擬南芥熱激因子AtHsfA1a在低溫脅迫下對細(xì)胞程序性死亡中Caspase—3活性的影響

郭麗紅　徐婭　郤秋霞　李念　檀文濤　張學(xué)蘭

摘要：為了研究擬南芥熱激因子AtHsfA1a對低溫脅迫下細(xì)胞程序性死亡（programmed cell death，簡稱PCD）中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific protease，簡稱Caspase）活性的影響，進(jìn)一步確定擬南芥熱激因子AtHsfA1a與低溫脅迫中PCD的關(guān)系。以熱激因子AtHsfA1a不同基因型（野生型、基因沉默型）的擬南芥為材料，首先獲得單細(xì)胞，于4 ℃處理1 h后，測定熱激因子AtHsfA1a的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)基因沉默型中AtHsfA1a的表達(dá)量低于野生型。接著用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，簡稱DAPI）進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果表明，低溫脅迫后野生型未出現(xiàn)凋亡小體，基因沉默型的細(xì)胞出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡小體。最后根據(jù)熒光底物Ac-DEVD-pNA的斷裂程度測定Caspase-3活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低溫處理后的擬南芥Caspase-3活性明顯增強(qiáng)，而]AtHsfA1a基因沉默型擬南芥Caspase-3活性比野生型擬南芥的高，說明低溫脅迫下擬南芥AtHsfA1a能夠抑制Caspase-3蛋白酶的活性。研究結(jié)果初步表明，在低溫脅迫下擬南芥熱激因子AtHsfA1a可以通過抑制 Caspase-3 蛋白酶的活性而對細(xì)胞程序性死亡有一定的抑制作用，這對于揭示植物耐逆境反應(yīng)機(jī)制具有重要意義。

關(guān)鍵詞：擬南芥；熱激因子AtHsfA1a；低溫脅迫；細(xì)胞程序性死亡；Caspase-3活性

中圖分類號： Q94578文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A[HK]

文章編號：1002-1302（2017）21-0024-03[HS）][HT9SS]

收稿日期：2016-06-02

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：31260061、31060039）；云南省高校特色生物資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（編號：GXZD201601）。

作者簡介：郭麗紅（1971—），女，云南大理人，博士，教授，主要從事植物生理學(xué)與分子生物學(xué)研究。E-mail：guolihong7122@163com。

在自然界中，低溫是影響植物生長發(fā)育、制約農(nóng)作物增產(chǎn)增收的主要因子。植物細(xì)胞在遭受各種低溫脅迫時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控一系列防御基因的表達(dá)，啟動相應(yīng)的耐低溫生理、生化途徑，從而獲得耐低溫能力。植物熱激因子（heat shock transcription factor，簡稱HSF）是真核生物中結(jié)構(gòu)和功能上相對保守的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，多個(gè)HSFs家族成員形成了復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)[1-2]。根據(jù)寡聚域的區(qū)別，HSF可分為A、B、C三類，A類HSF（HsfA）主要負(fù)責(zé)基因表達(dá)的調(diào)控[3-4]。擬南芥中存在21個(gè)HSFs，研究表明，AtHsfA1a是HsfA類中參與逆境調(diào)控的重要轉(zhuǎn)錄因子[5-7]。研究發(fā)現(xiàn)，逆境脅迫可以誘導(dǎo)植物細(xì)胞程序性死亡（programmed cell death，簡稱PCD），PCD是一個(gè)由基因決定的自動結(jié)束生命的過程，表現(xiàn)出特殊的細(xì)胞形態(tài)特征，具有復(fù)雜的生化基礎(chǔ)[8-10]。關(guān)于HSF對PCD的調(diào)控，在動物中獲得了一些有價(jià)值的研究成果，研究發(fā)現(xiàn)哺乳動物HSF1誘導(dǎo)熱激蛋白的表達(dá)可以保護(hù)細(xì)胞免受脅迫引起的細(xì)胞凋亡[11]，HSF1可以調(diào)控干細(xì)胞中與PCD相關(guān)基因FasL的表達(dá)[12]，也可以調(diào)控腸癌細(xì)胞的抗細(xì)胞凋亡基因[WTBX][STBX]BAG3和XAF-1的表達(dá)[13-14]。但是對于植物中HSF與PCD的直接關(guān)系研究相對較少，尚不清楚熱激因子AtHsfA1a是否調(diào)控PCD以及如何調(diào)控PCD。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，簡稱Caspase）家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3是凋亡信號通路中一個(gè)重要的蛋白酶，也是凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行分子[15-16]。關(guān)于Caspase-3能否在AtHsfA1a調(diào)控PCD的過程中起作用值得研究。為了研究擬南芥熱激因子AtHsfA1a對低溫脅迫下細(xì)胞程序性死亡中Caspase-3的影響，以熱激因子AtHsfA1a不同基因型（野生型、基因沉默型）的擬南芥為試驗(yàn)材料，在低溫處理后，測定熱激因子AtHsfA1a的表達(dá)量并觀察細(xì)胞形態(tài)，分析擬南芥熱激因子AtHsfA1a對低溫脅迫下Caspase-3活性的影響。本試驗(yàn)旨在鑒定擬南芥熱激因子AtHsfA1a與低溫脅迫下PCD的關(guān)系，對于揭示熱激因子AtHsfA1a的作用機(jī)制和PCD的調(diào)控機(jī)制均具有重要的意義。

