茶樹miR156a靶基因SPL6和SPL9的克隆及表達分析

劉亞芹，田坤紅，孫琪璐，潘鋮，李葉云，蔣家月，江昌俊,2*

1. 安徽農業大學茶樹生物學與資源利用國家重點實驗室，安徽 合肥，230036；2. 信陽師范學院河南省茶樹生物學重點實驗室，河南 信陽，464000

茶樹miR156a靶基因SPL6和SPL9的克隆及表達分析

劉亞芹1，田坤紅1，孫琪璐1，潘鋮1，李葉云1，蔣家月1，江昌俊1,2*

1. 安徽農業大學茶樹生物學與資源利用國家重點實驗室，安徽 合肥，230036；2. 信陽師范學院河南省茶樹生物學重點實驗室，河南 信陽，464000

MicroRNA156a-SQUAMOSA promoter binding-like protein（miR156a-SPLs）參與植物生長階段轉變、葉片形態建成和逆境脅迫等復雜的生理過程?；诓铇滢D錄組數據，從茶樹中克隆出 2個 SPL家族成員——CsSPL6和CsSPL9。CsSPL6cDNA全長2 318 bp，ORF框長1 668 bp，編碼555個氨基酸；CsSPL9cDNA全長1 954 bp，ORF框長1 116 bp，編碼371個氨基酸；CsSPL6和CsSPL9都有典型SBP結構域和Csn-miR156a識別位點。時空表達特性分析表明，Csn-miR156a在芽中表達量最高，第 7葉中最低，與CsSPL6和CsSPL9呈負調控關系；不同品種（系）表達特性分析表明，Csn-miR156a的表達模式與新梢生長量、光合指標結果一致，與CsSPL6和CsSPL9表達模式相反，說明 Csn-miR156a、CsSPL6和CsSPL9參與茶樹生長過程，Csn-miR156a和CsSPLs可作為初步判斷品種生長勢強弱的分子手段；高溫處理4個品種（系）表達特性表明Csn-miR156a與CsSPL9呈負相關，推斷茶樹在高溫脅迫下Csn-miR156a可能通過負調控CsSPL9來增加耐高溫性。Csn-miR156a負調控CsSPLs在茶樹生長發育、逆境脅迫中發揮作用，為茶樹生長和抗逆機制提供理論依據。

茶樹；生長勢；高溫；miR156a；SPL

SQUAMOSA 啟動子結合蛋白（SQUAMOSA promoter binding protein-like，SPL）是植物特有和保守的一個轉錄因子，最先在金魚草[1]中分離。研究發現，miR156通過轉錄后水平抑制擬南芥 SPL轉錄因子的表達從而調控植株生長發育、形態建成、花青素積累、孢囊發育、赤霉素合成、信號轉導，以及脅迫響應等生理過程[2-7]。目前在擬南芥中已鑒定出 17個 SPL家族成員，其中11個成員——SPL2、SPL3、SPL4、SPL5、SPL6、SPL9、SPL10、SPL11、SPL13a/b和SPL15具有miR156識別位點[8-10]，并且受其負調控。不同的SPL成員在擬南芥生長階段發揮著不同的作用，ATSPL3、ATSPL4、ATSPL5調控階段轉變和開花[3,10]；ATSPL8參與花藥發育和赤霉素合成[11]；AtSPL9和AtSPL15調控葉原基長度、器官大小、芽葉成熟[5,12]；ATSPL2、ATSPL10、ATSPL11在生殖生長階段調控芽葉生長[13]。

在逆境脅迫下，Cui等認為miR156可被作為信號分子，通過miR156-SPL9-DFR的途徑參與植物生長和非生物脅迫[14]。擬南芥在響應高溫脅迫時，miR156表達量會急劇增加，SPL2和SPL11則表現降低趨勢[15]。苜蓿[16]在干旱脅迫下，miR156的過表達使其有更強的耐旱性，miR156通過下調SPL13的表達來提高抗旱性。對棉花進行鹽脅迫和干旱脅迫發現，miR156通過負調控SPL2來提高耐受力[17]。磷酸鹽脅迫下，擬南芥的根際酸化能力與 miR156呈正調控關系，與SPL3呈負調控關系[18]。

