荷載CSCs抗原的DC疫苗聯(lián)合小劑量TP治療乳腺癌小鼠效果觀察

陳心，梁慧玲，伍龍，徐細明，張一橋，陳能，馮翎

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢430060)

荷載CSCs抗原的DC疫苗聯(lián)合小劑量TP治療乳腺癌小鼠效果觀察

陳心，梁慧玲，伍龍，徐細明，張一橋，陳能，馮翎

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢430060)

目的研究荷載腫瘤干細胞(CSCs)抗原的樹突狀細胞疫苗聯(lián)合小劑量TP(紫杉醇+順鉑)治療小鼠乳腺癌的療效。方法利用ALDEFLUOR染料從小鼠乳腺癌細胞系4T1中分選出ALDH high腫瘤干細胞，將CSCs制備成細胞裂解液加載在DC細胞上制備成CSCs-DC疫苗。利用小鼠乳腺癌細胞系4T1接種Balb/c小鼠建立小鼠乳腺癌模型，隨機分成磷酸鹽緩沖液組(PBS組)、紫杉醇+順鉑組(TP組)、CSCs-DC疫苗組(CSCs-DC組)、CSCs-DC疫苗聯(lián)合TP組(CSCs-DC+TP組)，PBS組腹腔注射0.1 mL的PBS；TP組腹腔注射紫杉醇20 mg/kg，順鉑5 mg/kg;CSCs-DC組皮下注射CSCs-DC疫苗；CSCs-DC+TP組皮下注射CSCs-DC疫苗，腹腔注射紫杉醇20 mg/kg，順鉑5 mg/kg。觀測各組腫瘤大小和小鼠生存期，實驗終點取小鼠脾臟，體外培養(yǎng)激活后利用LDH細胞毒性實驗測定細胞毒性T淋巴細胞(CTL)活性，ELISA法測定B細胞分泌IgG水平。結(jié)果CSCs-DC+TP組腫瘤體積小于PBS組、TP組及CSCs-DC組(P均lt;0.05)。小鼠生存期CSCs-DC+TP組最長，生存時間為(62.00±2.65)d，CSCs-DC組次之，生存時間為(52.00±1.00)d，TP組和PBS組生存時間分別為(46.00±2.00)、(35.00±1.00)d。CSCs-DC+TP組小鼠脾臟中CTL活性和B細胞分泌IgG水平最高，CSCs-DC組次之，TP組較CSCs-DC組和CSCs-DC+TP組低，但較PBS組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均lt;0.01)。結(jié)論CSCs-DC疫苗聯(lián)合小劑量TP治療乳腺癌小鼠較CSCs-DC疫苗和TP單用效果好。

乳腺腫瘤；腫瘤干細胞；疫苗；紫杉醇；順鉑；小鼠

乳腺癌是危害我國女性健康的最主要惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率呈上升趨勢。根據(jù)全國腫瘤登記中心發(fā)布的最新數(shù)據(jù)顯示，目前我國每年女性乳腺癌發(fā)病約24.9萬，位居女性發(fā)病首位，城市地區(qū)發(fā)病相對較高，平均29例女性會有1例患乳腺癌；每年死亡病例約6.0萬，位居女性死亡第6位[1]。腫瘤干細胞(CSCs)是腫瘤細胞中一小群具有自我更新能力并能產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細胞的細胞群體，具有很強的成瘤性和侵襲遷移潛能[2]，CSCs能長期處于休眠狀態(tài)而對傳統(tǒng)的放化療不敏感，是腫瘤增殖、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移并最終導(dǎo)致患者死亡的關(guān)鍵因素。2015年11月～2016年11月，我們制備CSCs-DC疫苗并將其聯(lián)合小劑量TP治療乳腺癌小鼠。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 Balb/c小鼠[動物合格證號：SCXK(鄂)2014-0004，使用許可證號：SYXK(鄂)2015-0027]，雌性，8周，購自武漢大學(xué)實驗動物中心，SPF級條件下飼養(yǎng)，符合倫理委員會認可。ALDEFLUOR干細胞試劑盒購自美國Stem Cell公司，紫杉醇購自江蘇揚子江藥業(yè)，順鉑購自齊魯制藥有限公司，純化抗小鼠CD3和CD28、抗小鼠CD40、白細胞介素2和粒-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)購自Ebioscience公司，IgG ELISA試劑盒購自賽默飛公司，LDH釋放試劑盒購自普洛麥格生物技術(shù)有限公司，RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)、0.25%胰酶消化液和青霉素/鏈霉素購自GIBCO公司。小鼠乳腺癌細胞系4T1購自武漢大學(xué)生命科學(xué)研究院細胞庫，細胞于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中生長，置于37 ℃、5% CO2、95%濕度條件下傳代培養(yǎng)。

