超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定茶葉中高氯酸鹽和氯酸鹽

宋正規(guī)，張書芬，周子焱，張愛芝，沈堅*，傅曉，李和生，邢家凓，滿正印，趙春玲，曹麗麗

1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211；2. 寧波市食品檢驗(yàn)檢測研究院，浙江 寧波 315048

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定茶葉中高氯酸鹽和氯酸鹽

宋正規(guī)1，張書芬2，周子焱2，張愛芝2，沈堅2*，傅曉2，李和生1，邢家凓2，滿正印2，趙春玲2，曹麗麗2

1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211；2. 寧波市食品檢驗(yàn)檢測研究院，浙江 寧波 315048

建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定茶葉中高氯酸鹽和氯酸鹽的分析方法。選用ProElut C18固相萃取柱對茶葉提取液進(jìn)行凈化、親水性的Click Xion色譜柱分離，流動相A為水（含5 mmol·L-1甲酸銨），流動相B為V甲醇︰V水=9︰1（含5 mmol·L-1甲酸銨），甲酸調(diào)節(jié)pH至3.2，梯度洗脫分離，UPLC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式檢測。該方法適用于茶葉中高氯酸鹽和氯酸鹽檢測，平均回收率在60.5%～85.8%，RSD在 4.9%～7.7%，高氯酸鹽檢出限為 3 μg·kg-1，氯酸鹽檢出限為 5 μg·kg-1。方法操作簡單、快速、靈敏度高，可以滿足茶葉中高氯酸鹽和氯酸鹽的檢測要求。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；茶葉；高氯酸鹽；氯酸鹽

高氯酸鹽和氯酸鹽是一類無機(jī)含氯化合物，成年人每天攝入0.072～0.200 μg，可破壞紅細(xì)胞，影響血液運(yùn)輸氧氣，造成礦物質(zhì)流失，內(nèi)環(huán)境紊亂[1]。高氯酸鹽是一種持久性、極易溶于水、流動性極強(qiáng)的全球污染物[2]。它可以干擾甲狀腺素的合成與分泌，影響人體正常的新陳代謝，阻礙人體生長發(fā)育，對兒童影響尤為嚴(yán)重，體內(nèi)的高氯酸鹽過量，兒童會出現(xiàn)智商偏低、學(xué)習(xí)障礙、發(fā)育遲緩、多動癥、注意力分散，甚至?xí)霈F(xiàn)弱智等癥狀[3]。為此，2005年2月，美國科學(xué)院宣布高氯酸鹽參考劑量為0.7 μg·kg-1·d-1[4]。氯酸鹽是飲用水消毒過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品，可直接通過飲用進(jìn)入人體，也可經(jīng)過自然界含氯化合物的分解產(chǎn)生氯酸鹽，通過降水，進(jìn)入動植物的體內(nèi)，通過食物消化吸收進(jìn)入人體。氯酸鹽具有較強(qiáng)的氧化性，進(jìn)入人體對內(nèi)環(huán)境造成影響，造成飲用水中對人體有用的礦物質(zhì)流逝，氯酸鹽也會阻礙甲狀腺吸收碘[3]。

茶葉作為一種大眾喜愛的傳統(tǒng)飲品，目前全國飲茶人數(shù)達(dá)到4.7億，長期以來在中國飲品市場中占有重要地位，同時大量出口國外。2016年，全國茶園面積共計 293.33萬 hm2，全國干毛茶產(chǎn)量243萬t，產(chǎn)值近1900億元，茶葉出口總量32.5萬t，出口額13.8億美元[4]。但隨著煙花行業(yè)、工業(yè)和航空業(yè)的發(fā)展，大量的氯酸鹽和高氯酸鹽排入環(huán)境中，不易分解，并易于流動，是一種持久性污染物，茶葉中氯酸鹽最大殘留標(biāo)準(zhǔn)目前各國尚未做規(guī)定。歐盟有關(guān)組織根據(jù)茶葉中高氯酸鹽的合理含量研究，正在就擬定茶葉中實(shí)施高氯酸鹽 0.75 mg·kg-1限量標(biāo)準(zhǔn)事宜進(jìn)行商討[5-6]，而歐洲食品安全局2015年編訂的《食品中氯酸鹽對公共健康風(fēng)險評估》指出應(yīng)按照歐盟396/2005號法規(guī)附件一中規(guī)定的沒有具體殘留標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的按照 0.01 mg·kg-1默認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。2016年農(nóng)業(yè)部對江西、安徽兩省的茶葉樣品進(jìn)行安全評估，結(jié)果顯示，高氯酸鹽平均檢出值為 0.239 mg·kg-1，其中六安市為0.341 mg·kg-1，其余都為 0.100 mg·kg-1[6]。同時我國也在進(jìn)行積極協(xié)商，目前我國茶葉中高氯酸鹽暴露性風(fēng)險評估尚未有報道，但從水源監(jiān)測結(jié)果顯示多地水源受到污染，推斷茶葉中污染狀況不容樂觀，如果該標(biāo)準(zhǔn)一旦實(shí)施，中國茶葉出口業(yè)或?qū)⒃馐苤卮鬀_擊[7-9]。目前，高氯酸鹽和氯酸鹽的檢測方法主要有分光光度法[10-11]，離子色譜法[12]，離子色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13-14]。離子色譜法檢測飲用水中的高氯酸鹽[15]，液相色譜檢測茶葉中的高氯酸鹽[16]，離子色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法同時檢測水中、碳酸飲料中的高氯酸鹽和氯酸鹽已有報道[17-18]，但運(yùn)用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法同時檢測茶葉中的高氯酸鹽和氯酸鹽尚未見報道，相比離子色譜同時檢測高氯酸鹽和氯酸鹽，氯酸鹽檢出限有所提高，檢測時間大大縮短。

