人巨細胞病毒IgG抗體檢測試劑盒國家監督抽驗質量評價

胡澤斌，曲守方，孫彬裕，楊振，黃杰

人巨細胞病毒IgG抗體檢測試劑盒國家監督抽驗質量評價

胡澤斌，曲守方，孫彬裕，楊振，黃杰

人類巨細胞病毒（human cytomegalovirus，CMV），屬皰疹病毒科，乙組皰疹亞科，分子量為 150 × 106D，是直徑為 200 nm 的線狀雙鏈 DNA 病毒，人是其唯一的宿主。巨細胞病毒的主要感染途徑是與被感染病人接觸，包括接觸被感染病人的唾液、生殖器分泌物、尿液和乳汁，同時也可通過胎盤傳播或發生醫源性傳染[1-3]。CMV 是新生兒先天性致畸的重要病原微生物之一，它對胎兒的危害比風疹病毒要大，最易引起胎兒、新生兒、嬰兒的急性、慢性感染和遲發后遺癥。原發性孕期感染 CMV 的胎兒 80% 可出現智力低下，視力受損，聽力喪失等癥狀，特別是引起嬰兒的巨細胞包涵體病（CI），可致患兒多個系統、多個器官受損，病死率為 10% ～ 20%[4]。我國孕期婦女原發感染 CMV 的比例為 3% ～ 4%，而原發感染導致胎兒受到影響的幾率為 50%，我國每年出生上千萬嬰兒，因此及早檢測 CMV 感染對我國優生優育政策的實施具有重要意義[5-7]。

目前國家食品藥品監督管理總局批準的人巨細胞病毒IgG 抗體檢測試劑盒主要是基于酶聯免疫吸附法、化學發光法和免疫層析法，還包括電化學發光法、時間分辨免疫熒光法和多重微珠流式免疫熒光法。該類試劑盒數量繁雜，且生產廠商眾多，產品質量參差不齊，為查找巨細胞病毒 IgG 抗體檢測試劑盒的監督隱患，全面了解此類產品的質量現狀，切實加強對此類產品的監管，根據《食品藥品監管總局辦公廳關于印發體外診斷試劑抽驗工作方案的通知》（食藥監辦械監[2015]63 號）開展了監督抽驗工作。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 M2 SpectraMax 酶標儀購自 Molecular Devices 公司；DEM-3 洗板機購自北京拓普分析儀器有限責任公司；BK-L96C 化學發光免疫分析儀為北京科衛臨床診斷試劑有限公司產品；JETLIA-962 發光免疫分析儀為北京源德生物醫學工程有限公司產品；Maglumi 2000 Plus 全自動化學發光測定儀為深圳市新產業生物醫學工程股份有限公司產品。

1.1.2 參考品 人巨細胞病毒 IgG 抗體國家參考品（批號：36004-201101）由 19 份樣品組成，分別是：10 份陽性參考品 P1-P10；5 份陰性參考品 N1-N5；1 份重復性參考品 R 和 3 份最低檢測限參考品 L1-L3，由中國食品藥品檢定研究院提供；企業參考品均由各自企業提供。

1.1.3 樣品 按照國家監督抽驗工作統籌安排，各省（或市、區）食品藥品監管部門組織實施其行政區域內的診斷試劑的抽樣、樣品寄送和信息錄入等工作。本次抽驗共收到巨細胞病毒 IgG 抗體檢測試劑盒 15 批次，涉及 15 家生產企業，全部為國產試劑。試劑盒全部抽自生產企業。15 批次試劑盒中，酶聯免疫法 11 批次，化學發光法 4 批次；符合抽樣規定的試劑盒 15 批次，退樣 0 批次，抽樣產品信息詳細數據見表 1。

1.2 方法

法定檢驗：依據企業產品注冊標準，采用注冊標準中所規定的企業參考品或國家參考品對各自試劑盒進行檢驗，檢驗項目包括陽性符合率、陰性符合率、檢出限和重復性，4 個項目全部符合標準規定判定為合格，如有任意項判定不合格，本次抽驗綜合結論為不合格。各項目要求參見各自的產品注冊標準。實驗操作嚴格按各待測的試劑盒說明書進行。如果企業產品注冊標準中規定使用企業參考品或國家參考品進行檢測，則根據國家參考品的檢測結果進行是否合格的判定。