1.2 CSCs的分選和抗原的獲得 采用ALDEFLUORTM試劑盒分選CSCs：收集對數(shù)生長期4T1細胞, 制備成單細胞懸液，計數(shù)細胞并用ALDEFLUOR緩沖液重懸細胞,使其終濃度為1×106/mL，加入ALDEFLUOR染料，7-AAD和DEAB作為對照組，水浴孵育后行流式分選ALDHhigh-CSCs細胞，將分選收集的ALDHhigh 4T1(CSCs)細胞置于液氮中浸泡5 min，而后37 ℃水浴中放置5 min，如此反復(fù)3次；獲得CSCs裂解液(CSCs抗原)。

1.3 CSCs-DC疫苗的制備 無菌條件下，取8周齡雌性Balb/c小鼠股骨和脛骨骨髓，于1640培養(yǎng)基和GM-CSF環(huán)境下培養(yǎng)10 d，收獲成熟DC細胞，將方法1.2中收集的裂解液以1∶3的比例加入DC細胞中，培養(yǎng)過夜，獲得加載CSCs抗原的DC疫苗。

1.4 小鼠乳腺癌模型的建立與分組 將正常Balb/c小鼠隨機分成4組，每組3只。將對數(shù)生長期的4T1細胞調(diào)整細胞濃度至5×107/mL，接種0.1 mL于每只小鼠右側(cè)乳墊下，每日觀察腫瘤形成情況。捫及腫瘤直徑為6～9 mm時隨機分為4組，磷酸鹽緩沖液組 (PBS組)：PBS 0.1 mL腹腔注射，第1、7、14天；紫杉醇+順鉑組(TP組)：紫杉醇 20 mg/kg，腹腔注射，第1、7、14天；順鉑 5 mg/kg，腹腔注射，第1、7天；CSCs-DC疫苗組(CSCs-DC組)： CSCs-DC疫苗，皮下注射，第1、7天；CSCs-DC疫苗聯(lián)合TP組(CSCs-DC+TP組)：CSCs-DC疫苗，皮下注射，第1、7天，紫杉醇 20 mg/kg，腹腔注射，第1、7、14天；順鉑5 mg/kg，腹腔注射，第1、7天。

1.5 腫瘤大小和小鼠生存期觀測 藥物處理后每日規(guī)定時間進行觀察，自用藥當(dāng)天開始，每 3 天測 1次腫瘤長、短徑，直至實驗結(jié)束，并計算腫瘤體積。成瘤后測量腫瘤最長徑(a)及與之垂直的橫徑(b)，根據(jù)公式V=1/2ab2計算瘤體積，繪制移植瘤生長曲線。記錄小鼠生存時間，繪制生存曲線。

1.6 細胞毒效應(yīng)實驗 實驗結(jié)束時收集各組小鼠脾臟，T細胞被anti-CD3/ anti-CD28 激活和IL-2擴增為細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，靶細胞為分選的ALDH+ SCC7細胞，利用LDH釋放試劑盒檢測CTL細胞對靶細胞的殺傷作用。將效應(yīng)細胞和靶細胞在圓底96孔板中共同孵育6 h，轉(zhuǎn)移上清至一個新的96孔平底酶分析板，加入底物，終止反應(yīng)后1 h內(nèi)用酶標(biāo)儀在492 nm處檢測OD值。根據(jù)以下公式計算CTL活性。CTL活性(%)=(實驗孔OD值-效應(yīng)細胞自發(fā)OD值-靶細胞自發(fā)OD值)/(靶細胞最大OD值-靶細胞自發(fā)OD值)×100%。

1.7 活化B細胞培養(yǎng)液上清中IgG含量檢測 采用ELISA法。實驗結(jié)束時收集各組小鼠脾臟,B細胞被LPS和anti-CD40激活,包被緩沖液稀釋親和素純化抗體，每孔加入100 μL，4 ℃過夜包被酶標(biāo)板。洗板3 次。加ELISA封閉液，每孔200 μL，室溫封閉1 h。封閉結(jié)束后，棄去封閉液，洗板，加入待測樣品(以標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線)100 μL，室溫孵育1 h。洗板，每孔加入HRP標(biāo)記的檢測抗體100 μL，室溫孵育1 h。洗板，每孔加入TMB 底物溶液100 μL，室溫避光顯色30 min，每孔加入2 mol/L H2SO450 μL終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀檢測450 nm處OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品濃度。

