單次大劑量與多次小劑量放射線構建小鼠放射性唾液腺損傷模型效果比較

王濤，劉東

(勝利油田中心醫院，山東東營 257034)

單次大劑量與多次小劑量放射線構建小鼠放射性唾液腺損傷模型效果比較

王濤，劉東

(勝利油田中心醫院，山東東營 257034)

目的探討單次大劑量與多次小劑量放射線構建小鼠放射性唾液腺損傷模型的應用效果。方法選取C3H小鼠30只，隨機分為空白對照組(空白組)、單次大劑量照射組(單放組)、多次小劑量照射組(多放組)各10只。空白組以0 Gy放射線照射,單放組以15 Gy放射線單次照射，多放組以每天5 Gy照射，連續5 d。分別于照射前及照射后1、5、10周測定各組唾液分泌率。照射后10周采集三組小鼠下頜下腺，分別測定腺泡細胞相對面積、細胞增殖率及毛細血管密度。結果與空白組比較，單放組、多放組唾液分泌率均下降，腺泡細胞相對面積減小，下頜下腺細胞增殖率降低，下頜下腺毛細血管密度減低，差異均有統計學意義(P均lt;0.05)。單放組與多放組以上觀察指標比較差異無統計學意義(P均gt;0.05)。結論單次大劑量與多次小劑量放射線構建小鼠放射性唾液腺損傷模型的效果相當。

唾液腺；放射性損傷；單劑量放射；多劑量放射；小鼠

頭頸部腫瘤是臨床第六大常見惡性腫瘤，放射性治療(放療)是其最主要的治療方法[1]。由于唾液腺組織尤其是腺泡細胞對放射線高度敏感，頭頸部放療在殺死腫瘤細胞的同時不可避免地造成唾液腺功能損傷，從而引起溝紋舌、猛性齲、口腔黏膜炎等并發癥，嚴重影響患者的生活質量[2]。近年來，組織工程、基因治療及干細胞治療等方法被用來修復動物放射性唾液腺損傷，其中構建放射性唾液腺損傷動物模型是實驗研究的關鍵環節。單次大劑量照射與多次小劑量照射是目前最常用的唾液腺損傷動物模型的構建方法，但究竟哪種方法更好尚存在爭議。2017年2～6月，我們對兩種方法構建的模型效果進行比較。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：8周齡C3H小鼠30只[北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK(京)(2016)0017,許可證號:SCXK (京)2011-0011]，體質量18～23 g。主要儀器及試劑：醫用直線加速器(Varian Clinic Trilogy)、PAS染色試劑盒(美國Sigma公司)、PCNA染色試劑盒(美國Invitrogen公司)、CD31抗體(美國Ramp;D Systems公司)。

1.2 動物分組及照射方法 將30只小鼠隨機分為空白對照組(空白組)、單次大劑量照射組(單放組)、多次小劑量照射組(多放組)各10只，小鼠腹腔注射苯巴比妥鈉(5 mg/kg)麻醉后，頭頸部充分暴露于放射野內，其余部位用鉛板遮擋。單放組以15 Gy放射線單次照射；多放組以每天5 Gy照射，連續5 d；空白組直線加速器不運行(照射劑量為0 Gy),其他處理同照射組。照射后各組小鼠皮下注射生理鹽水500 μL并保持正常體溫直至蘇醒。

1.3 唾液分泌率測定及唾液腺標本采集 照射前及照射后1、5、10周用苯巴比妥鈉麻醉小鼠，皮下注射毛果蕓香堿(2 mg/kg)。傾斜固定小鼠，將分血器一端置于小鼠口角，另一端置于預稱重0.5 mL離心管中，收集唾液10 min，之后將離心管稱重，計算小鼠唾液分泌量及唾液分泌率。10周后小鼠脫頸處死取下頜下腺，一部分浸入4%多聚甲醛溶液中固定，脫水石蠟包埋，另一部分OCT包埋后放入-80 ℃冰箱保存備用。

1.4 下頜下腺腺泡細胞相對面積及增殖率檢測 將石蠟包埋的下頜下腺標本切片、常規脫臘水化，按試劑盒說明方法進行PAS染色。200倍光學顯微鏡下觀察拍照，Image J軟件計算下頜下腺腺泡細胞相對面積，即腺泡細胞占整個下頜下腺細胞面積的百分比。下頜下腺切片標本常規脫臘水化，熱抗原修復后，行PCNA染色，免疫組化標記PCNA陽性細胞為下頜下腺細胞。400倍光學顯微鏡下觀察拍照，Image J軟件計算下頜下腺細胞增殖率。

