程控降溫法與二步法對胎盤間充質干細胞凍存效果的影響

章毅，陳侃俊，李萍，李冉，陳亮，陸薇，伍婷，金魏名

程控降溫法與二步法對胎盤間充質干細胞凍存效果的影響

章毅*，陳侃俊*，李萍，李冉，陳亮，陸薇，伍婷，金魏名

目的觀察對比程控降溫法與二步法對胎盤間充質干細胞深低溫凍存效果的影響。

方法分別采用程控降溫法和二步法對 3 個批次的pMSCs 進行液氮凍存，3 個月后進行復蘇，測定細胞存活率、活細胞數，觀察體外培養 1 ～ 4 d 時的細胞形態，CCK8法進行細胞增殖檢測，同時用流式細胞術鑒定細胞表面標記抗原，用油紅 O 染色、茜素紅 S 染色和 Masson 染色進行細胞三向分化能力鑒定。

結果程控降溫法對比二步法凍存的細胞活率在凍存前、復蘇后均無顯著差異（P＞ 0.05）。倒置顯微鏡觀察細胞形態，均在 24 h 時貼壁，呈短梭形，96 h 時細胞密度達到 95%左右，均勻鋪滿視野。增殖測定結果顯示，培養第 3 ～ 5 天為兩組細胞的對數生長期，第 5 天時增殖倍數達到最高，分別為第 1 天的 6.44 倍和 6.29 倍，經過短暫的平臺期后進入衰亡期，增殖趨勢一致；但分別在第 4 天（P＜ 0.01）、第 6 天（P＜ 0.05）和第 7 天（P＜ 0.05）時，程控降溫法凍存的細胞存活率極顯著或顯著高于二步法凍存的細胞。兩種方法凍存細胞的表面標志性抗原 CD73、CD90、CD105陽性細胞數百分比分別為 99.85%、99.87%、96.45% 和99.73%、99.73%、96.17%。誘導 14 d 后兩組 pMSCs 均出現明顯的成脂、成軟骨、成骨細胞特性。

結論采用程控降溫法或二步法凍存 pMSCs 均能很好地維持細胞活力及生物特性，在條件允許情況下宜采用程控降溫法，以獲得增殖能力更好的種子細胞。

低溫保存； 胎盤間充質干細胞； 程控降溫法； 二步法

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類具有自我增殖能力和多向分化潛能的干細胞類型，最早從骨髓中分離得到，后來發現在脂肪、肝臟、皮膚、軟骨、外周血等多種組織中也有少量存在。最新研究表明，MSCs 具有促進移植造血干細胞歸巢、預防移植物抗宿主病、調節免疫功能、促進損傷組織修復等作用，被認為是再生醫學和組織工程領域重要的種子細胞和最具開發潛力的治療工具。胎盤間充質干細胞（placenta derived mesenchymal stem cells，pMSCs）不僅具有間充質干細胞的功能特性，相比于其他來源，還具有含量豐富、獲取過程為非侵襲性操作、低免疫原性、實現胎盤生物資源再利用等優點，是目前用于科學研究和臨床應用最廣泛的間充質干細胞類型之一。隨著人們對 MSCs 研究的不斷拓展和深入，種子細胞的質量變得尤為重要。低溫凍存作為 pMSCs 保存的重要手段，其對凍存細胞活力、生物學特性等質量參數和細胞數量的影響將直接關系后續研究及臨床藥物開發的有效開展。本文以胎盤間充質干細胞為研究對象，采用程控降溫法和二步法對其進行為期 3 個月的深低溫凍存，觀察兩種凍存方法對 pMSCs 增殖能力、生物學特性和分化潛能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 獨立采集 3 個批次胎盤，源于足月產健康新生兒，經產婦或家屬簽署知情同意書后獲得，符合國家相關法律和倫理委員會規定。成脂、成軟骨、成骨誘導試劑盒以及 FBS、DMEM為美國 Gibco 公司產品；CCK8 試劑盒為上海碧云天生物技術有限公司產品；MSC Phenotyping Kit（CD105-PE、CD90-FITC、CD73-APC、CD14-/CD19-/CD34-/CD45-PerCP）為德國 Miltenyi Biotec 公司產品；油紅 O 染液、Masson 染液、茜素紅 S 染液為南京建成公司產品；0.4% 臺盼藍、DMSO 為美國 Sigma 公司產品。