1材料與方法

11材料

擬南芥哥倫比亞種（Arabidopsis thaliana，ecotype Columbia）；]AtHsfA1a基因沉默的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株（ST）、野生型擬南芥植株（WT），由云南省高校特色生物資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

12方法

121擬南芥]AtHsfA1a不同基因型單細(xì)胞獲得及低溫處理用01%HgCl2和70%乙醇對擬南芥種子進(jìn)行滅菌處理后，將種子接種于MS固體培養(yǎng)基中，置于25 ℃光照下萌發(fā)。待種子長出3或4張真葉時(shí)，將小苗移至土壤中，用保鮮膜遮蓋，遮陰恒溫培養(yǎng)3 d后去膜，4周后取不同基因型擬南芥葉片，用無菌水沖洗干凈后依次用75%乙醇、01% HgCl2滅菌。將滅菌的擬南芥葉片切成邊長為05 mm的正方形葉片，將葉片置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基中添加 3 mgL 2，4-D、03 mgL 6-BA）上，置于25 ℃溫度條件下光照培養(yǎng)（16 000 lx），誘導(dǎo)愈傷組織。將疏松透明的愈傷組織放入液體培養(yǎng)基（以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加3 mgL 2，4-D、03 mgL 6-BA）中。在120～140 rmin、（25±05） ℃的搖床中進(jìn)行振蕩懸浮培養(yǎng)，每周更換新鮮液體培養(yǎng)基2次，每次更換13體積，直至獲得分散的單個(gè)懸浮細(xì)胞。將單細(xì)胞培養(yǎng)液置于4 ℃低溫處理1 h，以25 ℃為對照溫度。endprint

122擬南芥]AtHsfA1a不同基因型細(xì)胞低溫處理后AtHsfA1a表達(dá)量的測定參照Guo等的方法[17]。總RNA提取采用QIAGEN RNA提取試劑盒，采用15%瓊脂糖凝膠電泳（120 V）15 min，在凝膠成像儀下檢測總RNA。按照下列配方反轉(zhuǎn)錄合成cDNA：RNAmRNA（8 μL）、Transcript TmRTRI Enzyme Mix（1 μL）、Anehored Oligo（dT）18（1 μL）、2×TS Reaction Mix（10 μL），加RNase-free water 定容至 20 μL，輕輕混勻后，在85 ℃水浴鍋中加熱5 min以失活Trans ScriptTMRT。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為PCR模板，[WTBX][STBX]Actin2作為內(nèi)參，擴(kuò)增引物如下：[WTBX][STBX]AtHsfA1a-F，5′-AATGGGCTTGGAGAG [JP3]ATGAAT-3′，[WTBX][STBX]AtHsfA1a-R，5′-AATGCCGAGACTTCCCAGAT-3′；[WTBX][STBX]Actin2-F，5′-TTGTCACACACAAGTGCATCAT-3′，[WTBX][STBX]Actin2-R，5′-AAGCTGGGGTTTTATGAATGG-3′。PCR擴(kuò)[JP3]增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增后的產(chǎn)物用15%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

123擬南芥]AtHsfA1a不同基因型細(xì)胞程序性死亡的形態(tài)特征觀察取于4 ℃處理1 h的2種類型擬南芥單細(xì)胞，涂在載玻片上，用01%多聚甲醛固定30 min，再用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，簡稱PBS）洗5 min。將制備好的裝片用5 mgL 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，簡稱DAPI）染液染色10 min，用蓋玻片封片，避光將制作好的裝片放到載物臺上，用熒光正置顯微鏡在359 nm激發(fā)光下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

