融合蛋白SMP30-IP10真核表達質粒的構建及其對肝癌細胞遷移、侵襲、增殖的影響

謝美玉，郭順利，賓曉蕓，石明霞，陳安寧，陳思宇，周素芳

(廣西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院,南寧 530021)

融合蛋白SMP30-IP10真核表達質粒的構建及其對肝癌細胞遷移、侵襲、增殖的影響

謝美玉，郭順利，賓曉蕓，石明霞，陳安寧，陳思宇，周素芳

(廣西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院,南寧 530021)

目的構建融合蛋白SMP30-IP10真核表達質粒，并初步探究其對肝癌細胞株SK-hep1遷移、侵襲及增殖的影響。方法將肝癌細胞株SK-hep1分為兩組，實驗組轉染pIRES-SMP30-IP10質粒，對照組轉染空質粒pIRES;通過重疊PCR方法構建pIRES-SMP30-IP10真核表達質粒;采用脂質體轉染法轉染肝癌細胞SK-hep1;Western blotting法檢測蛋白表達;Transwell法檢測細胞的遷移和侵襲能力;CCK8法檢測細胞增殖能力。結果通過PCR、雙酶切及測序鑒定證實成功構建了真核表達質粒pIRES-SMP30-IP10，并在肝癌細胞株SK-hep1中正確表達。與對照組相比，實驗組細胞遷移、侵襲能力下降(P均lt;0.05),但細胞形態(tài)及增殖能力均差異無統(tǒng)計學意義(P均gt;0.05)。結論成功構建了融合蛋白SMP30-IP10真核表達質粒，融合蛋白SMP30-IP10可抑制肝癌細胞的遷移、侵襲能力，但對細胞的增殖能力影響不明顯。

肝腫瘤；融合蛋白；衰老標志蛋白30；干擾素誘導蛋白10；細胞遷移；細胞侵襲；細胞增殖

肝細胞癌(HCC)是世界范圍內最常見的癌癥，在癌癥引起死亡中排名第三，晚期預后極差，具有高度轉移性,中位生存期為6～9個月[1]。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎病毒及丙型肝炎病毒是肝癌發(fā)生的一個危險因素，而發(fā)展中國家的肝炎病毒感染率較高[2]。其中我國廣西地區(qū)是原發(fā)性肝癌的高發(fā)區(qū)，肝炎病毒的感染與肝癌的發(fā)生存在明顯相關性[3]。而尋找有效的早期標志物及靶向治療基因非常重要。干擾素誘導蛋白10(IP10，又名CXCL10)為ELR陰性的CXC亞家族的趨化因子，由INF-γ誘導樹突狀細胞、成纖維細胞、內皮細胞等多種細胞分泌，具有活化及趨化CXCR3陽性的NK細胞、T細胞等功能[4],在腫瘤組織中IP10表達增加可有效增強過繼治療的療效[5]。此外IP10還能抑制血管生成，使腫瘤組織缺少營養(yǎng)而達到“餓死”腫瘤組織的功能[6]。人衰老標志蛋白30(SMP30，又名RGN)是本課題組早前研究較為深入的一個與肝癌發(fā)生發(fā)展有密切關系的抗肝癌基因。我們發(fā)現(xiàn)，SMP30在肝癌組織中的表達明顯低于癌旁組織，且通過行為學發(fā)現(xiàn)過表達SMP30后的肝癌細胞株遷移及侵襲能力明顯減弱[7]。為此我們考慮將兩種兼具不同抗肝癌作用的基因融合成一個新的靶基因，制備兼具抑制腫瘤遷移侵襲、抑制腫瘤新生血管生成及活化募集免疫細胞等多方向聯(lián)合抑制肝癌轉移的抗癌因子，為肝癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 肝癌SK-hep1細胞株、SMP30cDNA和IP10cDNA由本實驗室保存，Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell購自北京全式金生物技術有限公司，真核表達載體pIRES2-Zs-Green1由黃元姣老師課題組惠贈。高保真PCR試劑盒、普通PCR試劑盒、實時定量熒光定量PCR試劑盒、DNA marker DL2000、DL5000、限制性內切酶EcoR Ⅰ、限制性內切酶XHO Ⅰ、T4連接酶等購自寶生物工程(大連)有限公司；無內毒素質粒小量提取試劑盒及膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；無內毒素質粒大量提取試劑盒購自美國Omega Bio-Tek公司；瓊脂粉購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Lipofectamine3000 和Opti-MEM?Ⅰ購自美國 Invitrogen公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；胎牛血清、含EDTA胰酶購自Gibco公司；鼠抗人α-Tublin 、HRP標記的山羊抗鼠二抗、HRP標記的山羊抗兔二抗購自武漢三鷹生物技術有限公司；鼠抗人SMP30單抗購自美國Abcam;兔抗人IP10單抗購自美國CST公司；BeyoECL Plus、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、彩色預染蛋白質相對分子質量標準(10～180 kD)購自碧云天生物技術有限公司;Transwell 24孔板、Matrigel膠購自康寧公司;CCK8試劑盒購自日本同仁化學研究所。PCR儀購自德國 Biometra公司；熒光倒置顯微鏡購自奧林巴斯公司；全自動掃膜儀購自羅氏公司，F(xiàn)IRE READER 凝膠成像系統(tǒng)購自英國UVI公司;酶標儀購自伯樂公司。