本研究利用 LC-MS/MS檢測手段，建立了同時檢測茶葉中的高氯酸鹽和氯酸鹽的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。通過對凈化、色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，樣品前處理過程簡單，準(zhǔn)確度高，方法可用于茶葉中高氯酸鹽和氯酸鹽的檢測和監(jiān)控。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-MS-6470型液相串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀器（美國Agilent公司），Click Xion色譜柱（2.1 mm×100 mm，5 μm，100 ?，中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究院研制）；ZORBAX SB-Aq Rapid Resolution HD（2.1 mm×100 mm，1.8 μm，美國 Agilent公司）；Infinity Poroshell 120 Hilic（4.6 mm×150 mm，2.7 μm，美國 Agilent公司），OnGuard ⅡRP固相萃取小柱(500 mg，6 mL，美國Dionex公司)，ProElut CARB固相萃取柱（500 mg，6 mL，迪馬科技），ProElut C18固相萃取柱（500 mg，6 mL，迪馬科技），0.2 μL水系濾膜（美國Agilent公司）。

高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液：（1 000 mg·mL-1，美國Inorganic Ventures公司），氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)濃度：（1 000 mg·mL-1，美國 Inorganic Ventures 公司），甲醇（色譜純，德國默克股份兩合公司），甲酸（分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），甲酸銨（分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），硫酸氫鈉（分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），磷酸氫鉀（分析純，權(quán)宇化工），實(shí)驗(yàn)用水均為超純水（法國 Millipore公司超純水器制備），其他試劑及其設(shè)備。

1.2 液相色譜與質(zhì)譜條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Click Xion色譜柱，耐受pH 2～8；柱溫：35℃；流動相A：水（5 mmol·L-1甲酸銨），流動相B：甲醇和水（V甲醇∶V水=9∶1）含 5 mmol·L-1甲酸銨，流速 0.2 mL·min-1。流動相梯度洗脫程序：0～2 min，5%A；2～6 min，5%A～60%A；6～6.5 min，60%A～5%A；6.5～8.0 min，5%A；進(jìn)樣量 10 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

ESI-離子源模式，離子源溫度 250℃，電噴霧電壓：3 000 V,采集時間200 ms，高氯酸鹽碎裂電壓120 V，碰撞能量分別為：29 V、45 V，監(jiān)測離子對：m/z：83/99、67.1/99。氯酸鹽質(zhì)譜碎裂電壓50 V，碰撞能量分別25 V、41 V，監(jiān)測離子對：m/z：67.1/83，51.1/83。

1.3 樣品的前處理

稱取茶葉樣品粉末1 g于50 mL聚丙烯離心管中，加入20 mL 0.1%（V/V）乙酸水溶液，渦旋2 min，40℃提取時間為25 min。以8 000 r·min-1離心5 min，取上清液于離心管中待用，取色譜純甲醇 5 mL和去離子水 5 mL活化ProElut C18固相萃取小柱，吸取2 mL上清液過固相萃取小柱，并棄去流出液，再上樣2 mL，滴入10 mL玻璃離心管中，上機(jī)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