近年來，SPL轉錄因子在越來越多的物種如枳[19]、水稻[8,20]、花生[21]、陸地棉[22]、草莓[23]等植物中被克隆。miR156-SPLs的功能與分子機制的研究成為熱點，越來越多的功能被挖掘。然而目前研究的植物大多是草本植物，對于茶樹這樣的木本植物研究較少。本研究基于茶樹轉錄組數據，采用cDNA末端快速擴增（rapid amplification of cDNA ends，RACE）方法克隆出CsSPL6和CsSPL9的基因全長，檢測 Csn-miR156a和CsSPLs在茶樹不同葉位、不同品種（系）和高溫脅迫中的表達量，為揭示 Csn-miR156a-CsSPLs在茶樹生長發育、抗逆性中的作用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及處理

植物材料選取生長勢不同的東北抗、黃山白茶1號（C. sinensiscv. Huangshanbaicha）、舒茶早（C. sinensiscv. Shuchazao）、特香早（C.sinensiscv. Texiangzao）4個茶樹品種（系）。茶樹新株系東北抗是本課題組從祁門櫧葉群體種中篩選的優良單株，通過多年觀察，發現該株系具有生長旺盛、速度快和耐高溫的特性。

不同葉位：選取芽、第1葉、第3葉、第5葉、第7葉。高溫脅迫處理參數：溫度為38℃/28℃，相對濕度為80%/70%，平均光強為600 μmol·m-2·s-1，光周期為14 h/10 h。以處理0、1、2、3、4 d時間點的芽下第2葉為材料。每個樣品均為3個生物學重復，樣品采集后立即投入液氮處理，冷凍后–80℃儲存備用。

1.2 茶樹生長勢特性測定

新梢生長量測定：腋芽萌發時選取生育期基本一致的進行掛牌，每個品種（系）10株，每隔3 d測定芽葉生長量[24]。

光合作用的測定：取芽下第3葉為測試材料，采用LI-COR 6400便攜式光合測定系統分析儀（LI-COR，美國）在光強1 200 μmol·m-2·s-1，氣體流速500 μmol·s-1，CO2濃度 500 μmol·mol-1，葉溫(25±1)℃，空氣濕度(70±5)%條件下測定凈光合速率Pn、蒸騰速率Tr、氣孔導度Gs。

1.3 總RNA提取及cDNA的合成

實驗材料經液氮研磨后，使用 RNAiso Plus提取試劑盒及Fruit-mate for RNA Purification（TaKaRa，大連）提取 RNA。用核酸定量儀（Thermo Electron，美國）測定總RNA樣品的濃度、純度，用1.2%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性，－80℃儲存備用?？俁NA反轉錄為cDNA使用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa，大連）試劑盒。

1.4 CsSPL6和CsSPL9基因全長克隆

從茶樹轉錄組數據中獲得2個SPL轉錄因子序列，利用Primer 5.0設計引物（表1），驗證片段后通過 SMART-RACE-PCR技術對CsSPL6和CsSPL9的 3′和 5′端進行擴增。第一輪擴增以SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech，美國）合成 3′和5′cDNA第一鏈為模板，擴增體系為50 μL：10×LATaqbufferⅡ（Mg2+plus）5 μL，UPM（ 10 μmol·L-1） 5 μL ， dNTP Mixure (2.5 mmol·L-1) 4 μL ， RACE GSP primer（ 10 μmol·L-1）1 μL，cDNA 1 μL，LA Taq（5 U·μL-1）0.3 μL，ddH2O 33.7 μL。PCR 擴增參數為：94℃3 min；94℃ 30 s、72℃ 2 min，5 個循環；94℃30 s、70℃ 30 s、72℃ 2 min，5個循環；94℃30 s、65℃ 30 s、72℃ 2 min，25 個循環；72℃延伸 10 min。第二輪擴增以第一輪稀釋 50倍的擴增產物為模板，反應體系同第一輪擴增。反應參數：94℃ 3 min，94℃ 45 s，67℃ 45 s，72℃ 2 min，30個循環；72℃ 10 min。產物用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen，美國）試劑盒進行回收，連接pMD 19-T載體，轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，菌落PCR挑選陽性克?。ㄖ辽?個重復），測序由上海生工有限公司完成。獲得全長序列后，跨開放閱讀框（ORF）設計特異引物，驗證序列完整性。