1.2 實驗分組 將肝癌細胞株SK-hep1分為兩組，實驗組轉染pIRES-SMP30-IP10質粒,對照組轉染空質粒pIRES。

1.3 SMP30-IP10真核表達質粒的構建 先分別擴增SMP30和Linker-IP10基因。SMP30正向引物:5′-CGCTCGAGATGTCTTCCATTAAGATTGA-3′,反向引物:5′-GGCTTCTGAGGCTTCGGCTTCTCCCGCATAGGAGTAGGG-3′;Linker-IP10正向引物:5′-CCCTACTCCTATGCGGGAGAAGCCGAAGCCTCAGA-AGCC-3′，反向引物：5′-GGAATTCTTAAGGAGATCT-TTTAGACCTTTCC-3′。其中在SMP30正向引物中加入酶切位點XHOⅠ,Linker-IP10反向引物中加入酶切位點EcoRⅠ,此外SMP30反向引物與IP10正向引物為互補序列。分別進行PCR，將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳后再進行切膠回收純化，得到SMP30模板及Linker-IP10模板,進行overlap PCR以獲得融合序列。具體實驗步驟：第一步反應體系：SMP30和Linker-IP10各1 μL；PCR buffer:2.5 μL；NTP:2 μL；水：16.25 μL混勻后置于PCR反應儀中。95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s;50 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；共5個循環(huán);72 ℃延伸5 min。第二步反應體系：在第一步反應體系基礎上加入正、反向引物(SMP30正向引物及Linker-IP10反向引物)各1 μL;Taq酶：0.25 μL。95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s;55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；共35個循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR產物經XHOⅠ和EcoRⅠ雙酶切后回收克隆入pIRES2-ZS-Green1的XHOⅠ和EcoRⅠ酶切位點間。轉化入Trans T1感受態(tài)中，并讓其在含50 μg/mL卡那霉素的瓊脂平板中生長。挑選單克隆菌落擴大培養(yǎng)后進行菌液PCR及雙酶切初步鑒定，接著將初步鑒定正確的菌液送測序。

