地衣內生真菌的鑒定及其抗植物病原菌活性

范莉莉　秦正男　郭守玉　韓留福

摘要：以粉緣斑葉梅（Cetrelia cetrarioides）、粉樹花（Ramalina farinacea）、東方松蘿（Usnea orientalis）3種地衣為試驗材料，進行內生真菌分離、鑒定、物種多樣性、ITS（internal transcribed spacer）序列系統發育分析以及抗植物病原菌活性的初步研究。物種多樣性研究結果表明，3種地衣體中分離共獲得29株內生真菌，確定隸屬于4科8屬；其中，炭角菌屬為3種地衣內生真菌的優勢屬。地衣內生真菌粗提發酵液對鐮刀菌（Fusarium sp）、多枝橫梗霉（Lichtheimia ramosa）、黃瓜萎蔫病菌（Plectosphaerella cucumerina）、Pythium capillosum等4種供試植物病原菌抗菌活性試驗結果表明，東方松蘿中的內生真菌C25、C27和C49效果良好，有潛在的生物防治應用價值。

關鍵詞：地衣；內生真菌；分類；鑒定；抗病原菌活性；優勢屬；生物防治

中圖分類號： S94932；S182文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）21-0115-04

收稿日期：2017-04-18

基金項目：國家自然科學基金（編號：31370067）；湖北省重點實驗室開放基金（編號：2012snjAB001）；河北省自然科學基金（編號：C2016205201）

作者簡介：范莉莉（1989—），女，河北邯鄲人，碩士研究生，主要從事地衣內生真菌資源研究。E-mail：lilifan0529@163com。

通信作者：韓留福，博士，教授，主要從事地衣生物學研究。E-mail：hanliufu@hebtueducn。

植物內生真菌（endophytic fungi）是指寄生于健康植物組織內，但不會引起宿主植物出現不良癥狀的一類微生物1]。Clay等發現侵染內生真菌的牧草遭受到真菌病害影響的程度遠低于沒有感染內生真菌的，感染內生真菌的宿主植物往往比未感染植株更具生存競爭力2-3]。藥用植物體內存在能產生與宿主植物活性成分物質相同或相似的次生代謝產物，這些代謝產物在新型藥物開發和生物防治等方面具有巨大的潛在應用價值4-6]。近年來，隨著越來越多的具有抗菌活性菌株被發現，植物內生真菌逐漸成為研究的熱點。

目前人們僅僅利用植物內生真菌的小部分，還有很多未從植物體內分離、培養、開發利用。國內外對內生真菌的研究主要集中在高等植物中，對低等植物尤其是地衣的研究較少7-9]。事實上，內生真菌作為一個較大的生物類群，也廣泛存在于地衣組織中10-12]。在藥用研究方面，從扁枝衣分離獲得的6株內生真菌通過平板對峙法進行抗菌活性研究發現，2株產生明顯的拮抗帶，抑菌效果顯著，是良好的生物防治候選菌株13]。總之，地衣內生真菌作為一類重要的真菌資源，它們的藥用價值和生態價值尚未被有效開發利用。本研究以采自神農架林區的藥用地衣粉緣斑葉梅（Cetrelia cetrarioides）、粉樹花（Ramalina farinacea）、東方松蘿（Usnea orientalis）為材料，進行內生真菌的分離培養、種類多樣性分析和抗植物病原菌活性菌株篩選，旨在為豐富地衣內生真菌資源，并為植物病害的生物防治提供資料。

1材料與方法

11樣本采集

2014年4月從湖北省神農架林區海拔2 150 m的樹枝或樹干上隨機采集粉緣斑葉梅、粉樹花、東方松蘿等地衣標本。在實驗室溫度為4 ℃條件下保存，并在5～7 d處理完畢。試驗所用地衣樣本及分離的內生真菌菌株均保存在中國科學院微生物所標本室（HMAS-L）、河北師范大學標本室（HBNU-L）中。

12內生真菌的分離、純化和分類鑒定

菌株分離：（1）樣本清洗。選取適量樣本，自來水沖洗 1～2 h，剔除表面雜物；在超凈臺上，用紫外照射上下表面各10 min。（2）表面消毒。無菌水涮洗3遍，75%乙醇消毒 30 s，3% NaClO溶液消毒3 min，75%乙醇消毒30 s，無菌水涮洗3遍，置于無菌吸水紙上。（3）分離方法。剪碎消毒樣本，置于加入400 μL無菌水的20 mL離心管中，玻璃棒研磨；涂布接種；20 ℃條件下培養。

菌株純化：待培養基長出菌落后，采用頂端純化法，轉接至新PDA培養基上，多次純化，直到得到單一、穩定的菌落，4 ℃ 條件下保存。

分類鑒定：利用解剖鏡觀察菌落特征；采用插片法對菌絲和孢子進行形態學觀察。通過DNA提取，PCR擴增，獲得nrDNA的ITS序列，經校正后，NCBI在線進行Blast比對，確定一致性最高的同源序列，結合菌落形態和顯微特征，進行內生真菌分類鑒定14-15]。