124擬南芥]AtHsfA1a不同基因型細(xì)胞中Caspase-3活性的檢測將細(xì)胞在液氮中研磨后，懸浮在裂解液[含 50 mmolL pH值80的Tris-HCl，15 mmolL NaCl，1%Triton X-100，01 mgL苯甲基磺酰氟（PMSF）]中，在冰上輕輕搖動培養(yǎng)30 min后，于4 ℃、12 000 g離心5 min，取上清液備用。蛋白濃度測定采用Bradford的方法[18]。Caspase-3的活性通過測定熒光底物Ac-DEVD-pNA的斷裂程度來衡量[以單位時(shí)間、單位質(zhì)量蛋白的對硝基苯胺（p-nitroaniline，簡稱pNA）的數(shù)量表示]，在405 nm處測定自由熒光pNA的吸光度[19]。

2結(jié)果與分析

21擬南芥AtHsfA1a不同基因型細(xì)胞中低溫脅迫后[WTBX][STBX]AtHsfA1a的表達(dá)情況[HT]

以]AtHsfA1a基因沉默的轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株為試驗(yàn)材料，擬南芥]AtHsfA1a基因沉默植株是本試驗(yàn)前期通過RNA干擾技術(shù)獲得內(nèi)源]AtHsfA1a基因沉默的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。由于RNA干擾，該植株]AtHsfA1a基因不能正常表達(dá)。為了探究擬南芥熱激因子AtHsfA1a對低溫脅迫下細(xì)胞程序性死亡中Caspase-3活性的影響，首先必須研究在低溫環(huán)境下]AtHsfA1a基因沉默的轉(zhuǎn)基因植株和野生型中]AtHsfA1a基因的表達(dá)情況。將2種基因型細(xì)胞在4 ℃低溫處理1 h，以 25 ℃ 為對照溫度，然后提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再用[WTBX][STBX]AtHsfA1a引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由圖1可以看出，在25 ℃下野生型的AtHsfA1a條帶比基因沉默型的亮；在4 ℃下，2種基因型的AtHsfA1a條帶亮度明顯增強(qiáng)，但野生型的AtHsfA1a條帶也明顯比基因沉默型的亮，說明基因沉默型的熱激因子的AtHsfA1a由于RNA干擾無法正常表達(dá)。以Actin2為對照，計(jì)算相對表達(dá)量，從圖2中可以看出，在同一溫度下，野生型中AtHsfA1a的表達(dá)量高于基因沉默型，經(jīng)過低溫脅迫處理后的野生型中的表達(dá)量增量較多，而基因沉默型中的表達(dá)量雖有所增加，但增加量相對較少。

22擬南芥AtHsfA1a不同基因型細(xì)胞中低溫脅迫后細(xì)胞程序性死亡的形態(tài)特征[HT]

將熱激因子AtHsfA1a不同基因型的細(xì)胞置于4 ℃低溫處理1 h后，通過DAPI染色后封片，在熒光顯微鏡下觀察。從圖3中可以看出，野生型擬南芥的單細(xì)胞在低溫脅迫下，細(xì)胞核開始發(fā)生變化，但未出現(xiàn)凋亡小體，基因沉默型的細(xì)胞出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡小體，細(xì)胞質(zhì)的濃縮現(xiàn)象更突出。細(xì)胞程序性死亡凋亡小體出現(xiàn)在熱激因子AtHsfA1a表達(dá)量低的基因沉默型植株中，初步推測低溫脅迫下擬南芥熱激因子AtHsfA1a對細(xì)胞程序性死亡有一定的抑制作用。

23擬南芥熱激因子AtHsfA1a低溫脅迫后對Caspase-3活性的影響[HT]

以熱激因子AtHsfA1a不同基因型的細(xì)胞為試驗(yàn)材料，低溫脅迫處理后，根據(jù)熒光底物Ac-DEVD-pNA的斷裂程度測定Caspase-3活性。從圖4中可以看出，與25 ℃處理相比，經(jīng)過低溫4 ℃處理1h后，野生型擬南芥和沉默型擬南芥Caspase-3活性均明顯增強(qiáng)，但基因沉默型擬南芥Caspase-3活性高于野生型擬南芥的Caspase-3活性，這與圖2的熱激因子AtHsfA1a的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，說明擬南芥熱激因子AtHsfA1a在低溫脅迫下對Caspase-3活性有抑制作用。