1.5 序列生物信息學分析

用EditSeq和MegAlign軟件查詢ORF框、氨基酸序列。蛋白質等電點和分子量用EditSeq軟件分析，ExPASY-ProtScale（http://web.expasy.org/protscale）預測親/疏水性，SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0）預測信號肽，TMHMM （http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0）預測跨膜螺旋，NetPlos2.0 PredictProtein （https://ppopen.informatik.tu-muenchen.de）預測蛋白質的亞細胞定位，SOPMA （https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sop ma.html）預測蛋白質的二級結構，SWISS

MODEL （https://swissmodel.expasy.org/interactive）模擬蛋白質的三維結構，保守結構域的預測在NCBI(https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi)中進行，用Clustal Omega（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo）比對蛋白質的同源性序列，擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、葡萄（Vitis vinifera）、小立碗蘚（Physcomitrella patens）SBP轉錄因子基因序列參照文獻[21]，利用MEGA5.1[25]軟件并通過鄰接（N-J）算法構建系統進化樹。

1.6 茶樹Csn-miR156a和SPLs的表達分析

熒光定量分析東北抗不同葉位、4個品種（系）間和高溫脅迫下 Csn-miR156a和SPLs的表達。根據 miR156a成熟序列設計具有莖環結構的反轉錄引物和 miR156a熒光定量正反向引物[26]。Csn-miR156a熒光定量內參為Csn-pc-3p-222[27]，CsSPLs的內參為 GAPDH。熒光定量實驗體系和反應參數按照SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒（TaKaRa，大連）說明進行。采用 CFX96TMReal-Time PCR Detection System進行PCR擴增，每個樣品3次生物學重復。驗證目標基因和內參基因的擴增效率和擴增范圍，采用2-ΔΔCT法進行相對表達量的計算。

2 結果與分析

2.1 CsSPL6和CsSPL9的全長克隆和序列分析

以 CsSPL6-3′RACE和 CsSPL6-5′RACE引物分別擴增出約1 000 bp（圖1-A）和750 bp（圖1-B）的片段，拼接后利用引物CsSPL6-F/R驗證ORF框完整性（圖1-C）。經測序和分析，得到CsSPL6全長為2 318 bp，包含1個1 688 bp完整的ORF框，編碼1個由 555個氨基酸組成的蛋白（圖 2）。預測蛋白分子量為 60.44 kDa，等電點為 6.58。以引物 CsSPL9-3′RACE擴增出 500 bp（圖 1-D）左右的片段，CsSPL9-5′RACE擴增出1 200 bp（圖 1-E）左右的條帶，利用 CsSPL9-F/R驗證ORF框完整性（圖1-F）。測序分析表明，茶樹CsSPL9基因全長1 954 bp，完整ORF框大小為1 116 bp，編碼371個氨基酸（圖2）。預測的蛋白質分子量是 39.62 kDa，等電點為8.3。CsSPL6和CsSPL9序列提交至GenBank，登錄號KX808499和KY569510。

CsSPL6和 CsSPL9蛋白為親水性蛋白，Score值小于0.5，不存在信號肽。CsSPL6不存在跨膜結構，不屬于跨膜蛋白。在CsSPL9上發現1處由內到外的跨膜螺旋和1處由外到內的跨膜螺旋，存在跨膜區域，屬于跨膜蛋白，CsSPL6和CsSPL9定位于細胞核。CsSPL6由9.55%的 α-螺旋（Alpha helix）、11.89%的 β-折疊（Beta sheet）和 55.41%的無規則卷曲（Random coil）組成，CsSPL9由19.41%的α-螺旋、8.63%的β-折疊和52.02%的無規則卷曲組成。CsSPL6和CsSPL9屬于α/β型（圖3），具有高等植物轉錄因子特有的SBP結合域。

圖 1 茶樹 CsSPL6和 CsSPL9全長 cDNAFig. 1 Full cDNA sequences of CsSPL6 and CsSPL9 in C. sinensis

圖3 預測的CsSPL6/CsSPL9蛋白三級結構Fig. 3 Tertiary structure prediction of protein CsSPL6/CsSPL9

