中國美利奴羊TLR4基因多態性的PCR—SSCP鑒定

王會敏　羅成　齊江姣　王元元　李村院　高劍峰

摘要：為了研究中國美利奴羊TOLL樣受體（TLR4）基因第3外顯子上的單核苷酸多態性（SNPS）和單氨基酸多態性（SAPS）。利用生物信息學方法對NCBI上公布的有關綿羊的TLR4序列進行下載并用SeqMan對下載的綿羊TLR4基因外顯子進行多態性比對分析，然后采用PCR-SSCP并結合測序的方法對119只中國美利奴羊TLR4基因的外顯子3的擴增片段進行分析。通過分析發現，在中國美利奴羊第3外顯子1 180 bp處有1個突變位點，由G突變成T，氨基酸由天冬氨酸（D）變成酪氨酸（Y），即該位點為有義突變。在1 537 bp處也有1個突變位點，即由G突變成了A，氨基酸由丙氨酸（A）變成蘇氨酸（T），在TLR4第3外顯子的其他位點并沒有SNPS位點，說明中國美利奴羊TLR4基因上的第3外顯子區域有2個多態位點。

關鍵詞：中國美利奴羊；TLR4基因；多態性；生物信息學方法；PCR-SSCP；外顯子；突變位點

中圖分類號： S8268+62文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）21-0027-05

收稿日期：2016-06-30

基金項目：國家“973”計劃（編號：2010CB530200）。

作者簡介：王會敏（1990—），女，碩士研究生，研究方向為動物基因工程。

通信作者：高劍峰，博士，教授，研究方向為動物功能基因組學與分子免疫學。E-mail：jianfengg@shuzueducn。

Toll樣受體（toll-like receptor，TLR）最早是從果蠅體內分離得到的，它對果蠅腹背側體軸的發展方向和非特異性免疫反應起重要的作用[1]。Medzhitov等首次在人體分離出果蠅TLR的同系物，從而發現人類及哺乳動物存在一個TLR家族，它是一種重要的模式識別受體，能識別微生物的多種成分如DNA、RNA、脂多糖、脂蛋白等，從而激活非特異性和特異性免疫反應，抵抗細菌、病毒的侵入[2]。TLR家族至少有10個TLR成員，它們分別在不同的免疫應答機制中扮演各自的重要角色。TLR基因的多態性可以使機體對疾病的遺傳具有易感性和抗性，基因TLR位點多態性與炎性應答損傷和感染性疾病的遺傳易感性相關[3-5]。TOLL樣受體4是一種Ⅰ型跨膜蛋白，包括富含半胱氨酸的胞內區、富含亮氨酸的胞外區和跨膜區[6]。TLR4廣泛表達于哺乳動物細胞表面，在抗感染免疫中發揮重要作用。目前，關于TLR4的多態主要集中在人和小鼠的研究上。例如，劉繼峰等對TLR2、TLR4基因多態性[CM（25]與尖銳濕疣患者易感性及復發性的相關性進行研究[7]。韓璐等TLR4基因的多態性與胃癌的關系[8]。趙剛等利用 PCR-SSCP方法研究牛血液組胺濃度、TLR4基因多態性與抗蜱能力的關系發現，B等位基因可作為婆羅門雜交牛抗蜱選育的分子標記[9]。呂偉麗等用 PCR-SSCP 方法檢測這4 種綿羊第3外顯子的多態性發現，白薩福克羊、小尾寒羊和特克塞爾羊處于高度多態，而永昌羊處于中度多態[10]。鮮有關于綿羊TLR4基因的多態性與疾病關聯的報道。中國美利奴綿羊是新疆綿羊毛肉兼用細毛羊品種的一種，具有優良的遺傳穩定性，包括軍墾型、科爾泌型、吉林型3種類型[11]。本試驗以中國美利奴羊為材料，利用生物信息學方法對NCBI上公布的有關綿羊的TLR4序列進行下載并用SeqMan對下載的綿羊TLR4基因外顯子進行多態性比對分析，然后采用 PCR-SSCP技術并結合克隆測序的方法來檢測中國美利奴羊TLR4基因的多態位點，從而為進一步研究標記輔助育種、培育中國美利奴綿羊抗性新品系奠定理論基礎。

1材料與方法

11材料

111試驗動物試驗中的119只中國美利奴羊來自新疆建設兵團農九師第170團，取每只試驗羊的頸靜脈血于5 mL肝素鈉抗凝管中，放入車載冰箱里帶回實驗室，然后放入 -40 ℃ 保存備用。

