TFPI-2基因CpG島甲基化與非小細胞肺癌浸潤、轉移的關系

鮑俊英，徐家行，梁江水，紀濤，殷桂林，董永強

(1華中科技大學同濟醫學院附屬武漢市中心醫院，武漢430010；2郴州市第一人民醫院；3中國人民解放軍武漢總醫院)

TFPI-2基因CpG島甲基化與非小細胞肺癌浸潤、轉移的關系

鮑俊英1，徐家行1，梁江水2，紀濤3，殷桂林3，董永強3

(1華中科技大學同濟醫學院附屬武漢市中心醫院，武漢430010；2郴州市第一人民醫院；3中國人民解放軍武漢總醫院)

目的探討TFPI-2基因CpG島甲基化狀態與非小細胞肺癌浸潤、轉移的關系。方法收集60例份非小細胞肺癌組織及相應癌旁組織和10例份正常肺組織，采用MS-PCR法檢測其中組織途徑抑制因子2(TFPI-2)基因CpG島甲基化狀態，分析TFPI-2基因CpG島甲基化狀態與非小細胞肺癌患者臨床病理特征的關系。結果TFPI-2基因在肺癌組織、癌旁組織的陽性率分別為38.3%、6.7%，二者比較，P=0.009。TFPI-2基因CpG島甲基化狀態與非小細胞肺癌患者臨床分期、淋巴結轉移有關(P=0.002)。結論TFPI-2基因GpG島甲基化與非小細胞肺癌浸潤、轉移有關。

非小細胞肺癌；組織途徑抑制因子2；DNA甲基化

肺癌的發病率逐年增高，總體五年生存率約17%，其主要原因為肺癌轉移所致[1]。組織因子途徑抑制物2(TFPI-2)在對細胞外基質結構完整性的維持及腫瘤細胞侵襲和轉移調控方面發揮重要作用，具有抑制腫瘤及其血管生成、誘導細胞凋亡等多種生物學功能，故TFPI-2基因被認為是一種潛在的抑癌基因。近年研究[2，3]發現，在肝癌、神經膠質瘤、結腸癌、胰腺癌等惡性腫瘤中，TFPI-2基因CpG島甲基化使TFPI-2表達出現下降或缺失，此與腫瘤的生長和發展有關。TFPI-2基因啟動子區域CpG島異常甲基化及表達情況與非小細胞肺癌的關系國內外研究較少。本研究通過檢測60例患者非小細胞肺癌組織及相應癌旁組織和10例正常肺組織中的TFPI-2基因CpG島甲基化狀態，分析TFPI-2基因CpG島甲基化狀態與非小細胞肺癌發生發展的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2011年11月～2012年11月中國人民解放軍武漢總醫院(原廣州軍區武漢總醫院)心胸外科60例非小細胞肺癌患者手術標本，其中包括肺癌組織及距癌組織邊緣5 cm處癌旁組織各60例份，其中男35例、女25例，年齡36～76(60.75±9.61)歲。患者術前肺部均行多層螺旋CT掃描，術前影像學檢查均未發現患者有肺癌遠處轉移，術前患者均未接受過化學藥物療法、放射性治療及靶向藥物治療等抗腫瘤治療。參加實驗的患者均提前告知，術前均簽署知情同意書，本實驗經中國人民解放軍武漢總醫院倫理委員會審核并通過。參照國際肺癌研究協會 (IASLC) 2009年修訂發布的非小細胞肺癌TNM分期標準：Ⅰ期33例(55.0%)、Ⅱ期12例(20.0%)、Ⅲ期15例(25.0%)。術后病理類型：腺癌38例(63.3%)，鱗癌18例(30.0%)，腺鱗癌4例(6.7%)。組織分化程度：高等分化4例(6.7%)、中等分化41例(68.3%)、低等及未分化15例(25.0%)。淋巴結轉移情況：無淋巴結轉移39例(65.0%)，有淋巴結轉移21例(35.0%)。另外實驗中取10例排除肺癌患者的正常肺組織，所有標本切取后置于液氮罐中冷凍儲存。