13內生真菌發酵液的抗菌活性試驗方法

4種供試植物病原菌包括鐮刀菌（Fusarium sp）、多枝橫梗霉（Lichtheimia ramosa）、黃瓜萎蔫病菌 （Plectosphaerella cucumerina）、Pythium capillosum以及陽性對照菌球毛殼菌（Chaetomium globosum），均由河北師范大學地衣生物學實驗室提供。

試驗步驟：（1）菌株活化。取出在4 ℃條件下保存的地衣內生真菌，于PDA培養基中活化，25 ℃條件下培養6～7 d。（2）搖瓶發酵培養16]。取適量活化菌株接種于200 mL PDB液體培養基中，25 ℃、150 rmin搖床振蕩培養7～15 d。（3）粗提液制備。將內生真菌發酵液離心、過濾，取上清液進行丙酮浸提，獲得粗提液。（4）粗提液培養基制備。將粗提液加入PDA培養基（二者體積比為1 ∶20）混勻，制成粗提液培養基。以球毛殼菌粗提液培養基作為陽性對照1，以無菌水加入等量丙酮培養基作為對照2。（5）抗菌活性測試。接種植物病原菌于培養基中央，25 ℃條件下培養。十字交叉法測量病原菌菌落直徑（cm），按照下面公式計算其抑菌率17]：endprint

抑菌率=對照生長量（cm）-處理生長量（cm）]對照生長量（cm）×100%。

2結果與分析

21分離結果

從3種地衣樣本的150塊組織中分離共獲得29株內生真菌，定殖率為1933%。其中，從葉狀地衣粉緣斑葉梅中分離獲得9株內生真菌（C21、C22、C23、C39、C54、C55、C60、C61、C63），定殖率為3000%；從枝狀地衣粉樹花中獲得11株內生真菌（C31、C32、C33、C36、C38、C40、C51、C52、C53、C57和C58），定殖率為1833%；從枝狀地衣東方松蘿中分離獲得9株內生真菌（C25、C27、C35、C42、C45、C49、C50、C59和C65），定殖率為1500%（表1）。結果表明，葉狀地衣定殖率高于枝狀地衣。

22地衣內生真菌的物種多樣性

對地衣內生真菌菌落特征進行簡要描述（表2、圖1）。利用測得nrDNA-ITS序列與GenBank中已注冊信息在線比對，結果如表2所示；基于nrDNA-ITS序列信息，利用Mega 6軟件構建地衣內生真菌與其他相關真菌類群的鄰接（neighbor-joining，簡稱NJ）系統發育樹（圖2），系統樹的每個分支的統計學顯著性分析以Bootstrap方法進行檢驗，重復1 000次。結果表明，29株內生真菌確定隸屬于8屬，其中炭角菌屬（Xylaria）有12株菌株，占4138%，為3種地衣內生真菌的優勢屬。

23發酵粗提液的抗菌活性

由表3可知，對照1（球毛殼菌）對植物病原菌表現出一定的抑菌效果；對照2（無菌水加丙酮）對植物病原菌均無抑菌效果；C25發酵粗提液對鐮刀菌、多枝橫梗霉的抑菌率分別為3326%、3287%，對黃瓜萎蔫病菌和P capillosum的抑菌率達95%以上；C27發酵粗提液對鐮刀菌、黃瓜萎蔫病菌的抑菌率分別為1338%、1564%，對Pcapillosum表現為完全抑制；對多枝橫梗霉的抑菌率約為4965%；C49發酵粗提液對黃瓜萎蔫病菌和P capillosum的抑菌率達均到90%以上，對鐮刀菌的抑菌率約為4567%，對多枝橫梗霉的抑菌率為1042%。其他內生真菌發酵粗提液均未發現抑菌效果。

試驗結果表明，東方松蘿內生真菌C25、C27、C49的發酵粗提液對植物病原菌的抑菌效果較好且具有廣譜性。

3結論與討論

目前真菌鑒定主要基于形態學特征和特定的分子序列差異，其中ITS序列分析法鑒定種間關系準確性相對較高，簡單易行，具有巨大的應用價值18]。本試驗對內生真菌進行ITS序列分析、系統發育樹構建、輔助形態學鑒定以及內生真菌分類地位的確定。

植物內生真菌作為一種新興的微生物資源，具有廣闊的開發前景19]。已有研究發現，植物內生真菌具有廣泛的抗菌活性20]。通過對3種地衣內生真菌發酵粗提液的抗植物病原菌活性試驗發現，3株分離自東方松蘿的地衣內生真菌C25、C27和C49抑菌率較高，具有較好的抗菌活性，有望成為很好的生物防治菌，在農作物病害預防中可以發揮重要的作用。

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