2 結(jié)果

2.1 各組腫瘤生長情況比較 從用藥開始，各組小鼠腫瘤生長平緩，體積比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均gt;0.05)。隨后，各組腫瘤生長出現(xiàn)差異，TP組、CSCs-DC組和CSCs-DC+TP組生長曲線平緩，但未停滯；而PBS組生長較快，曲線陡直。第27天，PBS組與TP組、CSCs-DC組、CSCs-DC+TP組腫瘤體積出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異，TP組、CSCs-DC組和CSCs-DC+TP組腫瘤體積小于PBS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均lt;0.05)。第42天，TP組與CSCs-DC組、CSCs-DC+TP組分別比較，腫瘤體積出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異，CSCs-DC組和CSCs-DC+TP組腫瘤體積均小于TP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均lt;0.05)。第51天，CSCs-DC組和CSCs-DC+TP組腫瘤體積出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異，CSCs-DC+TP組腫瘤體積小于CSCs-DC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。根據(jù)腫瘤生長體積與時間關(guān)系繪制腫瘤生長曲線見圖 1。

圖1 四組腫瘤生長曲線

2.2 各組荷瘤鼠生存期比較 CSCs-DC+TP組、TP組、CSCs-DC組、 PBS組生存期分別為(62.00±2.65)、(46.00±2.00)、(52.00±1.00)、(35.00±1.00)d，CSCs-DC+TP組較PBS組、TP組和CSCs-DC組生存期延長(P均lt;0.01)。以生存時間為橫軸，生存率為縱軸，用 GraphPad Prism統(tǒng)計軟件繪制的生存曲線見圖2。

圖2 荷瘤鼠生存曲線

2.3 各組CTL活性比較 CSCs-DC+TP組、TP組、CSCs-DC組、PBS組CTL活性分別為28.67%±1.98%、10.12%±1.05%、19.85%±1.68%、6.45%±1.09%，四組間比較，P均lt;0.05。

2.4 各組IgG抗體水平比較 CSCs-DC+TP組、TP組、CSCs-DC組、PBS組IgG抗體水平分別為(215.2±19.67)、(95.42±11.69)、(161.9±7.96)、(55.66±8.67)ng/mL，四組間比較，P均lt;0.05。

3 討論

乳腺癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是患者死亡的主要原因。腫瘤干細胞是腫瘤增殖、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵[3]，靶向殺傷CSCs是成功控制腫瘤的關(guān)鍵[4]。正確識別、分離和鑒定腫瘤干細胞是靶向殺傷腫瘤干細胞的基礎(chǔ)，利用特異性腫瘤干細胞表面標(biāo)志物通過流式細胞儀等技術(shù)對腫瘤干細胞進行分選，是當(dāng)前腫瘤干細胞分選鑒定的主要手段。CD24、CD44、B38.1和ESA是乳腺癌干細胞常用的表面分子標(biāo)志物[5]。近年來，乙醛脫氫酶(ALDH)被作為一種新的干細胞標(biāo)志物用于鑒定和分離腫瘤干細胞。ALDH是催化細胞內(nèi)乙醛氧化為乙酸的細胞溶質(zhì)酶,參與多種組織的分化與基因表達；亦是組織中正常干細胞與腫瘤干細胞生長、分化的必需物質(zhì),可作為正常干細胞與CSCs的標(biāo)志物之一。

利用Aldefluor試劑通過流式細胞術(shù)分選出高ALDH活性的細胞是一種簡單、可靠的分離腫瘤干細胞方法[6]。分離出的腫瘤干細胞具有活性,可用于后續(xù)的體內(nèi)、體外試驗研究。ALDH作為腫瘤干細胞標(biāo)志物已被用于肺癌、前列腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌和乳腺癌。研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中的ALDH+細胞能形成小球并能自我更新，在異體抑制中具有更強的成瘤性，對常規(guī)的阿霉素、環(huán)磷酰胺及紫杉醇化療藥物耐藥，具有腫瘤干細胞的特性[7]。ALDH與乳腺癌的預(yù)后呈負相關(guān)，ALDH+患者較ALDH-患者死亡相對危險度為1.76[8]。

乳腺癌干細胞對傳統(tǒng)的放療和化療存在抵抗現(xiàn)象。研究[9]發(fā)現(xiàn)放療會增加乳腺癌鼠模型中CSCs的比例，同樣，化療可使乳腺癌干細胞富集的現(xiàn)象在體內(nèi)實驗中亦被觀察到[10]。此外，有研究[11]發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者在接收新輔助化療后，腫瘤中CSCs比例增加。因而，免疫治療尤其是針對乳腺癌干細胞的免疫治療將有望成為未來治療腫瘤的重要手段[12]。