1.1.2 儀器 CryoMed 7453 型程控降溫儀購自美國 Thermo 公司；MVE 1879P-190AF-GB-BB 型氣相液氮罐購自美國 MVE 公司；自動細胞計數儀購自美國 Invitrogen 公司；FACS Calibur 流式細胞儀購自美國 BD 公司。

1.2 方法

1.2.1 pMSCs 的分離培養 無菌條件下剪取胎盤絨毛膜組織，剪成約 3 mm3的碎塊，加入 II 型膠原酶 37 ℃ 恒溫消化 1.5 h，室溫 2000 r/min 離心 10 min，加入含 10% FBS 的 DMEM 培養基重懸細胞，置于 37 ℃、5% CO2恒溫培養箱內進行培養，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態和生長情況，待細胞融合度達到 80% ～ 90% 時，0.25% 胰酶消化傳代，接種密度為 5 × 104個/ml，每 2 天為細胞全量換液，每 3 ～ 4 天傳代 1 次，倒置顯微鏡下觀察 pMSCs 形態并拍照記錄。

1.2.2 pMSCs 的凍存 凍存液由 10% DMSO、30% FBS 和 60% DMEM 按體積比組成，現配現用。取 P4代 pMSCs，待其細胞融合度達到 80% ～90% 時，胰酶消化，室溫 1500 r/min 離心 5 min，用凍存液重懸后加入凍存管，凍存細胞密度為（1 ～ 5）× 106個/ml，經程控法或二步法對細胞進行凍存。

程控降溫法的凍存程序為：以 1 ℃/min 的速率從 4 ℃ 降溫至 0 ℃，維持 5 min，再以 1 ℃/min的速率降溫至 -30 ℃，接著以 5 ℃/min 的速率降溫至 -80 ℃，最后直接置于 -196 ℃ 氣相液氮罐中保存。二步法凍存程序為：將細胞直接轉至-80 ℃ 冰箱保存 12 h，然后置于氣相液氮罐中保存。同一胎盤樣本的兩個凍存組各含 6 管 pMSCs，取 3 個批次胎盤重復實驗。

1.2.3 pMSCs 的復蘇 細胞凍存 3 個月后，從液氮中取出，于 37 ℃ 預熱的恒溫水浴中來回晃動，1 min 中內完成解凍，用 75% 酒精棉球擦拭凍存管外壁，將細胞轉移到 15 ml 離心管中，加入10 ml 培養基，混勻，室溫 1500 r/min 離心 5 min，棄上清，加入 3 ml 培養基重懸細胞，取 10 μl 與臺盼藍染液 1∶1 混勻后計數。細胞回收率（%）=（復蘇總細胞數/凍存總細胞數）× 100%；凍存活率（%）=（凍存活細胞數/凍存總細胞數）× 100%；復蘇活率（%）=（復蘇活細胞數/復蘇總細胞數）× 100%。

1.2.4 pMSCs 表面抗原檢測 取復蘇 pMSCs，用 PBS 調整細胞密度為 5 × 106個/ml，取 1 ml細胞分別加入鼠抗人單克隆標記抗體 CD90-FITC、CD105-PE、CD73-APC、CD14-/CD19-/CD34-/CD45-PerCP，以鼠抗人的 IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-APC、IgG1-PerCP、IgG2a-PerCP 作為同型對照，室溫避光孵育 30 min，流式細胞儀上樣檢測。

1.2.5 pMSCs 三向分化檢測 取復蘇并傳代培養的 P5代對數生長期 pMSCs，以5 × 104個/ml密度接種于 6 孔板中，置于 37 ℃、5% CO2飽和濕度的恒溫培養箱中培養，待細胞融合度達到60% ～ 70% 時，棄去原培養基，分別更換為成脂、成軟骨和成骨誘導分化培養基，每 3 天換液。誘導 14 d 后，分別用油紅 O 染液、Masson 染液、茜素紅 S 染液染色，倒置相差顯微鏡下觀察pMSCs 的成脂、成軟骨、成骨分化水平。

1.2.6 細胞增殖檢測 取復蘇 pMSCs，以 2.5 × 104個/ml 密度接種于 96 孔細胞培養板中，每個凍存管細胞設置 6 個復孔，在 37 ℃、5% CO2細胞培養箱中連續培養 8 d，每 24 小時加入 10 μl CCK8 工作液，37 ℃ 孵育 2 h，酶標儀檢測 450 nm處吸光值。