試驗(yàn)選擇 ESI-離子源模式，常用離子源溫度250℃，電噴霧電壓：3 000 V,采集時間200 ms。500 ng·mL-1標(biāo)準(zhǔn)高氯酸鹽和氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液直接通過兩通進(jìn)入質(zhì)譜，分別給定80 V、40 V碎裂電壓對高氯酸鹽和氯酸鹽進(jìn)行全掃描，通過全掃描質(zhì)譜圖確定高氯酸鹽和氯酸鹽即目標(biāo)化合物母離子的質(zhì)荷比，質(zhì)荷比為99，質(zhì)荷比為83。小分子化合物碎裂電壓一般都在200 V以下，一般小分子化合物碰撞池加速電壓設(shè)為3 V，根據(jù)高氯酸鹽和氯酸鹽響應(yīng)手動調(diào)節(jié)確定高氯酸鹽和氯酸鹽碎裂電壓分別為120 V、50 V。另外發(fā)現(xiàn)氯酸鹽的響應(yīng)信號低，通過調(diào)節(jié)流動相pH以增強(qiáng)其響應(yīng)信號，實(shí)驗(yàn)后續(xù)通過甲酸調(diào)節(jié)流動相pH 3.2增強(qiáng)了響應(yīng)信號。因碰撞能量低于碎裂電壓，采用四分法逐段調(diào)節(jié)碰撞能量，最終選擇高氯酸鹽最佳定性和定量碰撞能量分別為：29 V、45 V，氯酸鹽最佳定性和定量碰撞能量分別為：25 V、41 V。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

試驗(yàn)比較了 Infinity Poroshell 120 Hilic,ZORBAX SB-Aq Rapid Resolution HD，Click Xion 3種色譜柱對高氯酸鹽和氯酸鹽的保留效果，流動相采用甲醇-水。

Infinity Poroshell 120 Hilic色譜柱在工作條件下，固定相表面首先建立一個富集水的液體層，極性和親水性物質(zhì)易于溶解，待分析物在流動相和該親水層之間分配，對分離親水性化合物有一定效果，高氯酸鹽和氯酸鹽都為極易溶于水的極性化合物。但結(jié)果顯示，高氯酸鹽和氯酸鹽在Infinity Poroshell 120 Hilic柱上0.7 min出峰，沒有保留，該色譜柱對高氯酸鹽和氯酸鹽沒有分離效果。

ZORBAX SB-Aq Rapid Resolution HD在液相色譜儀中較為常用，該柱屬親水性分離色譜柱，對有機(jī)分子和無機(jī)離子有一定分離效果，可分離大部分待分析物質(zhì)。高氯酸鹽和氯酸鹽在ZORBAX SB-Aq Rapid Resolution HD色譜柱上出峰時間為 1.2 min，對高氯酸鹽和氯酸鹽有一定的保留效果。

Click Xion色譜柱為兩性柱子，硅膠表面鍵合有半胱氨酸，電荷相反的離子平行鍵合在硅膠表面，兩性離子材料同時存在正負(fù)電荷中心，親水性好，對離子吸附分離具有顯著效果。Click Xion色譜柱出峰時間為1.5 min，對加標(biāo)相同濃度的樣品進(jìn)行前處理，Click Xion色譜柱分離后目標(biāo)物響應(yīng)最高。實(shí)驗(yàn)選擇 Click Xion色譜柱作為分析色譜柱。

2.2.2 流動相的選擇

試驗(yàn)比較了乙腈-水，甲醇-水兩種常用流動體系。結(jié)果表明乙腈-水做流動相高氯酸鹽和氯酸鹽響應(yīng)較高，但乙腈-水流動體系出峰為 0.7 min，出峰較早，且出現(xiàn)明顯分叉和拖尾現(xiàn)象，難以完成茶葉中高氯酸鹽和氯酸鹽的分析。甲醇-水流動相體系出峰為1.5 min，但峰型出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。為進(jìn)一步優(yōu)化分離效果，調(diào)節(jié)流動相體系甲酸銨濃度為5 mmol·L-1，峰型得以改善，但相比乙腈作流動相響應(yīng)有所降低，用甲酸調(diào)節(jié)流動相 pH為 3.2，響應(yīng)有所增加。因此最終選擇流動相 A為水（含 5 mmol·L-1甲酸銨），流動相 B 為 V甲醇︰V水=9︰1（含 5 mmol·L-1甲酸銨），pH 3.2，出峰時間1.5 min。圖1為該方法下5 ng·mL-1高氯酸鹽與氯酸鹽標(biāo)樣MRM掃描圖。