圖2 CsSPL9和CsSPL6 cDNA全長與推導的氨基酸序列Fig. 2 Full cDNA sequences of CsSPL9 and CsSPL6 and their deduced amino acids

續圖2 CsSPL9和CsSPL6 cDNA全長與推導的氨基酸序列Continued Fig. 2 Full cDNA sequences of CsSPL9 and CsSPL6 and their deduced amino acids

2.2 CsSPL6和CsSPL9的進化分析和氨基酸序列的比對

為進一步分析CsSPL6和CsSPL9轉錄因子的進化，將CsSPL6和CsSPL9的氨基酸序列與 34條雙子葉植物（擬南芥和葡萄）、19條單子葉植物（水稻）、13條無花植物（小立碗蘚）的SBP序列進行比對，參考Li[21]的分類方法，構建同源進化樹，SPL轉錄家族被分成 6組（圖 4）。CsSPL6與AtSPL6（At1g69170）、VvSBP1（XM002273498.1）、VvSBP16（XM002265167.1）聚在一類，屬于G2組；CsSPL9與VvSBP8（XM002278476.1）、AtSPL9（At2g42200）、AtSPL15（At3g57920）同處一個分支，屬于G1組，推測CsSPL9與VvSBP8、AtSPL9、AtSPL15具有相似的生物學功能。而小立碗蘚SBP轉錄因子沒有聚類在G1和G2，說明茶樹CsSPL6和CsSPL9轉錄因子和小立碗蘚親緣關系比較遠，而和擬南芥、葡萄較近。不同物種的 SBP轉錄因子并沒有聚在一起，演化情況可能比較復雜。

圖4 茶樹CsSPL6和CsSPL9轉錄因子的進化分析Fig. 4 Phylogenetic analysis of CsSPL6 and CsSPL9 transcription factors in C. sinensis

對茶樹CsSPL6和CsSPL9轉錄因子進行保守結構域預測發現CsSPL6和CsSPL9都含有高度保守的SBP結構域（圖5-A和圖5-B）和 miR156a的識別位點。通過 BlastP同源序列檢索與多序列比對，CsSPL6與葡萄（XP_010663469.1）、可可（XP_017973789.1）、棗（XP_015883292.1）相似度分別為61.10%、61.63%和59.15%；CsSPL9與葡萄（ADG36380.1）、番薯（XP_019186327.1）和可可（XP_017977243.1）的相似度達65.51%、54.59%和59.31%，而且SBP結構域在植物中高度保守（圖5-C）。

圖5 茶樹CsSPL6（A）和CsSPL9（B）轉錄因子的保守域預測及和同源物種SBP結構域比對（C）Fig. 5 Prediction of CsSPL6 (A) and CsSPL9 (B) conserved domains and alignment of SBP domain in C. sinensis and homologous proteins in other species (C)

2.3 茶樹Csn-miR156a和SPLs表達機制分析

2.3.1 不同葉位時序表達

如圖 6顯示，CsSPL6和CsSPL9以及Csn-miR156a在不同葉位中均有所表達，但表達量存在差異。Csn-miR156a在芽中表達量最高，隨著葉位的增加，表達量依次降低；CsSPL6和CsSPL9的表達情況一致，表達量在芽中最低，第7葉中最高，分別是芽的2.3和2.9倍，與Csn-miR156a的表達模式相反。

2.3.2 不同生長勢品種（系）表達

右圖7可見，CsSPL6、CsSPL9和Csn-miR156a在4個品種（系）間表達量差異明顯。Csn-miR156a在4個品種（系）的表達量東北抗最高，特香早最低；而CsSPL6和CsSPL9的表達趨勢一致，與Csn-miR156a呈負相關關系。

新梢生長勢的測定結果表明（圖 8），4個品種（系）生長速度東北抗最快，特香早最慢。光合指標中（表2），Pn和Tr結果一致，東北抗最高，特香早最低，而Gs結果相反。生長勢高的植物Pn和Tr高，Gs低[28-29]，即植物光合能力強而呼吸作用弱，有利于干物質積累，增加植物產量。新梢生長勢和光合作用指標測定結果與 Csn-miR156a的表達量的趨勢一致。東北抗生長速度最快，Csn-miR156a的表達量最高；特香早生長最慢，Csn-miR156a的表達量最低。

