐發酵培養，最終得到黃孢原毛平革菌最高產漆酶水平，為1486 UmL，與前期韋麗敏等搖瓶優化試驗結果6]相比提高320%。

目前漆酶的產量及生產成本在實際生產中還不容樂觀，絕大多數都是在搖瓶中或規模很小的反應器中利用微生物生產漆酶，難以大規模地生產，因此發酵罐試驗條件的好壞決定了規模生產的成敗。

參考文獻：

1]ZK（#]Zadrzil F，Grinsberg J，Gonzales A“Palo-podrido”-decomposed wood，which was used as feedJ] European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology，1982，15（3）：167-171

2]黃丹蓮，曾光明，黃國和，等 白腐菌的研究現狀及其在堆肥中的應用展望J] 微生物學通報，2004，31（2）：112-116

3]范文霞，劉學銘 漆酶的生產和應用研究進展J] 農產品加工·學刊，2007（5）：15-17，84

4]傅愷，付時雨，李雪云，等 產漆酶白腐菌的誘變選育及其液體發酵的研究J] 造紙科學與技術，2009，28（5）：21-24，71

5]唐媛，謝冰，呂寶一，等 白腐真菌處理難降解有機物的培養條件及應用研究J] 世界科技研究與發展，2008，30（1）：60-65

6]韋麗敏，喬梁，張力，等 利用白腐真菌處理稻草秸稈的研究進展J] 中國飼料，2013（1）：43-45endprint