基于RNA-seq分析美洲大蠊提取物對結直腸癌細胞信號通路的影響

陳峰， 陳佳松， 彭銳， 耿福能， 鄒方東*

(1. 四川大學生命科學學院，成都610065； 2. 四川省藥用動物工程技術研究中心，成都610065；3. 藥用美洲大蠊四川省重點實驗室，成都610065)

基于RNA-seq分析美洲大蠊提取物對結直腸癌細胞信號通路的影響

陳峰1， 2， 3， 陳佳松1， 2， 3， 彭銳1， 2， 3， 耿福能3*， 鄒方東1， 2， 3*

(1. 四川大學生命科學學院，成都610065； 2. 四川省藥用動物工程技術研究中心，成都610065；3. 藥用美洲大蠊四川省重點實驗室，成都610065)

美洲大蠊Periplanetaamericana提取物能夠抑制多種腫瘤細胞生長，甚至能使腫瘤細胞發生凋亡，但是其對結直腸癌細胞信號通路的影響尚不清楚。本文基于RNA-seq技術初步分析了美洲大蠊提取物聯合順鉑處理結直腸癌細胞后，細胞內信號通路的變化。結果表明：30 μM順鉑和0.6%康復新液聯合處理組與對照組相比，共有1 901個差異基因，其中1 555個基因表達上調，346個基因表達下調；30 μM 順鉑和0.8%精粉酵解液聯合處理組與對照組比，共有2 587個差異基因，其中2 183個基因表達上調，404個基因表達下調；30 μM 順鉑和100 μg·mL-1精粉聯合處理組與對照組相比，共有1 488個差異基因，其中1 164個基因表達上調，324個基因表達下調。用WEGO和DAVID進行差異基因的GO和KEGG富集分析發現，美洲大蠊提取物聯合順鉑處理組與對照組相比，表達上調的差異基因主要富集在p53、細胞粘附分子、MAPK、細胞凋亡等信號通路；表達下調的差異基因主要富集在氨基酰-tRNA生物合成、氨基酸生物合成、抗生素生物合成、一碳代謝等信號通路。

美洲大蠊；提取物；轉錄組；差異基因；信號通路；功能注釋

美洲大蠊Periplanetaamericana隸屬于蜚蠊目Blattodea蜚蠊科Blattidae大蠊屬Periplaneta，俗稱蟑螂，是世界性衛生害蟲，廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區。蜚蠊入藥早有歷史記載(孫星衍，孫馮翼，1955)，近年來，美洲大蠊提取物被發現具有很高的藥用價值，目前已有多個產品相繼研發成功，如康復新、心脈隆注射液、肝龍膠囊等(史未名，2012)。康復新是美洲大蠊干燥蟲體的乙醇提取物研制產品，已經廣泛應用于臨床創傷治療。舒崇湘等(2001)使用美洲大蠊多元醇提取物W11-a12作為全身放射損傷的治療藥物，研究表明，美洲大蠊提取物通過增加細胞外基質表達量來刺激創傷細胞增殖、加速傷口愈合速度和質量。臨床研究表明，康復新液對手足口病、胃腸潰瘍、痔瘡、肛瘺和肛裂等疾病都有很好的治療效果(劉玉媛，2006)。胡艷芬等(2009)發現美洲大蠊提取物對3株人肺癌細胞具有體外抑制作用；何正春等(2009)發現美洲大蠊提取物對3株人體消化系統腫瘤細胞具有體外抑制作用；蔣永新等(2006)發現美洲大蠊提取物能在體外誘導胃腺癌細胞BGC-823、肺腺癌細胞GLC、卵巢癌細胞等發生凋亡。

結直腸癌是胃腸道癌癥中最常見的惡性腫瘤之一，也是全球第三大最常見的癌癥疾病(汪建平等，2009)。順鉑(cisplatin)是一種重要的抗腫瘤藥物，用于治療多種類型的癌癥(Rosenberg，1999)，主要作用靶點為DNA，可以促進DNA鏈內及鏈間交聯(主要為鏈內交聯)，導致DNA損傷，當DNA不能被修復時導致細胞凋亡(Siddik，2003)。盡管順鉑在臨床治療腫瘤上具有較好的效果，但是其副作用以及腫瘤耐藥性問題，嚴重影響了它在臨床治療中的應用潛力(Kelland，1993；Ferlayetal.，2015)。