112主要試劑血液基因組試劑盒、EB（核酸染料）、2×Taq PCR MasterMix、DL 2000 DNA Marker等，均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；過硫酸銨和去離子甲酰胺，均購自北京索萊寶科技有限公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺和 TEMED，均購自美國 Am-resco公司；親和硅烷、剝離硅烷，均購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。其他試劑均由實驗室配制。

12方法

121生物信息學分析從NCBI上通過綿羊基因mRNA序列（登錄號：XM_012111214 ）下載綿羊的編碼區，并利用NCBI上的http：wwwncbinlmnihgovgene？term=CAQ378251&report=gene_table將TLR4基因的編碼區進行外顯子的劃分。

122利用生物信息學方法對NCBI上公布的有關綿羊TLR4所有的mRNA序列進行下載并用SeqMan軟件對下載的綿羊TLR4基因外顯子的序列進行多態性比對分析找出位于其品種羊的多態位點并分析。

123基因組DNA的提取[JP3]采用血液基因組DNA提取試劑盒說明書操作提取DNA，用紫外分光光度計估計濃度并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA濃度，于-80℃保存備用。

124PCR擴增反應根據NCBI上公布的綿羊TLR4基因的序列（登錄號：XM_012111214 ）利用Primer Premier 50設計擴增TLR4第3外顯子的特異性引物，引物信息見表1。引物均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

TLR4基因的第3外顯子（即表1中）的所有片段的反應總體系都為20 μL：ddH2O 8 μL，Tap PCR MasterMix 8 μL，DNA模板20 μL，上、下引物（10 μmolL）各10 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性5min；95 ℃變性1 min，72 ℃延伸 40 s，35個循環；72 ℃總延伸10 s；4 ℃保存。PCR擴增產物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠系統照相檢測擴增結果。endprint

125PCR-SSCP檢測和測序分析

分別取45 μL的PCR擴增產物與90 μL的變性上樣緩沖液（025%二甲苯菁、005%溴酚藍、95%去離子甲酰胺、pH值為80 的EDTA）離心混勻，于PCR儀上98 ℃變性10 min，然后取出立即冰浴 5 min。快速在預先制備好的10%非變性聚丙烯酰氨凝膠（90 mL 10×TTE，225 mL 40%丙烯酰胺，580 mL ddH2O，最后同時加入4500、700 μL TEMED）上點樣并連接至冷凝循環系統，9 ℃、300 V預電泳15 min，45 mA電泳5 h，結束后采用銀染色法顯色并在X光上分析帶型且拍照保存。

選擇有不同帶型樣品的PCR產物經電泳檢測符合測序要求后，送北京六合華大基因科技有限公司進行雙向測通測序，然后用SeqMan和GenDoc等軟件對測序序列進行比對分析。

2結果與分析

21用生物信息學對綿羊TLR4基因編碼區外顯子的劃分[HT]

TLR4基因的編碼區分為3個外顯子：外顯子1是從TLR4編碼區序列的1～90長93 bp、外顯子2是從TLR4編碼區序列的91～257長167 bp、外顯子3為TLR4編碼區序列的258～2 523長2 266 bp（圖1）。

22不同品種綿羊TLR4基因外顯子3的生物信息學分析[HT]

用SeqMan軟件對從NCBI上下載的所有有關綿羊TLR4的mRNA序列進行多態性比對分析發現，其多態位點主要集中位于TLR4基因第3外顯子的316～532、530～753、821～1 066、1 093～1 370、1 382～1 634、1 867～2 098 bp之間。其中，316～532 bp 之間共有9個SNP位點，含有A→C、T→C的突變各2個，A→G突變4個，G→C突變1個；530～753 bp之間共有8個SNP位點，含有C→T、A→G、A→C的突變各2個，G→C、T→C的突變各1個；821～1 066 bp之間共有23個SNP位點，含有A→G突變6個，G→A突變4個、G→T突變3個，T→C、C→T突變各2個，C→A、G→C、T→A、C→G、A→T、T→CG 各1個； 1 093～1 370 bp之間共有20個SNP位點，

含有C→T突變6個、G→A突變5個、 A→G突變5個、G→C、G→T、A→T、C→G的突變各1個；1 382～1 634 bp之間共有11個SNP位點，含有T→C突變2個、G→A突變5個、A→C突變1個、C→T突變2個、A→G突變1個；1 867～2 098 bp之間共有9個SNP位點，其中C→A突變1個、C→T突變2個、G→A突變3個、A→G突變3個。G→C、G→T各占所有突變位點的5%、A→T、C→G、C→A各占所有突變位點的250%、T→A、T→CG各占所有突變位點的125%、T→C占所有突變位點的875%、C→T占所有突變位點的1750%、A→G占所有突變位點的2625%、A→C占所有突變點的625%、G→A占所有突變位點的2125%。從上述統計結果來看，G與A（即為轉換位點）之間的突變在綿羊的TLR4的第3外顯子中比較常見，C→T突變次之，且有1個T→CG即簡約信息位點。綿羊TLR4基因第3外顯子的所有突變位點中既有轉換位點又有顛換位點，且轉換位點多于顛換位點。可能是由于DNA雙螺旋結構的差異，越是結構相似的堿基越易相互替換。