1.3 統計學處理

采用 FlowJo 7.6.1 軟件分析流式檢測結果，用GraphPad Prism 6.0 軟件進行作圖、統計學分析，組間比較采用 one-way ANOVA，所得計量數據用x±s 表示。當 P ＜ 0.05 時認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 pMSCs 復蘇活率及形態

臺盼藍染色法測定凍存前、復蘇后 pMSCs 活細胞數與細胞活率。結果顯示，程控降溫法凍存組細胞凍存前活率均值為 98.8%，復蘇活率均值為98.5%，降低了 0.3%，但無顯著差異（P ＞ 0.05）；二步法凍存組細胞凍存前活率為 97.5%，復蘇活率均值為 97%，降低了 0.5%，也無顯著差異（P ＞0.05）；同時兩個凍存組細胞的凍存前、復蘇后細胞活率無顯著差異（P ＞ 0.05），表明程控降溫法和二步法均能較好地維持 pMSCs 在凍存期間的細胞活力（表 1）。

倒置相差顯微鏡下觀察程控降溫法或二步法凍存的 pMSCs 復蘇后的細胞狀態，觀察到接種24 h 后，細胞開始貼壁生長，形態為典型的成纖維細胞樣，中間散落有透亮圓形雜細胞，培養 2 ～ 3 d處于細胞增長期，并于第 4 天時匯合成單細胞層鋪滿全皿，為長梭形，細胞排列緊密，成旋渦狀或放射狀生長。兩種方法凍存的 pMSCs 經復蘇培養，細胞形態較好（圖 1）。

表 1 pMSCs 凍存前后的細胞活率Table 1 Survival rates of pMSCs before cryopreservation and after thawing

圖 1 凍存方法對 pMSCs 形態的影響（細胞復蘇后培養：A：24 h；B：48 h；C：72 h；D：96 h）Figure 1 Effects of cryopreservation methods on pMSCs morphology (cells were thawed and cultured for A： 24 h; B： 48 h; C： 72 h; D： 96 h)

2.2 CCK8 法檢測 pMSCs 增殖

圖 2 pMSCs 復蘇培養的增殖檢測結果（*P ＜ 0.05，***P ＜0.001）Figure 2 The proliferation of pMSCs after thawed detected by CCK8 method (*P ＜ 0.05, ***P ＜ 0.001)

表 2 pMSCs 相對增殖倍數分析Table 2 Analysis of the relative proliferation folds of pMSCs

進一步進行 CCK8 細胞增殖檢測，結果（圖 2和表 2）顯示，程控降溫法凍存組細胞復蘇后培養第 2 ～ 5 天，其吸光值分別為培養 24 h 時的1.64、3.07、4.20 和 6.44 倍，二步法凍存組細胞培養第 2 ～ 5 天的吸光值分別為 24 h 時的 1.46、2.83、3.60 和 6.29 倍，其對數生長期均出現在培養第 3 ～ 5 天之間，第 5 天時細胞增殖達到最大；之后，經過短暫的平臺期，于第 6 天時進入衰亡期，6 ～ 8 d 時程控降溫凍存組和二步法凍存組細胞的吸光值分別降低為 24 h 時的 5.70、3.48、2.93倍和 5.24、2.97、2.70 倍，兩組細胞增殖趨勢一致。但是，在培養第 4 天時，程控降溫凍存組細胞OD值極顯著高于二步法凍存組細胞（P＜ 0.001），第 6、7 天時，OD值差異也具有顯著性（P＜ 0.05）。提示程控降溫法和二步法凍存的 pMSCs，其復蘇后細胞增殖趨勢及峰極值相一致，但程控降溫法相較于二步法可令細胞較早進入對數生長期，同時推遲細胞衰亡的發生。

2.3 pMSCs 表面抗原鑒定

間充質干細胞表型抗原標志物流式細胞術檢測結果發現，經程控降溫法凍存 pMSCs 復蘇后表面標記物 CD14+/CD19+/CD34+/CD45+細胞數為0.01%，間充質干細胞相關抗原 CD73、CD90、CD105 陽性細胞數表達率分別為 99.85%、99.87%、96.45%（圖 3）；同時二步法凍存 pMSCs復蘇后表面標記物 CD14+/CD19+/CD34+/CD45+細胞數百分比為 0.03%，CD73、CD90、CD105 陽性細胞數表達率分別為 99.73%、99.73%、96.17%（圖 4），均高于間充質干細胞標志性抗原表達的判別標準。表明程控降溫法或二步法凍存均能很好地維持 pMSCs 的生物學特性。

