甘蔗脫毒健康種苗中蔗糖轉化酶表達分析

王俊剛　趙婷婷　楊本鵬　蔡文偉　馮翠蓮　曾軍　熊國如　張樹珍

摘要：甘蔗脫毒健康種苗能夠有效提高植株生物量和糖分，而蔗糖轉化酶則是甘蔗生長和蔗糖積累的關鍵酶。擬分析3種甘蔗蔗糖轉化酶基因，即可溶性酸性轉化酶（soluble acid invertase，簡稱SAI）、可溶性中性轉化酶（neutral invertase，簡稱NI）和細胞壁酸性轉化酶（cell wall-bound invertase，簡稱CWI）基因在脫毒種苗、常規種苗全生育期的表達量差異。結果表明，細胞壁酸性轉化酶主要在脫毒健康種苗拔節期未成熟葉片、莖及成熟期葉片、未成熟莖節中上調表達，尤其在成熟期未成熟莖節中大幅上調表達，促進莖節的快速生長和蔗糖的卸載及積累；液泡可溶性酸性轉化酶SAI、可溶性中性轉化酶主要在成熟期葉片和未成熟莖節中上調表達，有利于促進成熟期脫毒健康種苗莖稈中糖分積累及對單糖的快速利用。進一步研究表明，脫毒處理可以提高甘蔗生長后期蔗糖轉化酶的表達量，有利于生物量和蔗糖含量的增加，可能是脫毒健康種苗增糖增產的分子調節機制之一。

關鍵詞：甘蔗；脫毒健康種苗；蔗糖轉化酶；表達量

中圖分類號： Q9465；S566101文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）21-0035-04[

收稿日期：2016-06-08

基金項目：國家“863”計劃（編號：2013AA102604-1）；海南省自然科學基金（編號：20163124）；中央級公益科研院所基本業務費（編號：ITBB140503）；現代農業產業技術體系建設專項資金（編號：CARS-20-2-5）。

作者簡介：王俊剛（1983—），男，湖北孝感人，博士研究生，助理研究員，研究方向為甘蔗生物技術。Tel：（0898）66987509；E-mail：wangjungang@itbborgcn。

通信作者：張樹珍，博士，研究員，研究方向為甘蔗生物技術。Tel：（0898）66987509；E-mail：zhangsz2007@163com。

甘蔗是禾本科甘蔗屬多年生草本C4植物，是將光能轉化為化學能效率最高的作物之一，是世界上重要的糖料作物和能源作物，約生產全球70%的食糖和42%的乙醇[1]。蔗糖是甘蔗生產的主要物質，其合成和積累過程是一個系統的調控網絡，涉及到各種蔗糖代謝相關酶、轉運蛋白及信號分子等的調節作用[2-3]，而蔗糖轉化酶能夠催化蔗糖的水解，影響莖稈蔗糖含量[4-5]。高等植物中含有多個編碼蔗糖轉化酶的基因，蔗糖轉化酶既存在于光合組織中，也存在于非光合組織中，主要累積于細胞質、液泡和細胞間隙。高等植物中轉化酶依據不同的溶解性、亞細胞定位和最適pH值，可以分為3種類型：（1）可溶性中性轉化酶（neutral invertase，簡稱NI），為非糖基化形式，存在于細胞質中，最適pH值為中性或弱堿性（pH值70～80），在植物組織中降解蔗糖滿足代謝中對己糖的需求；（2）可溶性酸性轉化酶（soluble acid invertase，簡稱SAI），主要存在于液泡中，為糖基化形式，其活性最適pH值為酸性（45～50），參與調節光合同化產物在淀粉和蔗糖間的分配及控制蔗糖己糖比率[6-7]；（3）細胞壁酸性轉化酶（cell wall-bound invertase，簡稱CWI），最適pH值為酸性（45～55），但有較高的pI值（9～10）。細胞壁轉化酶則主要負責調節蔗糖從葉片（源）中輸出的速率，是蔗糖源源不斷地向庫細胞卸載的重要動力[8-10]，促進植物細胞從源代謝向庫代謝的轉變，有助于庫器官的生長和代謝產物的長距離運輸[11-12]。

甘蔗多年宿根種植引起甘蔗品種退化，利用腋芽莖尖脫毒處理能夠恢復母本性狀，使甘蔗產量增加20%～40%，含糖量增加05～10百分點[13-15]，但是有關從分子生物學水平研究脫毒處理對蔗糖轉化酶表達量的影響還未見報道。本研究以已報道的3個甘蔗蔗糖轉化酶為研究對象，從甘蔗生長的苗期、分蘗期、拔節期和成熟期對其表達量進行比較分析，探討脫毒處理與蔗糖轉化酶表達量之間的關系，以便從分子生物學層面上分析脫毒處理對轉化酶表達量的影響，揭示脫毒健康種苗可能的增產增糖機制。

1材料與方法

11試驗材料

供試材料為新臺糖22號品種腋芽脫毒健康種苗二代種莖苗和未脫毒新臺糖22種莖，來源于中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所甘蔗試驗地。

12試驗地點

試驗地點設在海南省臨高縣皇桐鎮國家甘蔗產業技術體系試驗站，土壤為紅壤，肥力中等。

13田間試驗設計和管理

參照文獻[15-16]的有關方法進行處理。

14總RNA提取、定量與完整性檢測

取從10個完整植株剝離的凍存樣品進行研磨，用TRIzol法提取RNA，TRIzol RNA提取試劑購自Aidlab （艾德萊）公司。用核酸分析儀（Eppendorf Biophotometer Plus）測定260、280 nm處的吸光度，以D260 nmD280 nm值估計總RNA的純度，以D260 nm進行總RNA定量。用10%普通瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。

15第一鏈cDNA的合成

取3 μg甘蔗總RNA與1μL反轉錄引物（10 pmolL）（Oligo-dT接頭引物）混合，65 ℃加熱5 min后，立即放置于冰上，然后加入5×buffer、25 mmolL dNTP混合液、40 UμL Ribonuclease Inhibitor、5 UμL M-MLV反轉錄酶，反應體系為 25 μL。反應過程如下：42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min，5 min后瞬時離心，最后于-80 ℃保存備用。

16引物設計

根據公布的甘蔗蔗糖轉化酶基因CWI（GenBank登錄號：BU925833）、NI（GenBank登錄號：KC145797）、SAI（GenBank登錄號：AY302083） 序列，利用Primer5設計引物，內參GADPH基因引物參考文獻[17]，詳見表1。endprint