抗體藥物偶聯物的彈頭分子研究進展

胡馨月，李艷萍，李卓榮

抗體藥物偶聯物的彈頭分子研究進展

胡馨月，李艷萍，李卓榮

在腫瘤治療中，化療為主要的治療手段，在殺死腫瘤細胞的同時，也對正常細胞存在殺傷作用，從而產生嚴重的毒副作用。如何將細胞毒性藥物準確輸送到病灶部位，選擇性地殺傷腫瘤細胞，漸漸引起了人們的重視。追溯到 100 年前，Paul Ehrlich 就提出了利用抗體靶向治療癌癥的“魔術子彈”概念[1]。隨著抗體技術的發展，掀起了抗體藥物偶聯物（antibody-drug conjugate，ADC）的研究浪潮，ADC 是抗體與細胞毒藥物的完美“聯姻”。ADC 是由“抗體”、“連接子”和“彈頭分子”三個主要組件構成，抗體藥物偶聯物能夠特異性識別腫瘤抗原，形成的 ADC-抗原復合物通過受體介導的胞吞作用進入靶細胞內部，釋放出高活性的彈頭分子，完成對腫瘤細胞的選擇性殺傷（圖 1）[2]。

圖 1 抗體藥物偶聯物的作用機制

理論上說化療藥物、細胞毒素、放射性核素等對腫瘤細胞具有較大殺傷作用的細胞毒性物質都可以作為 ADC 的彈頭分子，通常必須同時具備以下三點特征：①作用機制明確?；?ADC 的作用機制，理想的彈頭分子的靶點應位于細胞內，如抗有絲分裂或者抑制 DNA 復制。②彈頭分子的細胞毒作用必須極高，一般要求 EC50小于 1 nmol/L。研究表明放射標記的抗體在癌癥病人腫瘤部位攝取量很低（每克腫瘤組織僅僅集中 0.003% ～ 0.01% 的抗體注射劑量）[3]，所以彈頭分子需在較低濃度下也可發揮作用。③可以被修飾，允許被連接。天然發現的細胞毒藥物往往沒有可以連接的位點，大多數需經過結構改造，使之成為具有可連接的基團且與天然結構生物活性相當的衍生物。

為降低傳統的化療藥物（如甲氨蝶呤、環磷酰胺、長春堿類、紫杉烷類）毒副作用，增加它們的靶向性，在設計第一代抗體藥物偶聯物時，人們曾嘗試將它們偶聯在抗體上。之后很快發現，這類 ADC 在臨床使用中無法達到預期的抗腫瘤活性，甚至低于化療藥物本身的效能[4]，其主要原因在于 ADC 經注射后富集于靶部位的劑量低，加之化療藥物本身細胞毒性不夠強，治療效果大大減弱。隨之研究人員在植物、海洋生物和微生物等天然來源的化合物中尋找新型高效細胞毒性化合物，研究發現某些化合物在體外對多種腫瘤細胞的抑制活性比傳統化療藥物高 100 ～ 1000 倍[5]，IC50值能夠達到 pmol/L 水平。這些細胞毒素由于治療安全窗范圍較窄，不能作為藥物單獨使用，故可以考慮用來做 ADC的彈頭分子發揮作用。本文將對目前臨床在研 ADC 彈頭分子的進展進行綜述。

1 微管蛋白抑制劑

1.1 海兔毒素及奧瑞他汀類

海兔毒素（dolastatin）是從印度洋生物截尾海兔中發現的一類具有高細胞毒性的線性多肽類化合物。Pettit 等[6]表征了海兔毒素中多種毒性組分，并且闡明了海兔毒素 10 的作用機制和結構（圖 2，1），這類細胞毒藥物能夠顯著抑制微管蛋白的形成和聚合。海兔毒素 10 對白血病細胞L1210（IC50= 0.5 nmol/L）等腫瘤細胞具有普遍殺傷能力，對細胞的抑制活性約為長春堿的 40 倍，根霉素的 2 倍，擬莖點霉毒素 A 的 10 000 余倍[7]，然而海兔毒素 10 在單獨使用時存在毒副作用大、藥代動力學性質差、治療窗口窄等問題限制了其開發。Miyazaki 等[8]發現 N 端為仲胺的單甲基奧瑞他汀 D（monomethyl auristatin D，MMAD）毒性與海兔毒素 10 相當，將這類 N-單甲基取代的海兔毒素衍生物命名為奧瑞他汀類（auristatin），它們可實現與連接子的有效連接，新一代的高效 ADC 也由此產生[9]。