轉錄組是某個物種或者特定細胞類型產生的所有轉錄本的集合，能夠反映基因組在特定條件下的表達情況，從整體水平了解基因的功能和結構，是研究細胞表型和功能的一個重要手段。轉錄組已經廣泛應用于基礎研究、臨床診斷和藥物研發等領域(祁云霞等，2011)。雖然有很多文獻報道了美洲大蠊提取物能夠抑制多種腫瘤細胞生長，甚至使腫瘤細胞凋亡，但是分析美洲大蠊提取物與順鉑聯合處理結直腸癌細胞，對其信號通路影響的研究還未見報道。因此，本文基于RNA-seq技術分析美洲大蠊提取物聯合順鉑處理的結直腸癌細胞內信號通路的變化，為美洲大蠊提取物的應用及開發提供數據。

1 材料和方法

1.1材料

人結直腸癌細胞低轉移性細胞株(RKO細胞)為美國匹茲堡大學Lin Zhang教授實驗室贈送；順鉑從中國上海藍木化工公司購買；美洲大蠊提取物為康復新液(KFXY)、精粉(JF)、精粉酵解液(JFJJ)，由四川好醫生藥業集團提供。

1.2方法

1.2.1細胞培養以及加藥處理RKO細胞用含有10%胎牛血清、青霉素100 U·mL-1和鏈霉素100 μg·mL-1的DMEM完全培養基(美國Hyclone公司)，在5%CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養。待細胞匯合度為90%～95%時，進行細胞傳代培養并鋪板。細胞以1×105/mL的密度接種于12孔板中，24 h后同時加入30 μM cisplatin和一定濃度的美洲大蠊提取物(0.6% KFXY、0.8% JFJJ、100 μg·mL-1JF)處理48 h，然后用RNA抽提試劑TRIzol(中國大連TaKaRa)收集細胞，并凍存在-80 ℃超低溫冰箱。

1.2.2RNA提取以及檢測按照RNA提取試劑盒(TaKaRa)操作方法提取樣品RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA降解程度以及是否有污染，Nanodrop檢測RNA的純度和濃度。

1.2.3文庫構建以及測序分析RNA樣品檢測合格后，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA。隨后加入fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機引物合成一鏈cDNA，然后加入緩沖液、dNTP和DNA polymerase Ⅰ和RNase H合成二鏈cDNA，再用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA。純化的雙鏈cDNA先進行末端修復、加A尾并連接測序接頭，再用AMPure XP beads進行片段大小選擇。最后進行PCR擴增，并用AMPure XP beads純化PCR產物，得到最終的文庫。文庫構建完成后，先使用Qubit 2.0進行初步定量，稀釋文庫至1.5 ng·μL-1，隨后使用Agilent 2100對文庫的insert size進行檢測，符合預期后，使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度(>2 nM)進行準確定量，以保證文庫質量。構建好的文庫用Illumina HiSeqTM2500進行測序。

1.2.4基因表達量統計和樣品間差異表達分析基因表達量的計算使用Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads(FPKM)法。FPKM法能消除基因長度和測序量差異對計算基因表達的影響，計算得到的基因表達量可直接用于比較不同樣品的基因表達差異。然后采用EdgeR進行差異表達轉錄本的鑒定，利用FDR與log2FC篩選差異基因，篩選條件為FDR<0.05且|log2FC|>1。

1.2.5差異基因GO注釋和KEGGPathway分析

Gene Ontology(GO)是一個國際標準化的基因功能分類體系，提供了一套動態更新的標準詞匯表來全面描述生物體中基因和基因產物的屬性。GO總共有3個本體，分別描述基因的分子功能(molecular function)、細胞組分(cellular component)、參與的生物過程(biological process)(Botsteinetal.，2000)。東京基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Pathway，KEGG)是一個整合了基因組、化學和系統功能信息的生物系統數據庫，它提供了一個參考的數據庫，將基因對比到生物活動的每個信號通路中(Kanehisaetal.，2008)。每一組的差異基因用WEGO進行樣品間差異基因GO的分類，用DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)進行KEGG通路富集分析。

2 結果與分析

2.1測序結果分析

采用Illumina HiSeqTM2500對結直腸癌細胞對照組、30 μM cisplatin和0.6% KFXY聯合處理組、30 μM cisplatin和0.8% JFJJ聯合處理組、30 μM cisplatin和100 μg·mL-1JF聯合處理組進行測序。各組經過數據過濾后得到的reads數量分別為22 770 909、24 048 295、26 977 761、32 367 493，堿基錯誤率分別為0.04%、0.03%、0.03%、0.03%，Q20的值分別為94.42%、95.84%、95.78%、95.72%，Q30的值分別為87.35%、90.08%、89.87%、89.87%，每個樣品的GC含量分別為50.88%、50.83%、50.75%、51.7%(表1)。以上數據表明測序得到的數據量和質量都很高。