23基因組DNA電泳圖檢測結果

提取的DNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，由圖2可見，電泳條帶清晰單一，可以進行下步試驗。

24綿羊TLR4基因第3外顯子片段的PCR擴增[HT]

由圖3可知，綿羊TLR4基因第3外顯子TLR4（316～532）、TLR4（530～753）、TLR4（821～1 066）、TLR4（1 093～1 370）、TLR4（1 382～1 634）、TLR4（1 867～2 098）的PCR擴增，上述序列的擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測與目的片段大小一致且帶型清晰、無雜帶符合SSCP試驗要求。

25PCR-SSCP檢測

對綿羊TLR4基因第3外顯子的TLR4（316～532）、TLR4（530～753）、TLR4（821～1 066）、TLR4（1 093～1 370）、TLR4（1 382～1 634）、TLR4（1 867～2 098）擴增得到的PCR產物進行SSCP試驗檢測，在擴增片段中都沒有發現多態性都為AA[CM（245]基因型（圖4-A至圖4-D）；TLR4（1 093～1 370）與

[FK（W13][TPWHM222tif]

TLR4（1 382～1 634）PCR擴增得到的產物進行SSCP試驗，在擴增產物片段中發現不同的帶型，即TLR4（1 093～1 370）有AA、AB、BB等3 種基因型TLR4（1 382～1 634）有2種基因型AA、AB（圖4-E至圖4-F）。

26綿羊TLR4第3外顯子的TLR4（1 093～1 370）與TLR4（1 382～1 634）序列的測序結果[HT]

通過測序和SeqMan軟件的比對分析（圖5至圖6）可知，在TLR4基因第3外顯子的1 180 bp處有1個突變位點，由G突變成T，氨基酸由天冬氨酸（D）變成酪氨酸（Y），即該位點為有義突變。在TLR4基因第3外顯子的1 537 bp處也有1個突變位點，即由G突變成了A，氨基酸由丙氨酸（A）變成蘇氨酸（T）該位點為有義突變。

3討論與結論

目前，國內外學者在人TOLL樣受體的多態性方面研究得比較廣泛。Mu等發現，人的TLR9-1486TC和2848GA 的基因型能增加患宮頸癌的風險[12]。吳春香等采用PCR-FLRP技術對110例AAV患者及101例健康的成人進行研究，發現TLR4-1837AG基因型影響AAV患者的血紅蛋白、endprint

[血尿發生率、血沉水平、C反應蛋白[13]。林茂虎等用iMLDR 技術對 423 例鮑曼不動桿菌感染病人和 385 例非感染病人的血標本進行 TLR4基因的多態性檢測，證明位于啟動子區域的TLR4單倍型 GCG與鮑曼不動桿菌感染的相關性[14]。王永堂等用PCR-RFLP技術對正常漢族人群樣本TLR4啟動子區 -2 242、-1 892 和 -1 837 這 3 個多態位點進行基因分型，證明中國漢族人群中位于TLR4基因啟動子區的 -2 242 位點可能是膿毒癥關聯分析重要的遺傳標記[15]。從以上可知，TLR4基因的多態性在人方面研究得比較成熟，但其在家畜方面研究得比較少，有待進一步研究，TLR4基因具有SNPs的免疫基因，而基因多態性能夠與生產性能上的一些經濟性狀聯系起來，為動物遺傳育種提供一定的依據。同時，TLR基因多態性與動物的免疫力及疾病的易感性和抗病性也有很大關聯性。綿羊是這個星球上最有經濟價值的家養動物之一，在工農業生產中占據著重要的地位。羊肉蛋白質含量高、膽固醇含量低、營養豐富，是世界上很多人喜愛的食物[16]，2012年中國的出口羊肉產量為401萬t，占世界的32%。優質羊毛是毛紡工業的重要原材料，此外綿羊也是重要的科學研究模式動物。因此，對于選育具有優良品種和抗性新品系的綿羊尤為重要，必須從多個方面考慮、創新、發現新的有關提高綿羊經濟價值領域。在本試驗中，將中國美利奴羊的TLR4編碼基因的第3外顯子分成7個在300 bp以下的片段，分別為TLR4（316～532）、TLR4（530～753）、TLR4（821～1 066）、TLR4（1 093～1 370）、TLR4（1 382～1 634）、TLR4（1 867～2 098）來檢測TLR4編碼基因第3外顯子在中國美利奴羊上的多態性，因為TLR4編碼基因的第3外顯子總長為2 266 bp，而做SSCP試驗DND片段總長最好在 300 bp 以下，這樣檢測到目的DNA片段多態性的靈敏度才高[17]。對以上TLR4編碼基因的7個片段進行多態檢測，除TLR4（1 093～1 370）與TLR4（1 382～1 634）片段中各有1個有義突變外，其他片段都沒有多態，這種現象可能是因為中國美利奴羊TLR4基因在所檢測的區域是比較保守的，由此也可得出中國美利奴羊具有多態位點的改變。有關更多的突變基因可能位于中國美利奴羊TLR4基因的其他外顯子或啟動子區、調控區域，還有可能是檢測樣本量和羊所選地區偏少導致的。因此，須要擴大樣本的數量和對多個地區的中國美利奴羊進行進一步的研究。