圖 2 海兔毒素類細胞毒藥物和 MMAE、MMAF 類抗體藥物偶聯物

目前，ADC 研發常用的彈頭分子為奧瑞他汀類化合物MMAE 和 MMAF（圖 2，2 和 3）。與 MMAD 相比，MMAE 的 C 端為 2-氨基-1-苯基丙基-1-醇，IC50值為10-11～ 10-9mol/L。由 Seattle Genetics 公司研發的治療霍奇金淋巴瘤和系統型間變性大細胞淋巴瘤的 Adcetris（SGN-35）在 2011 年已被 FDA 批準上市，該藥為抗CD30 人鼠嵌合抗體，采用纈氨酸-瓜氨酸（Val-Cit）酶解型連接子與 MMAE 連接，通過還原抗體鏈間 4 對二硫鍵，連接 MMAE 個數為 0、2、4、6、8 不等。研究發現，平均藥物/抗體偶聯比以 4 為最佳，該 ADC（圖 2，4）在細胞中可以完全釋放出細胞毒藥物 MMAE[10]。II 期臨床試驗報道，102 例患者以 1.8 mg/kg 給藥三周，霍奇金淋巴瘤病人總緩解率為 75%（34% 全響應，40% 部分響應），系統型間變性大細胞淋巴瘤病人總緩解率為 87%（53% 全響應），治療效果顯著[11]。目前，至少 4 項作為一線用藥的 III期臨床試驗仍在進行，以期進一步擴大其適應證范圍。MMAF 的 C 端為苯丙氨酸，體外細胞毒性比 MMAE 弱100 倍[12]，主要由于本身羧基的離子化，使得 MMAF 的膜通透性較差，阻礙了它擴散進入細胞。以 MMAF 為彈頭分子的 ADC（圖 2，5）通常使用不可裂解型連接子馬來酰亞胺基己酸（MC），在細胞內最終降解為帶有半胱氨酸（Cys）殘基的 MC-MMAF 形式，仍能夠保持很好的活性。目前，臨床在研 ADC 約 70 多個，以 MMAE 和 MMAF作為彈頭分子的 ADC 占有主導地位（表 1）。

1.2 美登素及美登素類衍生物

美登素（maytansine）是 Kupchan 等[13]于 1972 年在非洲灌木叢美登木中提取分離出來的。美登素（圖 3，6）對人口腔表皮樣癌細胞 KB 的 ED50為 10-4～ 10-5μg/ml，效果可達長春花堿的 100 ～ 1000 倍，具有良好的穩定性和溶解性。由于天然的美登素結構中沒有連接基團，經研究者對美登素的構效關系深入探究之后，C3 位可被改造為末端有巰基的新型酯類連接位點[14]。DM1 和 DM4（圖 3，7 和8）正是對 C3 位修飾后的一類美登素衍生物，此類化合物是由發酵得來的安絲菌素還原成美登醇，C3 位與連有二硫鍵的酸縮合，最終還原成末端巰基得到。

表 1 批準上市和臨床在研的奧瑞他汀類 ADC

圖 3 美登素類細胞毒藥物和 DM1、DM4 類抗體藥物偶聯物

以美登素類作為彈頭分子的 ADC 一般采用與抗體賴氨酸殘基偶聯的方式，DM1 型 ADC（圖 3，9）通常使用不可裂解型雙功能連接子 SMCC（N-succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate），在細胞內經溶酶體降解為 Lys-SMCC-DM1 形式。DM4 型 ADC（圖3，10）一般使用可裂解型連接子為 SPDB（N-succinimidyl 4-(2-pyridyldithio) butyrate） 或 SPP（ N-succinimidyl 4-(2-pyridyldithio) pentanoate），在細胞內首先分解為Lys-SPDB/SPP-DM4，再經內源性谷胱甘肽還原，二硫鍵斷裂成 SH-DM4，直接發揮作用或部分甲基化發揮更強的抗腫瘤作用。Kadcyla（T-DM1）即曲妥珠單抗-SMCC-DM1，在 2013 年批準治療轉移性晚期乳腺癌，對于 HER-2 陽性晚期乳腺癌病人使用 T-DM1 組較曲妥珠單抗與紫杉烷組毒副作用顯著降低，針對病人無進展生存時間和總生存時間均優于拉帕替尼與卡培他濱聯合用藥組[15]。另外，該藥用于晚期胃癌、非小細胞肺癌等疾病的治療也進入臨床研究中。以美登素類細胞毒藥物為彈頭分子進入臨床評價的ADC 如表 2 所示。