1.4 表達融合蛋白SMP30-IP10的肝癌細胞株SK-hep1的構建 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)SK-hep1細胞，并選取合適的G418篩選濃度。在轉染前12 h用胰酶消化細胞，以4×105個細胞每孔接種于6孔板中，待細胞貼壁后用轉染試劑Lipofectamine3000分別將空質粒pIRES2-ZS-Green1(以下簡稱pIRES)及重組質粒pIRES2-ZS-Green1-SMP30-IP10(以下簡稱pIRES-SMP30-IP10)轉入SK-hep1細胞中。轉染48 h后改用含400 μg/mL G418的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以殺死未轉染上質粒的細胞。

1.5 融合蛋白SMP30-IP10表達測定 用胰酶消化分別轉染pIRES及pIRES-SMP30-IP10后的細胞，用PBS洗滌3次后用蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑提取細胞中的總蛋白，冰上裂解30 min后，最高轉速離心20 min，取上清，并用BCA試劑盒測定其蛋白濃度。配制12%分離膠及4%濃縮膠，每孔上樣量為50 μg蛋白，進行SDS-PAGE電泳，選定所需區(qū)域蛋白轉移至0.2 μm PVDF膜上。用0.5%脫脂奶粉封閉1 h后，用一抗SMP30-mAb(1∶1 500),一抗tublin-mAb(1∶5 000)4 ℃過夜孵育，TBST洗滌3次，每次10 min后用HRP標記的鼠二抗室溫孵育1 h，再次洗滌3次后用ECL顯影后進行掃膜觀察，用膜再生液洗膜后再次封閉，以一抗IP10-mAb(1∶1 000)再次過夜孵育，再按以上步驟進行。

1.6 肝癌細胞遷移能力檢測 采用Transwell法。SK-hep1-pIRES、SK-hep1-SMP30-IP10細胞用胰酶消化后用無血清DMEM重懸，進行細胞計數(shù)，將細胞密度調至1×105/mL,于Transwell上室中加入200 μL的細胞懸液，下室加入800 μL完全培養(yǎng)基放至細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h后去除上室中的液體，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛中固定30 min風干，結晶紫染色30 min后用清水清洗2次，風干后于倒置顯微鏡下觀察，隨機選取5個100×視野，對細胞進行計數(shù)，計算平均值。

1.7 肝癌細胞侵襲能力檢測 采用Transwell侵襲小室。SK-hep1-pIRES、SK-hep1-SMP30-IP10細胞胰酶消化后用無血清DMEM重懸，進行細胞計數(shù)，將細胞密度調至5×105/mL,于Transwell上室中加入Matrigel膠50 μL待其凝固后再加入的細胞懸液200 μL，下室加入完全培養(yǎng)基800 μL至細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。去除上室中的液體，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛中固定30 min風干，結晶紫染色30 min后用清水清洗2次，風干后于倒置顯微鏡下觀察，隨機選取五個100×視野，細胞計數(shù)取平均值。

1.8 肝癌細胞增殖能力檢測 采用CCK8法。SK-hep1-pIRES、SK-hep1-SMP30-IP10細胞用胰酶消化后將細胞密度調至5×104/mL，于96孔板每孔加入細胞懸液100 μL，每組做5個復孔，并于96孔板邊緣每孔加PBS 100 μL，分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后每孔加入CCK8溶液10 μL，孵育2 h后用酶標儀于450 nm波長處測其吸光度值。

2 結果

2.1 重組真核表達質粒的鑒定 見圖1。

注：圖1A：pIRES-SMP30-IP10 PCR鑒定結果。M：DNA Marker DL2000；1:SMP30-IP10 PCR產物。圖1B：質粒酶切鑒定結果。M1:DNA Marker DL2000；M2:DNA Marker DL5000；泳道1：空質粒pIRES2-ZS-Green1；泳道2：被XHO Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切后的質粒pIRES-SMP30-IP10。

圖1真核表達質粒pIRES-SMP30-IP10初步鑒定

2.2 穩(wěn)定表達融合蛋白SMP30-IP10的肝癌細胞株構建 轉染后SK-hep1細胞經含G418的培養(yǎng)基篩選7 d后，在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白表達(圖2)，粗略計算轉染效率約為80%。