圖 3 程控降溫法凍存的 pMSCs 流式鑒定結果Figure 3 Characterization of programmed freezing pMSCs phenotype through flow cytometry

2.4 pMSCs 三向分化鑒定

pMSCs 成脂誘導 14 d，油紅 O 染色結果顯示程控降溫法凍存組細胞和二步法凍存組細胞的胞漿周圍均有大小不等的脂滴形成，并被染成紅色，隨著誘導時間的延長，細胞形態從短梭形趨向橢球形轉變，同時誘導成脂肪細胞的數目增多，脂滴顆粒變大；pMSCs 成骨誘導 14 d，細胞體積增加，茜素紅 S 染色結果顯示，兩組細胞均出現大量橘色沉淀顆粒，有明顯的“礦化”結節，表現出成骨細胞特點；pMSCs 成軟骨誘導 14 d，觀察到細胞呈貼壁扁平伸展，由長梭形變成多邊多角形態，經 Masson 染色后兩組細胞膠原纖維呈現藍紫色，具有軟骨細胞樣特點（圖 5）。兩組細胞在成脂、成骨和成軟骨分化能力上沒有表現出顯著的差異。

3 討論

隨著再生醫學全領域的快速發展，越來越多研究表明間充質干細胞在狼瘡性腎炎[1]、小兒腦性癱瘓[2]、脊髓損傷[3]、急性心肌梗死[4]、心力衰竭[5]等重大疾病的治療手段和藥物開發方面存在巨大潛力，臨床研究也已在全球范圍內陸續開展，MSCs成為繼胚胎干細胞、造血干細胞后的又一大研究熱點，并帶動其上游種子細胞庫的發展。細胞凍存是保存細胞的重要手段，凍存方法是否有效和安全直接影響 MSCs 種子細胞質量，進而影響下游功能性研究的開展和臨床藥物的開發[6]。

圖 4 二步法凍存的 pMSCs 流式鑒定結果Figure 4 Characterization of stepwise freezing pMSCs phenotype through flow cytometry

圖 5 凍存方法對 pMSCs 成脂、成骨、成軟骨細胞分化的影響Figure 5 Effects of cryopreservation methods on adipogenic, osteogenic and chondrogenic differentiation capacities of pMSCs

Pilar 等[7]對比了程控降溫法（降溫速率1 ℃/min）和二步法凍存對臍血造血干細胞的影響，結果顯示，復蘇后其有核細胞數、CD34+、CFUs、細胞存活率沒有顯著差異，都適用于臍血庫造血干細胞的凍存，但程控降溫法能更好地監控凍存過程溫度變化，實現標準化凍存。而 Ichino 和Ishikawa[8]研究發現，程控降溫法凍存淋巴細胞的復蘇活率顯著高于二步法凍存，且不影響細胞功能特性。這提示不同種類的細胞，對凍存方法、凍存條件有著不同的要求。本文采用改良的 DMSO、FBS和 DMEM 聯合作為細胞深低溫凍存保護劑，DMEM 的加入既可為凍存細胞提供酸堿緩沖和營養物質，又可避免高比例 FBS 引起潛在的干細胞分化，已被證明適用于骨髓間充質干細胞的二步法凍存[9]。目前，關于程控降溫法與二步法凍存胎盤間充質干細胞的效果對比還鮮有報道。