表 2 臨床在研和已上市美登素類抗體藥物偶聯物

圖 4 卡奇霉素類和卡奇霉素類抗體藥物偶聯物

2 DNA 損傷劑

2.1 卡奇霉素類

卡奇霉素（calicheamicin）（圖 4，11）是一類作用于DNA 的抗腫瘤抗生素，1986 年從棘孢小單孢菌中得到的發酵產物[16]，屬于典型的烯二炔類化合物，結構中含有一個 1,5-二炔-3-烯母核，一個全取代的苯，四個糖苷和一個特殊的三硫鍵?？ㄆ婷顾赝ㄟ^低聚糖片段與 DNA 結合，嵌入 DNA 雙螺旋小溝的 5'-TCCT-3' 和 5'-TTTT-3' 位點，烯二炔結構通過 Bergman 環化發生電子重排，關環成苯環雙自由基，奪取 DNA 鏈上的 H 原子，導致 DNA 鏈斷裂。其中，研究發現卡奇霉素 γ1I對體內多種腫瘤有著極好的效能，使用劑量最低達到 0.15 μg/kg[17]?；诳ㄆ婷顾?γ1I良好的抗腫瘤特性，設計了一種卡奇霉素衍生物 N-乙?；?γ-卡奇霉素，天然的三硫鍵結構改造為二硫鍵，可實現與腙鍵型或酰胺型的連接子的連接[18]。FDA 批準上市的第一個ADC 藥物 Mylotarg 就是通過腙鍵型連接子將抗 CD33的吉妥珠單抗與 N-乙?；?γ-卡奇霉素-DMH 偶聯（圖 4，12a），2009 年被批準治療急性髓系白血病。臨床使用中，該藥在 9 mg/m2的劑量下，大約有 30% 的患者得到完全緩解，但隨后發現它存在連接子不穩定，抗體 FAB 段與血清抗體易發生交換等問題，在治療過程中部分病人出現致命性肝損傷，迫使其于 2010 年撤市。

目前值得關注的是 CMC-544（圖 4，12b），現已發現其在體外有特異性好、穩定性強及活性高等優點，在重癥聯合免疫缺陷小鼠多種淋巴瘤模型中，該 ADC 可以持續抑制腫瘤生長近 100 d[19]，針對于急性淋巴細胞白血病的治療已進入 III 期臨床[20]。PF-006647263（圖 4，12c）是以 ephrin A4 為靶點，在化學、生產和控制方面均進行了合理優化，得到平均 DAR 為 4 且沒有裸抗體存在的 ADC[21]，I 期臨床用于三陰型乳腺癌的治療。

2.2 倍癌霉素類

倍癌霉素 A（圖 5，13）和倍癌霉素 SA（圖 5，14）是 19 世紀 70 年代從鏈霉菌屬 zelensis 細菌培養物中分離得到[22]，該類化合物能夠嵌入 DNA 小溝中 A-T 結構域豐富的位置，經腺嘌呤的 N3 位進攻其環丙基基團，造成DNA 烷基化，導致細胞死亡，具有抗菌、抗腫瘤功能。MDX-1203（圖 5，15）使用的倍癌霉素類似物 MED-2460是將 CBI 結構單元（圖 5，16）苯酚改造為甲基哌嗪甲酸酯前藥形式，環丙基開環替換成氯甲基，吡咯上的 N 連接氨基取代吲哚。該 ADC 靶向于 CD70 抗原，DAR 為1.25，在腎細胞癌 786-O 裸鼠模型中，以 38 mg/kg 劑量給藥兩次后腫瘤可完全消退，I 期臨床試驗用于治療腎上皮細胞癌和非霍奇金淋巴瘤，藥物安全性高，病人以 8 mg/kg的劑量耐受性良好[23]。SYD985（圖 5，17）選用的彈頭分子 是 倍 癌 霉 素 咪 唑 并 [1,2-α]吡 啶 系 列 衍 生 物seco-DUBA[24]，通過還原曲妥珠單抗鏈間二硫鍵偶聯，經疏水作用層析分離后使得每個抗體平均連接 2.8 個seco-DUBA[25]，該 ADC 也已進入 I 期臨床，治療多種非特異性實體瘤，主要是以 HER2 過表達的實體瘤為主。