1.2 TFPI-2基因CpG島甲基化檢測 取凍存的癌組織25 mg剪碎后加入液氮研磨至粉狀，將其處理為細胞懸液，離心后予以RNaseA及蛋白酶K溶液降解多次離心固定后經重亞硫酸鹽處理DNA。采用MS-PCR法，引物采用Primer Premier5.0生物軟件設計。甲基化正向引物：5′-TTTATGTTTTTAAGAGGTGGATTTC-3′，反向引物：5′-AACTTTCTCCTATAATCCAAACGAA-3′；非甲基化正向引物：5′-TTATGTTTTTAAGAGGTGGATTTTG-3′，反向引物：5′-CAAACTTTCTCCTATAATCCAAACAA-3′。PCR擴增：PCR 反應總體系為25 μL，PCR buffer 2.0 μL，2.5 mmol/L dNTPMixture 1.6 μL，正向引物0.2 μL，反向引物0.2 μL，Taq 酶0.1 μL，修飾后的DNA模板2.0 μL，三蒸水13．9 μL補足總體積。反應條件：94 ℃，4 min；94 ℃，30 s；56 ℃，30 s；72 ℃，45 s；35個循環；72 ℃，5 min，最后在凝膠成像系統中成像并攝像。實驗結果分為完全甲基化、不完全甲基化及非甲基化[4]。其中完全甲基化是指經甲基化特異性的引物擴增出條帶，而非甲基化特異性的引物未擴增出條帶，表明TFPI-2基因CpG島發生了完全甲基化。而不全甲基化是指甲基化和非甲基化特異性的引物均擴增出條帶，其出現的原因可能是因為腫瘤細胞的一個等位基因發生了甲基化而另一個未發生甲基化造成的，這種情況亦被定義為甲基化陽性。而非甲基化則是指甲基化和非甲基化特異性的引物均未能擴增出條帶，表明TFPI-2基因CpG島未發生甲基化。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。率的比較采用χ2檢驗，評價TFPI-2基因甲基化與非小細胞肺癌患者臨床病理特征的關系。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TFPI-2基因CpG島甲基化狀態 TFPI-2基因在60例非小細胞肺癌組織中的甲基化(包括完全和不完全甲基化)陽性率達到38.3%(23/60)，在相應癌旁組織中的甲基化陽性率達到6.7%(4/60)，TFPI-2基因在非小細胞肺癌組織及癌旁組織的甲基化陽性率比較，P=0.009。正常肺組織中無一例發生甲基化。典型的MS-PCR結果見圖1。

2.2 TFPI-2基因甲基化與非小細胞肺癌患者臨床病理特征的關系 見表1。

3 討論

DNA甲基化是指在DNA甲基轉移酶催化作用下，DNA的C、G二核苷酸的胞嘧啶選擇性地結合一個甲基團，形成5-甲基胞嘧啶[5]。DNA甲基化是一種表觀遺傳學的修飾過程，可通過某些基因甲基化程度的改變而造成基因功能的失活，從而導致某些惡性腫瘤的發生和進展[6]。CpG島甲基化在腫瘤的早期階段、癌前階段已存在，其可能參與細胞周期的調控、DNA修復、細胞凋亡及腫瘤的浸潤和轉移等多個環節[7]。

注： M：甲基化，U：非甲基化。

圖1 TFPI-2基因在非小細胞肺癌組織、癌旁組織的甲基化狀態

人類TFPI-2基因位于染色體7q22，基因全長約7 kb，其基因鏈中含有一個220 bp的CpG島，跨距外顯子1和外顯子3的轉錄起始位點，G+C 的含量約占比為77%[8]。TFPI-2亦稱胎盤蛋白-5，是一種含有kunits型結構的絲氨酸蛋白酶抑制物超家族成員，參與維護細胞外基質(ECM)結構的完整性及控制腫瘤侵襲和轉移等，通過抑制腫瘤組織中血管生成從而抑制腫瘤組織生長，并具有抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡等多種生物特性[9]。研究表明在多種人類腫瘤中，TFPI-2基因啟動子CpG島甲基化可致TFPI-2基因沉默。近年來多項研究發現，在肝癌、神經膠質瘤、結腸癌、胰腺癌等惡性腫瘤中，TFPI-2基因CpG島甲基化使得TFPI-2表達出現下降或缺失，這與腫瘤的生長和發展有關。

TFPI-2抑制腫瘤浸潤及轉移的機制可能有[10,11]：①TFPI-2通過抑制MMPs在內的多種蛋白酶的活性，阻斷ECM的重塑，維持ECM結構的完整性，從而抑制腫瘤浸潤及轉移。②TFPI-2通過上調TNF-R、Fas-R的表達，促進Caspase-3及Caspase-9相互作用，從而在腫瘤細胞凋亡過程中啟動促進作用；TFPI-2抑制ECM中纖溶酶及MMPs等活性，保護FasL配體細胞外結構域的完整性，并與VEGF相互作用，使得促凋亡蛋白Bax的表達增高，使得凋亡蛋白Bcl-2表達降低，誘導腫瘤細胞的凋亡從而發揮其抗腫瘤效應。③TFPI-2通過拮抗組織因子，從而阻斷血管生成；TFPI-2通過抑制血管內皮細胞的遷移和管道形成，配偶和腫瘤血管生成擬態，從而抑制腫瘤新生血管的形成。