由于深低溫凍存本身可能誘導細胞凋亡，因此凍存期間細胞活力和活細胞數量的變化對于評價凍存效果具有基礎性意義[10]。本文對比分析程控降溫法與二步法對 pMSCs 凍存效果的差異，結果顯示，兩種凍存方法下細胞在凍存前后活細胞數量均有一定損失，但復蘇后細胞活率與凍存前細胞活率無顯著差異，這可能是由于凍存細胞復蘇、凍融與檢測過程中細胞自然損失造成的。總體上，兩種凍存方法對深低溫保存期間細胞活力的影響較小。根據國際細胞治療通用標準規定，MSCs 應表達CD105、CD73 和 CD90，同時低表達或不表達CD45 和 CD34，CD14 或 CD11b，CD79α 或CD19，貼壁生長，體外標準培養體系下可分化為成脂細胞、成骨細胞和成軟骨細胞[11]。本研究中，兩組 pMSCs 的表面標志抗原表達均高于 MSCs 判定標準，同時，經過誘導可成功分化為成脂、成骨和成軟骨細胞，提示兩種凍存方法均能很好地維持凍存細胞的完整性及生物特性。盡管復蘇活率、形態學觀察結果差異不顯著，但是相對較低的復蘇活率依然可能影響培養過程中貼壁能力強的細胞比率，有利于提高細胞復蘇后的克隆形成能力[12]。另外，組織或細胞的深低溫凍存在很大程度上受到冷卻速率的影響，過慢或過快的冷卻速率都不利于生物系統的凍存效果。冷卻速率過低時，較高的溶質濃度更易引起細胞脫水造成細胞損傷；當冷卻速率過高時，細胞內快速形成冰晶也可能帶給細胞致命性損傷[13]。另一個影響凍存效果的重要因素是各溫度階段的維持時間和溫度驟降的良好控制。當溫度維持時間過短時，冷凍保護劑難以滲透進細胞膜，反之，冷凍保護劑又會產生細胞毒性[14]。這或許可以解釋本文程控降溫法凍存組細胞在對數生長期和衰亡早期的細胞存活率顯著高于二步法凍存的細胞的原因，前者通過精確控制溫度維持時長、降溫速率，有利于冷凍保護劑更好地發揮細胞保護作用，這一區別在特定的增殖過程展現出來。

綜上，采用常規的程控降溫法或二步法凍存pMSCs，均能獲得高復蘇活率、高純度、三向分化能力強的纖維樣貼壁細胞，但程控降溫法獲得的pMSCs 增殖能力更佳，這可能是由于程控條件下細胞的冷卻速率和保持時間等更符合細胞休眠程序，減少了冰晶形成及溶劑效應對細胞的潛在損傷。盡管深低溫凍存是目前常用且公認的適用于保持各種細胞的形態和功能特性的細胞保存方法，但復蘇細胞的臨床應用效果依然受到凍存過程中多項因素的影響，如凍存速率、降溫階段的維持時長、凍存溫度、冷凍保護劑的選擇等[15-16]。因此，未來還需要有針對性地改進間充質干細胞凍存程序，調整優化細胞降溫及凍存條件，并進一步對比不同凍存方法及凍存程序下 pMSCs 的臨床應用效果，以期獲得最優的 pMSCs 種子細胞，推動間充質干細胞及細胞治療相關技術的發展。

[1] Deng D, Zhang P, Guo Y, et al. A randomised double-blind, placebo-controlled trial of allogeneic umbilical cord-derived mesenchymal stem cell for lupus nephritis. Ann Rheum Dis, 2017, 76(8)：1436-1439.

[2] Liu X, Fu X, Dai G, et al. Comparative analysis of curative effect of bone marrow mesenchymal stem cell and bone marrow mononuclear cell transplantation for spastic cerebral palsy. J Transl Med, 2017, 15(1)：48.

[3] Tan JW, Wang KY, Liao GJ, et al. Neuroprotective effect of methylprednisolone combined with placenta-derived mesenchymal stem cell in rabbit model of spinal cord injury. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(8)：8976-8982.

[4] Citro L, Naidu S, Hassan F, et al. Comparison of human induced pluripotent stem-cell derived cardiomyocytes with human mesenchymal stem cells following acute myocardial infarction. PLoS One, 2014, 9(12)：e116281.

[5] Zhao L, Liu X, Zhang Y, et al. Enhanced cell survival and paracrine effects of mesenchymal stem cells overexpressing hepatocyte growth factor promote cardioprotection in myocardial infarction. Exp Cell Res, 2016, 344(1)：30-39.

[6] Galmes A, Gutierrez A, Sampol A, et al. Long-term hematological reconstitution and clinical evaluation of autologous peripheral blood stem cell transplantation after cryopreservation of cells with 5% and 10% dimethylsulfoxide at -80 degrees C in a mechanical freezer. Haematologica, 2007, 92(7)：986-989.

[7] Pilar S, Larrea L, Soler MA, et al. Programmed versus non-programmed freezing of umbilical cord blood. Haematologica, 2000, 85(8)：890-891.

[8] Ichino Y, Ishikawa T. Effects of cryopreservation on human lymphocyte functions： comparison of programmed freezing method by a direct control system with a mechanical freezing method. J Immunol Methods, 1985, 77(2)：283-290.

[9] Luo Y, Yu Q, Ding W, et al. Effect of cryopreservation on the biological characteristics of adult bone marrow mesenchymal stem cells. Chin J Pathophysiology, 2006, 22(2)：384-387. (in Chinese)羅依, 余勤, 丁偉, 等. 低溫凍存對成人骨髓間質干細胞生物學特性的影響. 中國病理生理雜志, 2006, 22(2)：384-387.