圖1 5 ng·mL-1高氯酸鹽與氯酸鹽標(biāo)樣MRM掃描圖Fig. 1 Mass spectrum of standard solution containing 5 ng·mL-1 of perchlorate and chlorate ion

2.3 固相萃取柱的優(yōu)化

2.3.1 固相萃取柱的選擇

考慮到 ProElut C18對茶湯中的大部分有機(jī)物質(zhì)吸附能力強(qiáng)，且較為常用，決定選擇ProElut C18固相萃取柱對茶湯進(jìn)行凈化處理。ProElut CARB固相萃取柱對茶葉中的葉綠素、葉黃素、胡蘿卜素、黃酮類物質(zhì)、茶多酚等干擾物質(zhì)保留作用顯著，常作為茶葉中萃取除雜過程的吸附劑[19]。OnGuard ⅡRP固相萃取小柱對于去除茶葉提取液中的大分子和小分子物質(zhì)都有明顯吸附作用[20]。因此試驗(yàn)選擇ProElut C18固相萃取柱，ProElut CARB固相萃取柱，OnGuard ⅡRP 固相萃取小柱進(jìn)行考察。

試驗(yàn)分別用色譜純甲醇5 mL和去離子水5 mL進(jìn)行活化，用高氯酸鹽和氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液配制含、均為 200 ng·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別流過準(zhǔn)備好的固相萃取小柱，標(biāo)樣過柱，棄去前2 mL流出液，對其在萃取過程回收率進(jìn)行研究（表1）。

表1 3種固相萃取小柱對高氯酸鹽和氯酸鹽回收率的影響Table 1 The recoveries of perchlorate and chlorate purified by different solid phase extraction columns %

分別用 200 ng·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液對 3種固相萃取小柱上樣，棄去前2 mL流出液，收集所得溶液與 200 ng·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液一同上機(jī)。試驗(yàn)結(jié)果顯示 OnGuard ⅡRP、ProElut C18、ProElut CARB相比標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)都有降低，標(biāo)準(zhǔn)液流過ProElut CARB固相萃取柱所得響應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)相比降低了約16%，氯酸鹽響應(yīng)降低19%，OnGuard ⅡRP固相萃取小柱響應(yīng)降低較小。同時考慮到3種固相萃取小柱的價格，ProElut C18固相萃取柱最便宜，成本低，只有ProElut CARB固相萃取柱的一半，OnGuard ⅡRP固相萃取小柱為進(jìn)口小柱，價格昂貴。綜合考慮，ProElut C18對高氯酸鹽和氯酸鹽回收率尚好，且價格較低，試驗(yàn)選用ProElut C18固相萃取柱作為凈化柱。

2.3.2 ProElut C18固相萃取柱凈化體積的優(yōu)化

選擇同種茶葉1 g，分別加標(biāo)200 ng，進(jìn)行提取。所得溶液分別通過 ProElut C18固相萃取小柱，每間隔 0.5 mL分別收集流出液，渦旋，以高氯酸鹽峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，流出體積為橫坐標(biāo)，繪制高氯酸鹽流過 ProElut C18固相萃取柱的洗脫曲線圖，由圖2可知，用2 mL提取液穩(wěn)定固相萃取柱后，收集2 mL進(jìn)行測定，其高氯酸鹽測定結(jié)果基本穩(wěn)定。

圖2 ProElut C18固相萃取小柱凈化后高氯酸鹽流出曲線Fig. 2 Outflow of perchlorate in tea extract by ProElut C18

2.4 樣品的線性關(guān)系、回收率和相對偏差

選擇茶葉樣品 3份，用 ProElut C18固相萃取柱進(jìn)行高氯酸鹽和氯酸鹽的方法學(xué)考察。取3種不同茶葉進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，分別添加 20、40、100 μg·kg-1按照前處理方法操作，每個濃度水平進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，外標(biāo)法定量。結(jié)果如表2，3種茶葉的平均回收率在60.5%～85.8%之間，RSD在4.9%～7.7%，方法具有較好的精密度。圖 3為空白基質(zhì)、5 ng·mL-1標(biāo)準(zhǔn)混合工作液、空白白茶基質(zhì)加標(biāo)100 μg·kg-1的MRM圖。時間穩(wěn)定，空白基質(zhì)對茶葉中高氯酸鹽與氯酸鹽的測定無干擾作用。

表2 測定3種茶葉中高氯酸鹽和氯酸鹽的平均回收率和相對偏差Table 2 Spiked recoveries and RSDs of perchlorate and chlorate in 3 kinds of tea