1.5 下頜下腺組織毛細血管密度檢測 7 μm下頜下腺冰凍切片于4%多聚甲醛固定10 min，10%正常驢血清封閉1 h，山羊來源抗小鼠CD31(1∶100)抗體4 ℃孵育過夜。PBS替代一抗作為空白對照，異硫氰酸熒光素標記的驢抗山羊IgG(1∶200)常溫避光孵育1 h。PBS沖洗3次后，DAPI常溫孵育2 min標記細胞核。甘油封片后，熒光顯微鏡觀察照相。免疫熒光標定血管內皮細胞標志物CD31，從而顯示下頜下腺毛細血管密度。

2 結果

2.1 三組唾液分泌率比較 三組照射前唾液分泌率比較無統計學差異(P均gt;0.05)。照射后1周單放組、多放組唾液分泌率均下降至空白組的50%，照射后5、10周兩組唾液分泌率持續下降，與空白組比較有統計學差異(P均lt;0.05)。但單放組與多放組各時點唾液分泌率比較無統計學差異(P均gt;0.05)。見表1。

表1 三組照射前后唾液分泌率比較

注：與空白組相比，*Plt;0.05。

2.2 三組下頜下腺組織結構及腺泡細胞相對面積比較 PAS染色顯示，空白組小鼠下頜下腺組織致密清晰，腺泡及導管細胞排列規則，胞質豐富，腺泡細胞相對面積為71%±9%。單放組、多放組小鼠下頜下腺組織結構疏松，間質纖維化明顯并見炎癥細胞浸潤，腺泡細胞萎縮；兩組腺泡細胞相對面積分別為34%±4%、30%±5%。與空白組比較，單放組與多放組腺泡細胞相對面積均減小(P均lt;0.05)；單放組、多放組腺泡細胞相對面積比較無統計學差異(Pgt;0.05)。

2.3 三組下頜下腺細胞增殖率比較 空白組、單放組、多放組下頜下腺細胞增殖率分別為11%±1.4%、4%±0.9%、5%±1.8%。單放組、多放組下頜下腺細胞增殖率均低于空白組(P均lt;0.05)，單放組、多放組下頜下腺細胞增殖率無統計學差異(Pgt;0.05)。

2.4 三組下頜下腺毛細血管密度比較 與空白組比較，單放組、多放組小鼠下頜下腺血管系統破壞明顯，毛細血管密度減低。

3 討論

放射性唾液腺損傷是頭頸部腫瘤患者放療后最常見的并發癥之一，其損傷機制一直是臨床研究的熱點。目前，臨床對放射性唾液腺損傷患者的治療主要是唾液替代療法和保守治療，但治療效果有限，尚未找到從根本上治療此類疾病的方法[3]。雖然臨床已采用多種技術保護唾液腺，如使用調強放療、通過手術方法將唾液腺移植出放射損傷區域外等[4～6]，但調強放療后仍有40%的患者唾液腺受損。而唾液腺移植主要用于保護下頜下腺，不能用于腮腺的保護。近年來，基因治療、組織工程及干細胞治療成為放射后唾液腺功能修復的研究熱點[7～9]，其中體外單細胞培養和動物模型是進行以上研究的常用方法。體外單細胞培養具有方便、經濟、快捷等優點，但單層細胞培養失去了細胞外基質及三維細胞結構，不能模擬體內復雜的病理生理變化；另外，人工環境中培養單細胞易引起細胞表型的改變[10]。而動物模型雖然實驗周期長、費用高，但能最大程度地再現人體復雜的疾病發展過程，所以一直是實驗研究最主要的手段之一。

目前，構建放射性唾液腺損傷的動物模型主要有局部單次大劑量照射和多次小劑量照射兩種方法。單次大劑量照射方案具有方便、快捷的優點，故被多數研究者采用。但臨床患者的放療多采用對腫瘤周圍正常組織損傷較小的多次小劑量照射方案。因此，近年來有學者在構建動物模型時將放射劑量分割成與臨床相關的小劑量。然而，多次小劑量方案需較多的時間和人力，并且要反復麻醉動物，易造成動物麻醉意外死亡，對操作技術的要求更嚴格。因此，單次大劑量照射和多次小劑量照射構建唾液腺損傷動物模型的效果如何需進一步研究證實。本研究結果顯示，無論單次大劑量還是多次小劑量放射線照射均能造成小鼠唾液分泌減低、腺泡細胞萎縮、組織細胞增殖率下降及腺體毛細血管密度減低等癥狀，均能較好反映放療患者唾液腺損傷的病理生理變化。另外，兩種照射方法均未造成小鼠全身癥狀。但考慮到單次大劑量照射方案具有方便、快捷的優勢，建議在今后實驗中如果動物能耐受，選擇單次大劑量局部照射的方案構建放射性唾液腺損傷動物模型更佳。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.41.014

R781.7

A

1002-266X(2017)41-0044-03

劉東(E-mail:18905460909@163.com)

2017-08-16)