參考文獻：

[1][ZK（#][JP2]Hashimoto C，Hudson K L，Anderson K V The toll gene of drosophila，required for dorsal-ventral embryonic polarity，appears to encode a transmembrane protein[J] Cell，1988，52（2）：269-279

[2]韓凝，張彩，羅南萍 TLR4研究進展與腎臟疾病[J] 放射免疫學雜志，2009，22（2）：133-135

[3]Kiechl S，Lorenz E，Reindl M，et al Toll-like receptor 4 polymorphisms and atherogenesis[J] New England Journal of Medicine，2002，347（3）：185-192

[4]Szomolanyi-Tsuda E，Liang X，Welsh R M，et al Role for TLR2 in NK cell-mediated control of murine cytomegalovirus in vivo[J] Journal of Virology，2006，80（9）：4286-4291

[5][JP3]張欣，張小麗，馬小軍，等 甘肅高山細毛羊TLR2基因遺傳多態性及其與乳房炎相關性[J] 江蘇農業學報，2015，31（6）：1357-1361

[6]李靜，姜相君 Toll樣受體及其基因多態性與胃黏膜疾病相關性的研究進展[J] 胃腸病學，2015（7）：431-434

[7]劉繼峰，瞿鑌，王向東，等 TLR2、4基因多態性與尖銳濕疣患者易感性及復發的相關性研究[J] 中華男科學雜志，2015，21（8）：708-712

[JP2][8]韓璐，趙真真，王笑峰，等 TLR3和TLR4基因多態性與EBV相關胃癌易感性的關系[J] 腫瘤防治研究，2015，42（1）：14-18

[9]趙剛，余梅，崔群維，等 牛血液組胺濃度、TLR4基因多態性與抗蜱能力的關聯分析[J] 中國奶牛，2015（6）：1-5

[10][ZK（#]呂偉麗，馬小軍，張小麗，等 綿羊TLR4基因的遺傳多態性分析[J] 江蘇農業學報，2014，30（4）：790-795

[11]劉守仁，邵長發，張鳳林，等 中國美利奴羊（新疆軍墾型）多胎品系的選育研究[J] 畜牧與獸醫，1995（6）：246-248

[12]Mu X Y，Zhao J，Yuan X，et al Gene polymorphisms of Toll-Like receptor 9 -1486TC and 2848GA in cervical Cancer risk[J] International Journal of Gynecological Cancer，2015，25（7）：1173-1178

[13]吳春香，薛超，廖蘊華，等 TLR4基因1837AG多態性與廣西漢族人群原發抗中性粒細胞胞漿抗體相關性小血管炎的相關性[J] 廣東醫學，2015（4）：528-531

[14]林茂虎，朱曉應，苗芮，等 TLR-2和TLR-4受體單核苷酸多態性與鮑曼不動桿菌感染的相關性[J] 解放軍醫學院學報，2015（8）：829-831

[15]王永堂，蔣建新，段朝霞，等 TLR4基因啟動子區多態性及其對蛋白表達的影響[J] 現代生物醫學進展，2009，9（7）：1209-1212

[16]Gao J，Liu K，Liu H，et al A complete DNA sequence map of the ovine major histocompatibility complex[J] BMC Genomics，2010，11（11）：466

[17]李玉梅，姚紀元，吳靜，等 PCR-SSCP技術的研究及應用進展[J] 生物技術通報，2007（6）：71-74endprint