圖3 空白基質(zhì)、標(biāo)準(zhǔn)工作液、空白白茶基質(zhì)加標(biāo)的MRM圖Fig. 3 Mass spectrum of blank tea, standard solutions and blank white tea matrix labeling

前期實(shí)驗(yàn)過程中，在上機(jī)超純水及配制的乙酸提取液中檢測到微量的高氯酸鹽和氯酸鹽，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[20-22]，不同地區(qū)地下水受到不同程度的污染，存在干擾，但根據(jù)多次試驗(yàn)最終確定污染來源于樣品瓶和試劑瓶的洗滌殘留，試驗(yàn)更換新的試驗(yàn)容器未檢出高氯酸鹽和氯酸鹽。

2.5 實(shí)驗(yàn)干擾分析

實(shí)驗(yàn)存在m/z99的磷酸氫根和硫酸氫根的同位素離子（和）的干擾，實(shí)驗(yàn)提取了 10 ng·mL-1硫酸氫鈉和磷酸氫鉀的MRM掃描圖，結(jié)果顯示磷酸氫根出峰時間為 0.8 min，硫酸氫根出峰時間2.4 min，Click Xion色譜柱實(shí)現(xiàn)、和分離，10 ng·mL-1磷酸氫鈉和硫酸氫鈉相比同濃度高氯酸鹽響應(yīng)較低，同時驗(yàn)證了在超純水中添加 10 ng·mL-1Ba(OH)2溶液，響應(yīng)未有降低，綜上分析，磷酸氫根和硫酸氫根的同位素離子未對實(shí)驗(yàn)造成干擾。

3 結(jié)論

本研究建立了同時分析茶葉中高氯酸鹽和氯酸鹽的檢測方法，優(yōu)化了色譜條件、質(zhì)譜條件和固相萃取技術(shù)，并考察實(shí)際茶葉樣品中高氯酸鹽和氯酸鹽的檢測效果，其中部分茶葉中檢測出低含量的高氯酸鹽和氯酸鹽存在。該研究根據(jù)2.4章節(jié)測定的高氯酸鹽和氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線，在不含目標(biāo)化合物的陰性茶葉中添加不同濃度的高氯酸鹽和氯酸鹽混合溶液，測定后以高氯酸鹽和氯酸鹽信噪比不低于 3（S/N≥3）確定檢出限（LOD），以S/N≥10確定定量限（LOQ），確定了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定茶葉中高氯酸鹽檢出限為3 μg·kg-1，定量限為 10 μg·kg-1，氯酸鹽檢出限為 5 μg·kg-1，定量限為15 μg·kg-1。方法靈敏度高。檢測效率高、簡單快捷、無拖尾現(xiàn)象、前處理過程簡單，可滿足茶葉中高氯酸鹽和氯酸鹽的檢測要求。

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Simultaneous Determination of Perchlorate and Chlorate in Tea by Ultra-peryethylene Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

SONG Zhenggui1, ZHANG Shufen2, ZHOU Ziyan2, ZHANG Aizhi2, SHEN Jian2*, FU Xiao2，LI Hesheng1, XING Jiali2, MAN Zhengyin2, ZHAO Chunling2, CAO Lili2

1. Ocean College of Ningbo University, NingBo 315211, China; 2. Ningbo Institute For Food Control, Ningbo 315048, China

A method using ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry was developed for the determination of perchlorate and chlorate in tea. Tea extracts were purified by ProElut C18, separated by Click Xion column. The mobile phases were 5 mmol·L-1ammonium formate/water (A) and methanol: 5 mmol·L-1ammonium formate/water =9︰1 (B). The pH was adjusted to 3.2 by formic acid and the samples were then analyzed by UPLC-MS/MS with multiple reaction monitoring mode (MRM). The method was applied to detect perchlorate and chlorate in tea. The average recovery and relative standard deviations were in the range of 60.5%-85.8% and 4.9%-7.7%,respectively. The detecting limits of perchlorate and chlorate were 3 μg·kg-1and 5 μg·kg-1, respectively. The method is simple, quick and high sensitive, which is suitable for the determination of perchlorate and chlorate in tea.

ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, tea, perchlorate, chlorate

TS272.5；O657.63

A

1000-369X(2017)06-597-08

2017-07-19

2017-10-18

浙江省食品藥品監(jiān)管系統(tǒng)科技計劃項(xiàng)目（SP201617）

宋正規(guī)，男，碩士研究生，主要從事食品安全檢測研究。*通訊作者：13805841749@163.com