表1 樣品轉錄組測序數據統計表Table 1 RNA sequencing data

2.2樣品間差異基因統計

采用EdgeR進行差異表達轉錄本的鑒定和統計，結果如圖1所示。與對照組相比，30 μM cisplation和0.6%KFXY聯合處理組共有1 901個差異基因，其中1 555個基因表達上調，346個基因表達下調；30 μM cisplation和0.8%JFJJ聯合處理組共有2 587個差異基因，其中2 183個基因表達上調，404個基因表達下調；而30 μM cisplation和100 μg·mL-1JF聯合處理組共有1 488個差異基因，其中1 164個基因表達上調，324個基因表達下調。

2.3樣品差異基因GO注釋結果統計

用WEGO進行樣品間差異基因GO的分類，樣品差異基因GO注釋統計結果如圖2所示。3組樣品中的差異基因注釋到參與的生物過程中最多，差異基因注釋到生物過程中的GO主要在細胞內過程(cellular process)、新陳代謝過程(metabolic process)、單一機體過程(single-organism process)、細胞刺激反應(response to stimulus)等，注釋到細胞組分的主要在細胞組分(cell part)、細胞(cell)、細胞器(organelle)、細胞膜(membrane)等，注釋到分子功能的主要在細胞結合(binding)、催化活性(catalytic activity)、酶調節活性(enzyme regulator activity)、分子轉導活性(molecular transducer activity)等。

圖1 樣品間差異表達基因統計Fig. 1 Statistical analysis of differentially expressed genes between samples

圖2 樣品間差異基因GO富集統計Fig. 2 GO enrichment statistical analysis of differentially expressed genes between samples

A. 30 μM cisplatin與0.6%KFXY+30 μM cisplatin， B. 30 μM cisplatin與0.8%JFJJ+30 μM cisplatin， C. 30 μM cisplatin與100 μg·mL-1JF+30 μM cisplatin。

2.4樣品差異基因KEGG注釋結果統計

采用DAVID進行KEGG信號通路富集分析，篩選出25個顯著性最高的信號通路。與對照組相比，30 μM cisplatin和0.6%KFXY聯合處理組表達上調的差異基因主要富集在p53、系統性紅斑狼瘡、ECM受體、細胞黏著、細胞凋亡等信號通路；而表達下調的差異基因則主要富集在氨基酰-tRNA生物合成，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸等氨基酸的生物合成，抗生素生物合成，一碳代謝等信號通路(表2)。與對照組相比，30 μM cisplatin和0.8%JFJJ聯合處理組中表達上調的差異基因主要富集在溶酶體、p53、細胞粘附分子、MAPK、細胞凋亡等信號通路；而表達下調的差異基因則富集在核糖體、氨基酸生物合成、氨基酰-tRNA生物合成、一碳代謝等信號通路(表3)。與對照組相比，30 μM cisplatin和100 μg·mL-1JF聯合處理組中表達上調的差異基因主要富集在p53、吞噬體、ABC轉運蛋白、細胞粘附分子、細胞凋亡、MAPK等信號通路；表達下調的差異基因則主要富集在氨基酰-tRNA生物合成、氨基酸生物合成、抗生素生物合成、一碳代謝等信號通路(表4)。

3 討論

本研究應用RNA-seq技術分析美洲大蠊提取物聯合順鉑處理的結直腸癌細胞內信號通路以及細胞內基因表達的變化。與對照組相比，30 μM cisplatin和0.6%KFXY聯合處理組共鑒定出1 555個表達基因上調，346個基因表達下調；30 μM cisplatin和0.8%JFJJ聯合處理組鑒定出2 183個基因表達上調，404個基因表達下調；而30 μM cisplatin和100 μg·mL-1JF聯合處理組則鑒定出1 164個基因表達上調，324個基因表達下調。為了明確差異基因的功能，采用WEGO和DAVID進行差異基因的GO和KEGG富集分析。

表2 30 μM cisplatin與0.6%KFXY+30 μM cisplatin組差異基因KEGG富集統計Table 2 KEGG enrichment statistical analysis of differentially expressed genes between 30 μM cisplatin and 0.6%KFXY+30 μM cisplatin

表3 30 μM cisplatin與0.8%JFJJ+30 μM cisplatin組差異基因KEGG富集統計Table 3 KEGG enrichment statistical analysis of differentially expressed genes between 30 μM cisplatin and 0.8%JFJJ+30 μM cisplatin