注：A:轉染空質粒pIRES后SK-hep1細胞熒光下圖像(100×);B:轉染pIRES后SK-hep1細胞白光下圖像(100×);C:轉染重組質粒pIRES-SMP30-IP10后SK-hep1細胞熒光下圖像(100×);D:轉染重組質粒pIRES-SMP30-IP10后SK-hep1細胞白光下圖像(100×)。

圖2細胞系構建圖像

2.3 融合蛋白SMP30-IP10在SK-hep1細胞中的表達 對照組并未表達SMP30-IP10蛋白，而實驗組有融合蛋白SMP30-IP10表達，相對分子質量約為43 kD，證明轉染后能成功表達SMP30-IP10蛋白。

2.4 融合蛋白SMP30-IP10與肝癌細胞遷移、侵襲能力的關系 過表達融合蛋白SMP30-IP10后，肝癌細胞的遷移及侵襲能力下降，對照組、實驗組遷移細胞數(shù)分別為(119.2±11)、(44.2±16.8)個/HP;對照組、實驗組侵襲細胞數(shù)分別為(223.6±19.4)、(115±22.9)個/HP；兩組比較，P均lt;0.05。

2.5 SMP30-IP10與肝癌細胞增殖能力的關系 0、24、48、72、96 h時點，實驗組在450 nm處吸光度值分別為0.38±0.01、0.54±0.02、0.95±0.04、1.82±0.05、1.88±0.15，對照組分別為0.39±0.01、0.55±0.04、1.05±0.06、1.75±0.06、1.88±0.08，實驗組與對照組相比，肝癌細胞的增殖能力并未下降，差異無統(tǒng)計學意義(P均gt;0.05)。

3 討論

本研究構建了新型重組融合蛋白SMP30-IP10，為使兩蛋白序列間起到充分的阻隔而不影響彼此間的蛋白功能，我們在序列間加入了一段柔性連接肽(Gly4Ser)3。構建融合蛋白有兩種方法，其中之一是直接將兩功能蛋白分子相連接，另一種則是通過在兩分子間插入一段連接肽[8]。連接肽的選擇在構建融合蛋過程中非常重要，其一可起到阻隔兩多肽序列，使其不相互折疊纏繞而影響其彼此的蛋白活性；其二可使兩者活性中心相遠離，使其不易于形成空間位阻而影響蛋白活性。此外連接肽的長短，合適的氨基酸組成，柔性、疏水性等均與其阻隔兩蛋白序列的功能有密切關系[9]。通過研究發(fā)現(xiàn)，Gly4Ser3得到較多實驗者的青睞[10]，而本次實驗亦證實了(G4S)3起到了較好的阻隔作用，成功構建了真核表達載體pIRES2-ZSGreen1-SMP30-IP10,并在肝癌細胞株SK-hep1中成功表達融合蛋白SMP30-IP10。

本研究結果顯示，實驗組即過表達融合蛋白SMP30-IP10的SK-hep1細胞遷移、侵襲能力均較對照組下降，表明融合蛋白經連接肽的分隔后其中的SMP30蛋白活性并未受到影響，融合蛋白SMP30-IP10兼具抗腫瘤遷移、侵襲的功能，其抑制腫瘤遷移、侵襲可能與腫瘤微環(huán)境相關，但所涉及的相關通路尚未明確，仍需進一步研究。肝癌的發(fā)生發(fā)展與腫瘤細胞的免疫逃逸、腫瘤微環(huán)境、原癌基因與抑癌基因的穩(wěn)態(tài)平衡相關。IP10是CXC家族中的一員，其受體是CXCR3,其中CXCR3分為兩個亞型，分別是CXCR3A和CXCR3B，CXCR3B在人的血管內皮細胞中選擇性表達，當IP10與血管上的CXCR3B結合后，通過其介導抑制IL-8和b-FGF誘導的新生血管生成，從而發(fā)揮抗血管生成作用[11]。此外，IP10作為趨化因子，其不僅能趨化淋巴細胞、自然殺傷細胞等至病灶區(qū)，且能刺激體內多種細胞因子(IL-12、IL-4、IL-10等)分泌，從而影響腫瘤微環(huán)境，影響腫瘤生長[12]。Wang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，IP10能協(xié)同CTL細胞起到共同抑制肝癌的作用。在本實驗中，融合蛋白對肝癌細胞株的增殖影響并不明顯，我們考慮融合蛋白SMP30-IP10并非作用于自身的肝癌細胞中，而是通過影響腫瘤微環(huán)境的一個穩(wěn)態(tài)，從而影響肝癌的發(fā)生發(fā)展。