樹突狀細胞(DC)作為專職抗原呈遞細胞，因其抗原呈遞功能及免疫佐劑作用，可誘導(dǎo)出高效而特異的抗腫瘤免疫作用[13]。能刺激初始型T 細胞活化和增殖，是特異性免疫應(yīng)答的始動者。DC 還能誘導(dǎo)機體的體液免疫，激活NK、NK-T 細胞，參與非特異性免疫。本研究即是通過Aldefluor染料分離出CSCs,通過凍融法獲得CSCs抗原并將特異性的抗原加載在DC細胞上啟動特異性的免疫應(yīng)答。但CSCs-DC疫苗的效果有限，我們觀察到隨著觀測時間的延長，即使給予CSCs-DC疫苗的治療，最終腫瘤仍會在小鼠體內(nèi)復(fù)發(fā)。考慮原因在于疫苗的療效與免疫細胞的能力和腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)，包括DCs對腫瘤抗原的遞呈能力；T、B細胞向腫瘤組織遷徙能力及腫瘤微環(huán)境中T、B細胞的功能等。腫瘤微環(huán)境由腫瘤細胞、間質(zhì)細胞、微血管、腫瘤浸潤細胞及腫瘤細胞或基質(zhì)細胞分泌的多種細胞因子等共同組成，包括DCs、腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAM)、調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)、髓源抑制性細胞(MDSCs)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1、白細胞介素10、血管內(nèi)皮生長因子、前列腺素E2等。這些不同類型的細胞受到癌細胞的募集，形成一個適合癌細胞生長而使其他免疫細胞活性受到抑制的腫瘤微環(huán)境[14]，這種腫瘤微環(huán)境不但影響DCs分化成熟，下調(diào)DCs表面共刺激分子和黏附分子的表達，使DCs不能發(fā)揮有效的抗原提呈，而且抑制了T、B細胞活性，從而使我們設(shè)計的CSCs-DC疫苗在攻擊CSCs時作用有限。

常規(guī)化療在殺傷腫瘤細胞的同時亦削弱了機體的免疫功能，然而小劑量的節(jié)拍化療能降低荷瘤小鼠體內(nèi)的Treg細胞數(shù)量，改善T細胞和NK細胞功能，從而起到增強免疫功能的作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CSCs-DC+TP組腫瘤生長較CSCs-DC組和TP組受到明顯抑制，生存期延長，CTL活性增強，B細胞分泌抗體水平提高，說明小劑量的TP化療能通過強化T、B細胞功能，增強CSCs-DC疫苗的療效。

綜上所述，CSCs-DC疫苗聯(lián)合小劑量TP治療乳腺癌荷瘤小鼠，能抑制腫瘤生長，延長小鼠的生存時間，與治療誘發(fā)腫瘤免疫應(yīng)答有關(guān)，此為乳腺癌的治療提供了新思路。

[1] 陳萬青，鄭榮壽.中國女性乳腺癌發(fā)病死亡和生存狀況[J].中國腫瘤臨床，2015，42(13)：668-674.

[2] 陸翰杰，秦艷茹.腫瘤干細胞在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機制及功能相關(guān)信號通路研究進展[J].山東醫(yī)藥，2016，56(7)：94-96.

[3] Shima H， Yamada A， Ishikawa T， et al. Are breast cancer stem cells the key to resolving clinical issues in breast cancer therapy[J]. Gland Surg， 2017，6(1)：82-88.

[4] Pan Q， Li Q， Liu S， et al. Concise review: Targeting cancer stem cells using immunologic approaches[J]. Stem Cells， 2015，33(7)：2085-2092.

[5] Chekhun VF， Lukianova NY， Chekhun SV， et al. Association of CD44+CD24-/low with markers of aggressiveness and plasticity of cell lines and tumors of patients with breast cancer[J]. Exp Oncol， 2017，39(3)：203-211.

[6] Leng Z， Yang Z， Li L， et al. A reliable method for the sorting and identification of ALDHhigh cancer stem cells by flow cytometry[J]. Exp Ther Med， 2017，14(4)：2801-2808.

[7] Tao H， Lu L， Xia Y， et al. Antitumor effector B cells directly kill tumor cells via the Fas/FasL pathway and are regulated by IL-10[J]. Eur J Immunol， 2015，45(4)：999-1009.