本研究結果顯示，60例患者中非小細胞肺癌組織的TFPI-2基因甲基化陽性率明顯高于癌旁組織，而同期檢測的10例正常肺組織中TFPI-2基因無一例出現甲基化。表明在正常組織、癌旁組織及肺癌組織中TFPI-2基因甲基化率依次增高。推斷TFPI-2基因CpG島甲基化程度越高，腫瘤發生浸潤的可能性越大。同時發現，Ⅰ、Ⅱ期非小細胞肺癌組織中TFPI-2表達陽性率高于Ⅲ期，差異有統計學意義。TFPI-2基因CpG島的異常甲基化導致了TFPI-2基因表達下降，并可能與非小細胞肺癌發生和轉移有關。進一步分析發現，非小細胞肺癌患者的臨床分期、腫瘤直徑及淋巴結轉移與TFPI-2基因甲基化呈正相關，原因可能是TFPI-2基因啟動子區異常甲基化，致抑癌基因失活，使其抑制腫瘤發生發展、浸潤轉移的作用明顯下降。但不同病理類型非小細胞肺癌，如腺癌、鱗癌及腺鱗癌，其TFPI-2基因CpG島甲基化率無統計學差異。主要原因與非小細胞肺癌中不同病理類型腫瘤中細胞生物學特征相似有關。以上結論表明TFPI-2基因CpG島甲基化與非小細胞肺癌的發生及浸潤、轉移有關，但因本實驗收集樣本量較小，致腫瘤組織分化程度高低及腫瘤組織學類型與TFPI-2基因甲基化陽性率無統計學差異，此種現象的原因可能與本組實驗中收集的腺癌和中等分化程度的非小細胞肺癌偏多有關。

[1] 解寶泉,張志艷,王袁，等.血清CEA、CYFRA2 1-1及SCCA檢測對肺癌患者預后的評估價值[J].山東醫藥，2017,57(5):54-55.

[2] Wu D, Xiong L, Wu S, et al. TFPI-2 methylation predicts poor prognosis in non-small cell lung cancer[J]. Lung Cancer， 2012,76(1):106-111.

[3] Gessler F， Voss V， Seifert V， et al. Knockdown of TFPI-2 promotesmigration and invasion of glioma cells[J]． Neurosci Lett, 2011,497(1)：49-54.

[4] 鄭浩，湯志剛.5-Aza-CdR對胰腺癌細胞系Panc-1中TFPI-2基因甲基化水平及表達的影響[J].腫瘤防治研究,2012,39(2):233-236.

[5] Hashimoto H, Vertino PM, Cheng X. Molecular coupling of D N Amethylation and histone methylation [J]. Epigenomics, 2016,2(5):657-669.

[6] Lakka SS, Konduri SD, Mohanam S, et al. In vitro modulation of human lung cancer cell line invasiveness by antisense cDNA of tissue factor pathway inhibitor-2[J]. Clin Exp Metastasis, 2000,18(3):239-244.

[7] Vaitkiene P, Skiriute D, Skauminas K, et al. Associations Between TFPI-2 Methylation and Poor Prognosis in Glioblastomas[J]. Medicina, 2012,48(7):345-349.

[8] Dong YQ, Liang JS, Zhu SB, et al. Effect of 5-aza-2′-deoxycytidine on the cell proliferation of non-small cell lung cancer cell line A549 cells and expression of TFPI-2 gene[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2013,14(7):4421-4426.

[9] 梁江水，董永強，殷桂林，等.5-Aza-CdR對非小細胞肺癌細胞株A549細胞TFPI-2基因甲基化水平及表達的影響[J].實用醫學雜志，2013，29(21)：3475-3478.

[10] Qiao Z, Yao Z, Shi ZW, et al. Reduced expression of tissue factor pathway inhibitor-2 contributes to apoptosis and angiogenesis in cervical cancer[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2012,319(1):1.

[11] Takada H, Wakabayashi N, Dohi O, et al. Tissue factor pathway inhibitor 2 (TFPI2) is frequently silenced by aberrant promoter hypermethylation in gastric cancer[J]. Cancer Genet Cytogenet， 2010，197(1):16-24.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.41.028

R734.2

B

1002-266X(2017)41-0082-03

董永強(E-mail：xin15ge@163.com)

2017-08-01)