3討論與結(jié)論

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在正常環(huán)境中，HSF主要以無活性單體的形式存在，受到逆境脅迫時(shí)，單體向有活性的同源三聚體形式轉(zhuǎn)變，三聚體能與熱激元件結(jié)合，從而導(dǎo)致抗逆基因的表達(dá)[3-5]。本研究采用]AtHsfA1a基因沉默的轉(zhuǎn)基因植株為試驗(yàn)材料，該植株是利用RNA干擾技術(shù)將2個(gè)反向重復(fù)的[WTBX][STBX] C-AtHsfA1a 序列克隆到植物發(fā)夾RNA表達(dá)載體中，從而篩選出穩(wěn)定、有效的內(nèi)源]AtHsfA1a基因沉默的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。通過RT-PCR方法檢測低溫脅迫后熱激因子AtHsfA1a的表達(dá)情況，結(jié)果表明，盡管低溫處理后不同基因型熱激因子AtHsfA1a的表達(dá)量均會增加，但是與野生型相比，]AtHsfA1a基因沉默型植株在低溫脅迫后表達(dá)量明顯較少。表達(dá)量的減少勢必會影響熱激因子AtHsfA1a執(zhí)行生理功能。植物在逆境中會發(fā)生細(xì)胞程序性死亡，本研究結(jié)果也表明，低溫脅迫后野生型細(xì)胞核開始發(fā)生變化，但未出現(xiàn)凋亡小體，而基因沉默型的細(xì)胞出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡小體，細(xì)胞程序性死亡凋亡小體出現(xiàn)在熱激因子AtHsfA1a表達(dá)量低的基因沉默型植株中，表明冷脅迫下擬南芥熱激因子AtHsfA1a對細(xì)胞程序性死亡有一定的抑制作用。至于擬南芥熱激因子AtHsfA1a是如何抑制細(xì)胞程序性死亡的，涉及復(fù)雜的生化基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)各種富含半胱氨酸Caspase被激活后，能夠在靶蛋白的特異天冬氨酸殘基部位進(jìn)行切割，從而造成細(xì)胞程序性死亡，其中 Caspase-3是凋亡信號通路中一個(gè)重要的蛋白酶，也是凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行分子[12]。Caspase-3正常以酶原（32 ku）的形式存在于胞漿中，沒有活性。在凋亡的早期階段，Caspase-3被激活；活化的Caspase-3由2個(gè)大亞基（17 ku）和2個(gè)小亞基（12 ku）組成，裂解相應(yīng)的胞漿、胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[13]。關(guān)于熱激因子AtHsfA1a抑制PCD是否與 Caspase-3活性有關(guān)需要深入研究。為了研究擬南芥熱激因子AtHsfA1a對低溫脅迫下細(xì)胞程序性死亡中Caspase-3活性的影響，探究擬南芥熱激因子AtHsfA1a與逆境中PCD的關(guān)系，本試驗(yàn)將AtHsfA1a不同基因型（野生型、沉默型）的擬南芥幼苗于4 ℃低溫處理1h后，在用RT-PCR技術(shù)分析擬南芥熱激因子AtHsfA1a表達(dá)量和觀察細(xì)胞形態(tài)的基礎(chǔ)上，根據(jù)熒光底物Ac-DEVD-pNA的斷裂程度，測定Caspase-3的活性，經(jīng)過低溫處理后的擬南芥類Caspase-3活性明顯增強(qiáng)，說明低溫可以誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡。而結(jié)果也顯示，基因沉默型擬南芥類Caspase-3活性相對較高，野生型擬南芥類Caspase-3活性相對較低，與熱激因子AtHsfA1a的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，說明低溫脅迫下熱激因子AtHsfA1a抑制擬南芥Caspase-3蛋白酶的活性。至于熱激因子AtHsfA1a影響Caspase-3蛋白酶活性是通過調(diào)控細(xì)胞程序性死亡其他基因的表達(dá)來調(diào)控Caspase-3蛋白酶活性大小，還是直接調(diào)控Caspase-3蛋白酶表達(dá)，還需要通過染色質(zhì)免疫沉淀分析、凝膠阻滯電泳及酵母雙雜交等方法進(jìn)行進(jìn)一步研究。本研究初步表明，熱激因子AtHsfA1a可能通過抑制類Caspase-3蛋白酶的活性而對細(xì)胞程序性死亡有一定的抑制作用，從而保護(hù)植物免受逆境的傷害。從分子水平鑒定擬南芥熱激因子AtHsfA1a與逆境中PCD關(guān)鍵基因[WTBX][STBX]Caspase-3的關(guān)系，對于揭示植物抗逆機(jī)制具有重要的意義。endprint