圖 5 CBI 單元、倍癌霉素類和倍癌霉素類抗體藥物偶聯物

2.3 安曲霉素類衍生物 PBD

19 世紀 60 年代，從鏈霉菌屬 Streptomyces refuineus var. thermotolerans 中發酵提取分離得到安曲霉素[26]（圖 6，18），并發現了一類具有抗菌、抗腫瘤的結構類似物 PBD（pyrrolobenzodiazepine，吡咯并苯并二氮雜?）家族分子，研究共發現了 13 種不同 PBD 天然單體類型，它們均是由吡咯環 A、二氮雜? B 和芳環 C 組成，通過 N10/C11 亞胺功能團與 DNA 小溝鳥嘌呤的 C2 位氨基作用而發揮生物學功能。隨后，有人進一步探究發現 PBD 二聚體較 PBD與 DNA 作用面積更大，可與鳥嘌呤形成兩個共價鍵，增加了序列的選擇性[27]，且二聚體對于多種腫瘤細胞系（如乳腺癌細胞 MCF-7、卵巢癌細胞 A2780 等）的活性達到pmol/L 級別，如 DSB-120（圖 6，19）是由兩分子 DC-81（圖 6，20）通過丙二醚鍵相連，以 GATC 序列為中心橫跨了 6 個堿基對與 DNA 交聯，相對于 DC-81 單體體外活性增加了 600 倍。自 2013 年以來，PBD 二聚體這種高效作用于 DNA 的特性逐漸作為新型 ADC 彈頭分子被使用，地位僅次于海兔毒素類和美登素類。Seattle Genetics 公司研發的一系列以 PBD 為彈頭分子的 ADC 都是以酶裂解性纈氨酸-丙氨酸（VA）為連接子，通過工程化半胱氨酸的偶聯技術得到平均 DAR 為 1.9。目前有 5 個靶點的ADC（圖 6，21）：SGN-CD33A、SGN-CD70A、SGN-CD19B、SGN-CD123A、SGN-352A 分別治療急性髓系白血?。↖II期）[28]、腎上皮細胞癌（II 期）[29]、非霍奇金淋巴瘤（I 期）、急性髓系白血病（I 期）和多發性骨髓瘤（I 期）。

2.4 喜樹堿類衍生物 SN-38

喜樹堿（圖 7，22）通過作用于 DNA 拓撲異構酶 ? 抑制 DNA 的復制和轉錄，導致腫瘤細胞死亡，具有強體外抗腫瘤活性。然而，喜樹堿水溶性差，內酯環易開環，從而降低了生物利用度，限制其臨床應用。設計帶有哌嗪環前藥的喜樹堿類衍生物伊立替康（圖 7，23），它在體內以關閉的內酯和開環的羧酸鹽兩種形式存在，代謝產物 SN-38（圖 7，24）為主要的抗腫瘤成分。SN-38 的 C20 位羥基除了能夠降低內酯環在體內降解速率外，還可以與連接子相連用于 ADC 的開發。Labetuzumab-SN-38（IMMU-130，圖 7，25a）為抗 CD66-CL2（賴氨酸-苯丙氨酸）-SN-38，臨床前研究顯示其可顯著延長直腸癌和胰腺癌小鼠生存率，目前 II 期臨床治療復發/難治型結腸癌。IMMU-132（圖7，25b，抗 Trop-2-SN-38）是通過 CL2A（賴氨酸，Lys）型連接子連接人源化單抗 hRS7 和 SN-38，由于 Trop-2 抗原能夠廣泛表達在腫瘤滋養層細胞表面[30]，因此 IMMU-132在大腸癌、食管癌、三陰性乳腺癌、小細胞肺癌和非小細胞肺癌患者中均取得了部分響應。

圖 6 安曲霉素、PBD 類和 PBD 類抗體藥物偶聯物

圖 7 喜樹堿類和 SN-38 類抗體藥物偶聯物

3 結語

ADC 解決了細胞毒藥物選擇性差的問題，使得某些細胞毒性過強的藥物有了用武之地，同時也為腫瘤的靶向治療提供了更多的選擇和手段。尋找合適的新型 ADC 彈頭分子，從細胞毒藥物的發現及其作用機制的探究，再到結構改造和構效關系研究，這一過程具有巨大挑戰性。而且，采用何種連接技術以及相應的連接子也是解決這些問題的關鍵，抗體除了半胱氨酸和賴氨酸偶聯的方法外，為降低產品的異質性問題，引入非天然氨基酸、工程化半胱氨酸和定點突變等技術均有報道[31-32]；連接子的優化著重在于增加水溶性和穩定性，如能夠被 β-葡萄糖醛酸水解的葡萄糖醛酸型連接子[33]，降低細胞毒藥物脫靶的雙功能二硫橋連接子[34]等將為理想 ADC 的設計提供有效策略?？傊?，隨著新技術和新策略的不斷涌現，ADC 在腫瘤甚至其他疾病治療中的應用將會蓬勃發展。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2017.06.010

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2017-09-04