GO分析結果表明，3組樣品中差異基因注釋到生物過程中的最多。KEGG分析結果則表明與對照組相比，30 μM cisplatin和美洲大蠊聯合處理組中表達上調的基因主要富集在p53、ECM受體、細胞粘附分子、細胞凋亡等信號通路。p53信號通路參與了誘導細胞周期阻滯、促進細胞凋亡和DNA修復等生物過程，發揮著避免受損DNA堆積、維持基因組穩定以及調節細胞分化與衰老等功能活動(Vogelsteinetal.，2000)。此外，在結直腸癌中p53信號通路常出現異常(Chenetal.，2006)。最近的研究表明，ECM在腫瘤細胞的轉移中發揮著重要的作用，結直腸癌細胞和基質細胞能夠通過直接的細胞接觸，產生ECM組分和分泌生長因子(Vicenteetal.，2013)。細胞粘附分子在結腸直腸癌的轉移潛能中發揮重要作用，因此，能夠介導這種常見惡性腫瘤的預后效果(Paschosetal.，2009)。值得注意的是，表達上調的基因也富集在ABC轉運蛋白家族信號通路，而其中的基因常常在結直腸癌抗藥性細胞和腫瘤中高表達(Hlavataetal.，2012)。表達下調的基因主要富集在氨基酰-tRNA生物合成，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，抗生素生物合成，一碳代謝等信號通路。氨基酰-tRNA生物合成催化相應的氨基酸結合到tRNAs上，這種催化合成反應決定了蛋白質的合成和細胞的存活(Parketal.，2008)，而氨基酰-tRNA生物合成在結直腸癌中卻是增加的(Kushneretal.，1976)。最新的研究表明，一碳代謝不僅能夠影響癌癥的進程，同時也能夠影響基因組的完整和表觀遺傳的改變(Locasaleetal.，2013)。因此，監控這些重要信號通路的變化，可以預測美洲大蠊提取物聯合順鉑治療結直腸癌后的預后效果。

綜上所述，本文分析了美洲大蠊提取物聯合順鉑處理結直腸癌細胞后信號通路的變化。研究結果可為美洲大蠊提取物的深入開發提供豐富的數據資源。

表4 30 μM cisplatin與100 μg·mL-1JF+30 μM cisplatin組差異基因KEGG富集統計Table 4 KEGG enrichment statistical analysis of differentially expressed genes between 30 μM cisplatin and 100 μg·mL-1JF+30 μM cisplatin

致謝：本次實驗得到四川好醫生藥業集團的大力支持，在此致以最真誠的謝意！

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MolecularPortraitofPeriplanetaamericanaExtractsonColonCancerCellsBasedonRNA-seqAnalysis

CHEN Feng1， 2， 3， CHEN Jiasong1， 2， 3， PENG Rui1， 2， 3， GENG Funeng3*， ZOU Fangdong1， 2， 3*

(1. College of Life Sciences， Sichuan University， Chengdu 610065， China； 2. Sichuan Engineering Research Center for MedicinalAnimals， Chengdu 610065， China； 3. Sichuan Key Laboratory for Medicinal American Cockroach， Chengdu 610065， China)

Periplanetaamericanaextracts can inhibit the growth of several tumors， and even induce tumor cell apoptosis. However， the influence ofP.americanaextracts on the signaling pathways in cancer cells is still unknown. In this study， RNA-seq method was used to investigate the changes of signaling pathways in colon cancer cells that treated withP.americanaextracts and cisplatin. The results showed that， comparing to the untreated group， colon cancer cells that treated with 30 μM cisplatin and 0.6% KFXY had 1 901 differentially expressed genes (DEGs)， including 1 555 up-regulated genes and 346 down-regulated； 30 μM cisplatin and 0.8% JFJJ treated group had 2 587 DEGs， including 2 183 up-regulated genes and 404 down-regulated； 30 μM cisplatin and 100 μg·mL-1JF treated group had 1 488 DEGs， including 1 164 up-regulated genes and 324 down-regulated. GO analysis and KEGG pathway analysis showed that the up-regulated DEGs were enriched in p53 signaling pathway， cell adhesion and apoptosis， while the down-regulated DEGs were enriched in aminoacyl-tRNA biosynthesis， one carbon pool and biosynthesis of amino acids.

Periplanetaamericana； extraction； transcriptome； differentially expressed genes； signaling pathways； functional annotation

10.11984/j.issn.1000-7083.20170105

2017-03-31接受日期2017-06-09

陳峰(1991—)， 男， 碩士研究生， 研究方向為細胞分子生物學， E-mail：879526987@qq.com

*通信作者Corresponding author， E-mail：haoyishenggfn@126.com； fundzou@scu.edu.cn

Q965.9

A

1000-7083(2017)06-0649-08