[10] Schmidt-Mende J, Hellstr?m-Lindberg E, Joseph B, et al. Freezing induces artificial cleavage of apoptosis-related proteins in human bone marrow cells. J Immunol Methods, 2000, 245(1-2)：91-94.

[11] Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy, 2006, 8(4)：315-317.

[12] Shivakumar SB, Bharti D, Subbarao RB, et al. DMSO- and serum-free cryopreservation of wharton's jelly tissue isolated from human umbilical cord. J Cell Biochem, 2016, 117(10)：2397-2412.

[13] Mazur P, Leibo SP, Chu EH. A two-factor hypothesis of freezing injury. Evidence from Chinese hamster tissue-culture cells. Exp Cell Res, 1972, 71(2)：345-355.

[14] Fong CY, Subramanian A, Biswas A, et al. Derivation efficiency, cell proliferation, freeze-thaw survival, stem-cell properties and differentiation of human Wharton's jelly stem cells. Reprod Biomed Online, 2010, 21(3)：391-401.

[15] Castillo Alvarez A, Morier Días L, Pérez Forcada V, et al. Effect of various factors during cryopreservation on the morphology and viability of several poikilothermic cell lines. Rev Cubana Med Trop, 1990, 42(2)：188-196.

[16] Worsham DN, Reems JA, Szczepiorkowski ZM, et al. Clinical methods of cryopreservation for donor lymphocyte infusions vary in their ability to preserve functional T-cell subpopulations. Transfusion, 2017, 57(6)：1555-1565.

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2017, 12(6):513-519

Effects of cryopreservation methods on human pMSCs: programmed versus stepwise freezing

ZHANG Yi, CHEN Kan-jun, LI Ping, LI Ran, CHEN Liang, LU Wei, WU Ting, JIN Wei-ming

ObjectiveTo evaluate the effects of programmed or stepwise freezing on human placental mesenchymal stem cells (pMSCs).MethodsProgrammed or stepwise freezing was applied to three batches of pMSCs cryopreservation at -196 ℃ for three months. Cell viability and proliferation were measured through Trypan blue staining and CCK8 assay after being thawed and seeded, respectively. We further determined the characteristic antigenic markers of mesenchymal stem cells by flow cytometry. The adipogenic, osteogenic and chondrogenic differentiation capacities of pMSCs were also tested by Oil red O, Alizarin red S and Masson staining, respectively.ResultsThere was no significant difference with respect to the cell viability between programmed and stepwise freezing of pMSCs before or after being thawed (P＞ 0.05). Both groups of pMSCs adhered after 24 h culture, and reached about 95% density after 96 h. The pMSCs proliferation was in a logarithmic phase between 3 to 5 d cell culture and then reached to a declined phase. Cell viability of pMSCs cryopreserved by programmed freezing was significant higher than that by stepwise freezing at 4 d (P＜ 0.01), 6 d (P＜0.05) and 7 d (P＜ 0.05) culture. Moreover, both methods preserved the expression of antigenic markers and differentiating capacity of pMSCs.ConclusionThe cell viability and biological characteristics of pMSCs can be maintained well by programmed method or stepwise cryopreservation. It is worth mentioning that the programmed cryopreservation method should be used to obtain the seed cells with better proliferation ability under permissible conditions.

Cryopreservation; Placental mesenchymal stem cells; Programmed freezing; Stepwise freezing

Author Affiliation:Shanghai Cord Blood Bank/Shanghai Stem Cell Technology Co., Ltd./China Stem Cell Group Co., Ltd., Shanghai 200051, China

WU Ting, Email： wuting@shanghaicordblood.org

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.06.004

上海市自然科學基金（16ZR1429200）；上海市科委研發平臺專項（16DZ2293000）；上海市嘉定區科委工程技術研究中心項目；上海市企事業專利工作試點單位項目；上海張江國家自主創新示范區專項發展資金重大項目（ZJ2017-ZD-010）

200051 上海市臍帶血造血干細胞庫/上海市干細胞技術有限公司/中國干細胞集團有限公司/中國干細胞集團附屬干細胞醫院

伍婷，Email：wuting@shanghaicordblood.org

2017-08-21

*同為第一作者

www.cmbp.net.cn 中國醫藥生物技術, 2017, 12(6):513-519