[8] Charafejauffret E， Ginestier C， Iovino F， et al. Aldehyde dehydrogenase 1-positive cancer stem cells mediate metastasis and poor clinical outcome in inflammatory breast cancer[J]. Clin Cancer Res， 2010，16(1)：45-55.

[9] Menaa C, Li JJ. The role of radiotherapy-resistant stem cells in breast cancer recurrence[J]. Breast Cancer Manag， 2013，2(2)：89-92.

[10] Arumugam P, Song JM. Quantitative evaluation of ABC transporter-mediated drug resistance based on the determination of the anticancer activity of camptothecin against breast cancer stem cells using TIRF[J]. Integr Biol (Camb)， 2016，8(6)：704-711.

[11] Zhong Y， Shen S， Zhou Y， et al. ALDH1 is a better clinical indicator for relapse of invasive ductal breast cancer than the CD44+/CD24-phenotype[J]. Med Oncol， 2014，31(3)：864.

[12] Chen Q， Cui XX， Liang PF， et al. Immunotherapy with dendritic cells and cytokine-induced killer cells for MDA-MB-231 breast cancer stem cells in nude mice[J]. Am J Transl Res， 2016，8(7)：2947-2955.

[13] 徐彬，馬俊杰，王小龍，等.樹突狀細胞自體回輸聯(lián)合 TA 方案化療治療乳腺癌22例臨床觀察[J].山東醫(yī)藥，2014，54(35)：74-76.

[14] Schatton T， Schutte U， Frank NY， et al. Modulation of T-cell activation by malignant melanoma initiating cells[J]. Cancer Res， 2010，70(2)：697-708.

EfficacyofCSCsantigens-loadeddendriticcellvaccinecombinedwithlow-doseTPintreatmentofbreastcancerinmice

CHENXin,LIANGHuiling,WULong,XUXiming,ZHANGYiqiao,CHENNeng,FENGLing

(RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China)

ObjectiveTo study the therapeutic effect and mechanism of cancer stem cells (CSCs) antigens-loaded dendritic cell (DC) vaccine combined with low-does TP (paclitaxel and cisplatin) in treatment of breast cancer in mice.MethodsWe sorted out the CSCs from breast cancer cell lines (4T1) by using ALDEFLUOR. Bone marrow-derived DCs were pulsed with CSCs lysate to generate CSCs-DC vaccine. The Balb/c mice were inoculated with the heterogeneous 4T1 tumor cells by subcutaneous injection to make the mouse breast cancer models. The models were then divided into four groups: PBS group which was administrated PBS, TP group which was injected with 20 mg/kg paclitaxel and 5 mg/kg cisplatin intraperitoneally, CSCs-DC vaccine group (CSCs-DC group) which was administrated CSCs-DC vaccine by subcutaneous injection, and the CSCs-DC vaccine + TP group (CSCs-DC+TP group) which was administrated CSCs-DC vaccine by subcutaneous injection and was injected with 20 mg/kg paclitaxel and 5 mg/kg cisplatin intraperitoneally. Tumor volumes were measured and survival was monitored. At the end of the experiment, the spleens in mice were harvested, the cytotoxic lymphocyte (CTL) activity was measured by using LDH cytotoxicity assay, and IgG levels secreted by B cells was measured by ELISA.ResultsThe tumor size in the CSCs-DC+TP group was less than that of the PBS group, the TP group and the CSCs-DC group (Plt;0.05). The average survival time of the CSCs-DC+TP group was (62.00±2.65) d and was the longest, the average survival time of CSCs-DC group was (52.00±1.00) d, the average survival time of TP group and PBS group were (46.00 ±2.00) d and (35.00 ±1.00) d, respectively. The CTL activity and IgG levels secreted by B cells in the CSCs-DC+TP group were the highest, the CSCs-DC group was the second, TP group was lower than the CSCs-DC group and the CSCs-DC+TP group, but was higher than the PBS group, and the difference was statistically significant (Plt;0.01).ConclusionThe therapeutic effect of CSCs-DC vaccine combined with low-dose TP in the treatment of the mouse breast cancer is better than CSCs-DC vaccine and TP alone.

breast neoplasms; cancer stem cells; vccine; paclitaxel; cisplatin

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.41.005

R737.9

A

1002-266X(2017)41-0016-04

國家自然科學(xué)基金資助項目(81302133)；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項基金資助項目(2042014kf0149)；湖北省自然科學(xué)基金資助項目(2012FKC143)。

陳心(1981-)，女，博士,主治醫(yī)師,主要研究方向為腫瘤干細胞的研究與應(yīng)用。E-mail：whdxchenxin@163.com

2017-05-10)