探索性研究：依據 YY/T1236-2014《巨細胞病毒IgG/IgM 抗體檢測試劑（盒）》的行業標準，采用人巨細胞病毒 IgG 抗體國家參考品（批號：36004-201101）對各試劑盒進行檢驗，檢驗項目和判定標準同法定檢驗。各項目要求如：待檢試劑盒檢測 10 份陽性參考品，應不得出現假陰性（準確性/陽性符合率）；檢測 5 份陰性參考品，應不得出現假陽性（特異性/陰性符合率）；3 份最低檢測限參考品，應均能檢出（檢測限/檢出限/靈敏度）；批內精密度變異系數（CV%）不大于 15.0%（重復性/精密性）。實驗操作嚴格按各待測試劑盒的說明書進行。

2 結果

2.1 法定檢驗

按照企業產品注冊標準進行檢測，如果企業產品注冊標準中規定了使用企業參考品或國家參考品，則依據國家參考品的檢驗結果判定是否合格。本次抽驗 15 批次試劑中有13 批次的注冊標準要求使用企業參考品，這 13 批次巨細胞病毒 IgG 抗體檢測試劑盒檢測合格，其余 2 批次的注冊標準是依據國家參考品的檢驗結果進行判定的，2 批次試劑不合格。本次法定檢驗的合格率為 86.7%（13/15）；2 批次試劑不合格試劑中，一家試劑盒的不合格項目是“國家陰性參考品符合率”不符合規定（有部分參考品檢出陽性），以及“國家陽性參考品符合率”也不符合規定（有部分參考品檢出陰性）；另一家試劑盒的不合格項目是“國家陰性參考品符合率”不符合規定（有部分參考品檢出陽性）。

表 1 抽樣的人巨細胞病毒（HCMV）IgG 抗體檢測試劑盒

2.2 探索性研究

使用巨細胞病毒 IgG 抗體國家參考品，按照巨細胞病毒 IgG 抗體檢測試劑（盒）行業標準 YY/T1236-2014 對15 個廠家的 15 個批次的試劑盒進行檢測，所有項目均合格的試劑有 10 批次，合格率僅為 66.7%（10/15），不合格的產品有 5 個廠家的 5 批次，不合格率達到了 33.3%。探索性研究不合格項目的具體情況見表 2。

表 2 抽樣試劑盒進行探索性研究結果不合格項列表

3 討論

巨細胞病毒 IgG 抗體檢測試劑屬于三類高風險的體外診斷試劑，在臨床應用中其準確性（陽性符合率）、特異性（陰性符合率）、檢測限（靈敏度）、重復性都是該類試劑盒的質量控制關鍵指標。準確性或陽性符合率、特異性或陰性符合率項目，是在進行性能評價時，檢測出的陰陽性結果與實際結果的一致性程度，反映了試劑的基本特性。檢測限或靈敏度是重要的分析性能之一，反映試劑可檢測的最低分析濃度。重復性是對樣品做多次測定，通過這些測定值的精密度，得到試劑測定能力是否具有重現性。

中國食品藥品檢定研究院在 2011 年研制了巨細胞病毒 IgG 抗體國家參考品[8]（批號：36004-201101），我院起草的《巨細胞病毒 IgG/IgM 抗體檢測試劑（盒）》的行業標準，已在 2014 年 6 月份通過國家食品藥品監督管理總局批準并頒布，標準編號為：YY/T 1236-2014。該標準于 2015年 7 月 1 日正式實施，適用于定性檢測人體血清/血漿中巨細胞病毒 IgG/IgM 抗體檢測試劑（盒）（酶聯免疫法）、巨細胞病毒 IgG/IgM 抗體檢測試劑（盒）（化學發光法）、巨細胞病毒 IgG/IgM 抗體檢測試劑（盒）（免疫熒光法）、巨細胞病毒 IgG/IgM 抗體檢測試劑（盒）（免疫印跡法）等，其技術條款的設計基本上也是參考國家參考品的情況，包括外觀、準確性（陽性符合率）、特異性（陰性符合率）、重復性（精密度）、檢測限。

通常在無行業標準和國家參考品情況下，企業產品注冊檢驗只能采用企業標準和企業參考品進行檢驗；如果有行業標準和國家參考品，則檢測機構應主動采用它們進行注冊檢驗，通過一把尺子來評判試劑質量更為公正和公平。但是由于此產品的國家參考品及行業標準遲于大部分企業標準，故大部分企業在產品注冊檢驗時并未采用國家參考品進行檢驗[9]。

此次監督抽驗，采用企業參考品檢測，試劑合格率達100.0%（15/15），而采用國家參考品檢測，合格率下降了33.3%，僅為 66.7%（10/15）。這就意味著企業參考品控制產品質量的有效性值得商榷。通常，企業參考品信息通過提供資料證明，檢測機構無法核實企業參考品是否屬實，因此按照企業注冊產品標準進行檢驗，在判斷產品合格存在著一定的風險。