近年來，越來越多的學者關注腫瘤微環(huán)境與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系。腫瘤微環(huán)境是由細胞外基質、腫瘤細胞、內皮細胞、免疫細胞、成纖維細胞等及其細胞因子共同構成的局部病理環(huán)境[14]，其穩(wěn)定性與腫瘤的增殖、凋亡、遷移、侵襲等密切相關。SMP30-IP10作為融合蛋白，兼具了IP10的趨化功能，通過影響腫瘤周圍的細胞因子、抑制血管生成、募集免疫細胞等，從而達到抑制腫瘤轉移的目的，但該功能仍需進一步驗證。

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ConstructionofeukaryoticexpressionplasmidcontainingfusionproteinSMP30-IP10anditseffectonmigration,invasion,andproliferationoflivercancercells

XIEMeiyu,GUOShunli,BINXiaoyun,SHIMingxia,CHENAnning,CHENSiyu,ZHOUSufang

(SchoolofPreclinicalmedicineofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

ObjectiveTo construct the eukaryotic expression plasmid of fusion protein SMP30-IP10, and to investigate its effects on migration, invasion, and proliferation of hepatoma cell line SK-hep1.MethodsThe SK-hep1 cells were divided into two groups: the experimental group which was transfected with pIRES-SMP30-IP10 plasmid, and the control group which was transfected with empty pIRES.The eukaryotic expression plasmid pIRES-SMP30-IP10 was constructed by overlapping PCR, and then we transfected the plasimd into hepatoma cell line SK-hep1 by liposome transfection; the protein expression of cells was detected by Western blotting; the migration and invasion of cells were detected by Transwell assay; the proliferation of cells was detected by CCK8.ResultsThe eukaryotic expression plasmid pIRES-SMP30-IP10 was successfully constructed and approved by PCR, double restriction enzyme digestion and DNA sequencing, and was expressed in hepatocellular carcinoma cell line SK-hep1. Compared with the control group, the migration and invasion were inhibited to some extent in the experimental group (bothPlt;0.05), but the morphology and proliferation had no significant change (bothPgt;0.05).ConclusionThe fusion protein SMP30-IP10 eukaryotic expression plasmid is successfully constructed, and it can inhibit the migration and invasion abilitiesof hepatoma cells, but has no effect on the cell proliferation.

liver neoplasms; fusion protein; senescence marker protein-30; interferon-inducible protein 10; cell migration; cell invasion; cell proliferation

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.41.002

R735.7

A

1002-266X(2017)41-0005-04

國家自然科學基金項目(81460432,81572994)；廣西自然科學基金項目(2015GXNSFDA139017)；廣西科學研究與技術開發(fā)計劃項目(15104001-7)；廣西南寧青秀區(qū)科學研究與技術開發(fā)計劃項目(2014S03)。

謝美玉(1990-)，女，研究生，主要研究方向為肝癌的早期診斷及其靶向治療。E-mail:xiemeiyu113@126.com

周素芳(1964-)，女，博士，教授，主要研究方向為腫瘤相關抗原分子生物學研究。E-mail:zsf200000@163.com

2017-08-10)