參考文獻(xiàn)：

[1][ZK（#]Akkerfelt M，Morimoto R I，Sistonen L Heat shock factors：integrators of cell stress，development and lifespan[J] Nature Reviews：Molecular Cell Biology，2010，11（8）：545-555

[2]Kotak S，Larkindale J，Lee U，et alComplexity of the heat stress response in plants[J] Current Opinion in Plant Biology，2007，10（3）：310-316

[3]von Koskull-Dring P，Scharf K，Nover L The diversity of plant heat stress transcription factors[J] Trends Plant Sci，2007，12（10）：452-457

[4]Li M，Doll J，Weckermann K，et al Detection of in vivo interactions between Arabidopsis class A-HSFs，using a novel BiFC fragment，and identification of novel class B-HSF interacting proteins[J] Eur J Cell Biol，2010，89（23）：126-132

[5]Liu H C，Liao H T，Charng Y Y The role of class A1 heat shock factors （HSFA1s）[KG23]in[KG23]response[KG23]to[KG23]heat and other stresses in Arabidopsis[J] Plant Cell Environ，2011，34（5）：738-751[LM]

[6][ZK（#]Nover L，Bharti K，Dring P，et al Arabidopsis and the heat stress transcription factor world：how many heat stress transcription factors do we need？[J] Cell Stress Chaperones，2001，6（3）：177-189

[7]Dring P，Treuter E，Kistner C，et al The role of AHA motifs in the activator function of tomato heat stress transcription factors HsfA1 and HsfA2[J] Plant Cell，2000，12（2）：265-278

[8]PennellR I，Lamb C Programmed cell death in plants[J] Plant Cell，1997，9 （7）：1157-1168

[9]Lin J，Wang Y，Wang G Salt stress-induced programmed cell death in tobacco protoplasts is mediated by reactive oxygen species and mitochondrial permeability transition pore status[J] J Plant Physiol，2006，163（7）：731-739

[10][ZK（#]Xu C J，Chen K S，F(xiàn)erguson I B Programmed cell death features in apple suspension cells under low oxygen culture[J] Bioscience & Biotechnology，2004，5（2）：137-143

[JP2][11]Gechev T S，Van Breusegem G F，Stone J M，et al Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death[J] BioEssays，2006，28（11）：1091-1101

[12]Gechev T S，Hille J Hydrogen peroxide as a signal controlling plant programmed cell death[J] J Cell Biol，2005，168（1）：17-20

[13]Thonel A D，Mezger V，Garrido C Implication of heat shock factors in tumorigenesis：therapeutical potential[J] Cancers，2011，3：1158-1181

[14]Jacobs A T，Marnett L J HSF1-mediated BAG3 expression attenuates apoptosis in 4-hydroxynonenal-treated colon cancer cells via stabilization of anti-apoptotic Bcl-2 proteins[J] J Biol Chem，2009，284（14）：9176-9183

[15]Beere H M ‘The stress of dying：the role of heat shock proteins in the regulation of apoptosis[J] J Cell Sci，2004，117：2641-2651

[16]Ahn S G，Thiele D J Redox regulation of mammalian heat shock factor 1 is essential for Hsp gene activation and protection from stress[J] Genes and Development，2003，17（4）：516-528

[17]Guo L H，Cai J，Yu Z X，et al Influence of High Temperature on the Expression of Arabidopsis Heat Shock Transcription Factor ]AtHsfA1a[J] Agricultural Biotechnology，2013，2（12）：13-15

[18]Bradford M MA rapid and sensitive method for the quantification of microdram quantities of protein sutilizing the principle of protein-dye-binding[J] AnalytBiochem，1976，44：276-287

[19]Zhang L，Jiang H，Gao X，et al Heat shock transcription factor 1 inhibits H2O2-induced apoptosis via down-regulation of reactive oxygen species in cardiac myocytes[J] Mol Cell Biochem，2011，347（12）：21-28endprint