國家參考品“陰性參考品符合率”項目不符合規定即假陽性，假陽性產生原因可能是：①樣本中存在干擾物質造成，如 RF 因子等；②其他類型抗體如 IgM、不同亞型的IgG 以及同種屬病原體的交叉反應等；③分析性能研究中正常參考人群的選擇出現偏差，其閾值設定不合理；④生產工藝存在缺陷，比如原材料抗體篩選不嚴格，親和力以及抗體反應性、特異性未充分驗證，包被和封閉等工藝需要改進等，標記抗體的濃度篩選需要改進等；⑤包被抗原的因素：如果包被的基因工程抗原為融合蛋白，包含有表達載體的一些序列，有可能與血清中其他物質發生反應產生假陽性。另外抗原的純度對特異性也有影響，目前抗原多是經過大規模表達后需要經過破碎細胞、鹽析、粒子交換等分離純化步驟才能達到一定純度。如抗原中混有其他雜蛋白，血清中的抗體可能與這些雜蛋白反應產生假陽性。國家參考品“陽性參考品符合率”項目不符合規定即是漏檢/假陰性結果，假陰性產生的主要原因可能是：①分析性能研究中正常參考人群的選擇出現偏差，其閾值設定不合理，設定閾值較高，使弱陽性樣本檢測為陰性；②肝素或者 EDTA 等抗凝處理對樣本的影響，EDTA、酶抑制劑可以抑制辣根過氧化物酶的活性，造成假陰性。重復性參考品實際為陽性樣本，出現假陰性的原因同“陽性參考品符合率項目不符合規定的原因”，CV值偏高不符合規定可能由于企業生產工藝的某些環節如分裝、混勻步驟不很穩定，造成同一批次的試劑盒的均一性較差。

此次抽驗還發現企業提供的資料存在以下問題：①缺項問題。由于各企業產品注冊標準不一樣，各檢測機構對于該產品標準的理解不一樣，因此在檢測項目的要求方面也不一樣。例如，有 1 家企業在產品注冊標準中沒有檢測限的要求而只有分析靈敏度檢測，即測定零點校準品 20 次，然后測定分析靈敏度。我們認為該試劑盒是定性試劑盒，不適合通過做分析靈敏度體現檢測限，所以建議在企業參考品中提供相應的檢測限參考品。②注冊標準要求與說明書不一致。有 1 家企業在產品執行標準中將“OD 值”明確要求如下：“試劑盒中的校正液檢測 OD 值應在規定范圍。陰性校正液 OD 不高于 0.250，臨界校正液 OD 值為 0.600 ～1.300，陽性校正液 1#的 OD 值應在臨界校正液和陽性校正液 2#之間，陽性校正液 2#的 OD 值不低于 1.300”，但是說明書中僅僅在“檢驗結果的解釋”中提到“陰性對照的檢測結果須為陰性，陽性對照的檢測結果須為陽性，陽性校正液 1#的 OD 值須介于臨界校正液與陽性校正液2#之間，否則檢測結果不可靠，不應出具檢測報告”。顯然技術對 OD 值的要求明顯嚴格于說明書，那么到底哪個是實驗成立的前提呢？OD 值界定的意義何在？③說明書表述不盡規范。有 2 家在說明書的“檢驗方法”中預留空白孔/空白對照，讀值時單波長測定 OD 值，但是并沒有說明空白孔調零；另有 4 家在說明書中未說明應該在實驗終止后多長時間內讀取 OD 值；還有 1 家企業說明書中的檢驗方法未寫明陽性對照及臨界對照是加單孔還是復孔，但計算實例中是按照復孔求平均值。

實行醫療器械監督抽驗是器械執法的一項重要技術活動，其目的是確保人民群眾用械質量安全、可靠、有效；有利于促進企業整改達標，完善管理，提高產品質量，其意義在于提高全社會對醫療器械質量實行科學監督抽驗重要性的認識。本次監督抽驗設計的抽樣企業數量不多，也沒有進口企業，而且僅僅從生產企業這一個環節進行了抽樣，建議今后加大抽驗力度，完善和優化抽驗模式，使抽驗結果更能反映產品的真實質量狀況。針對本次監督抽驗中發現的問題，筆者建議將體外診斷試劑監督抽驗工作持續深入進行下去，持續監測產品的性能，深入分析產品問題原因，繼續探討使用國家參考品作為統一的判定標準，督促企業不斷改進產品質量，為公眾用械安全保駕護航。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2017.06.014

國家自然科學基金（81472396）

100050 北京，中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑檢定所

黃杰，Email：jhuang5522@126.com

2017-08-17