圖6 茶樹不同葉位Csn-miR156a-CsSPLs表達水平的qRT-PCR分析Fig. 6 Expression profiles of the Csn-miR156a-CsSPLs in different leaf positions

圖7 茶樹不同品種（系）Csn-miR156a-CsSPLs表達水平的qRT-PCR分析Fig. 7 Expression analysis of Csn-miR156a-CsSPLs in different varieties (strains) by qRT-PCR

圖8 不同品種（系）的新梢長度和生長速率比較Fig. 8 Comparison of new shoots length and growth rate of different tea cultivars(strains)

表2 不同茶樹品種（系）光合指標Table 2 Photosynthesis indexes of different tea cultivars (strains)

2.3.3 響應高溫脅迫表達

從圖 9可以看出，高溫影響CsSPL6、CsSPL9和Csn-miR156a的表達，東北抗和黃山白茶1號Csn-miR156a在處理的第1天表達量達到最高，之后表達水平下降，Csn-miR156a的表達量在4個品種（系）順序為東北抗＞黃山白茶 1號＞特香早＞舒茶早。黃山白茶 1號和舒茶早在處理 1天后CsSPL6表達量達最高，分別達到對照的1.7和2.4倍，隨后呈下降趨勢，仍維持很高水平；特香早經高溫處理后CsSPL6呈波動下降趨勢并在處理第3天降至最低。東北抗在處理的第 2天和第 4天CsSPL9的表達量急劇增加，是對照的3.9倍；舒茶早高溫脅迫 1 d后，CsSPL9劇增達最大值，是對照4.3倍，之后表達量下降仍高于處理前水平。高溫脅迫下，CsSPL6的表達不受Csn-miR156a調控，而CsSPL9受Csn-miR156a負調控。

3 討論

3.1 CsSPL6和CsSPL9的克隆及序列分析

從茶樹中克隆出 SPL家族中 2個成員——CsSPL6和CsSPL9的 cDNA全長序列。序列分析發現，CsSPL6編碼555個氨基酸，CsSPL9編碼371個氨基酸。CsSPL6和CsSPL9編碼蛋白序列都含SBP結構域和miR156a的識別位點。SBP結構域由79個保守的氨基酸殘基組成，結合 2個鋅離子形成鋅指結構（Zinc-finger domain）[30]。2個鋅指結構均由3個半胱氨酸和1個組氨酸殘基形成四面體并結合1個鋅離子，從而形成穩定的構象。其中N-端構成是Cys-Cys-Cys-His，C-端是Cys-Cys-His-Cys，C末端帶有1個雙向核定位信號（Nuclear Localization Signal）KRXXXRRRK[1]，與第2個鋅指結構有部分重疊。Birkenbihl[31]等研究表明，該信號肽序列可以引導 SBP蛋白進入細胞核，從而調控下游相關基因的轉錄表達。系統進化樹發現茶樹CsSPL6和CsSPL9轉錄因子分別屬于G2組和G1組，并且和小立碗蘚親緣關系比較遠，而和擬南芥、葡萄較近；這可能和 SBP轉錄因子序列長度、結構域起始位置、外顯子數量及miRNA識別位點的差異性有關[19]。

3.2 Csn-miR156a和CsSPLs的表達分析

miR156a在擬南芥和大豆第1、2葉表達水平高，隨著葉位增加，表達水平大幅降低[32-34]。miR156a在頂芽中表達量最高并在植物生長發育過程中與 SPL呈負相關關系[35]。目前研究證明 miR156a隨發育進程表達量降低的時序降低機制可能涉及到內源信號分子響應[36]。在本研究中Csn-miR156a與CsSPL6和CsSPL9呈負調控，推測Csn-miR156a通過負調控CsSPL6和CsSPL9參與茶樹生長過程[37]，在茶樹生長階段發育和轉變中起重要作用。

在不同茶樹品種（系）的表達模式中，Csn-miR156a表達趨勢與新梢生長量以及光合指標的測定結果趨勢一致，與CsSPLs呈負調控關系。目前這方面的研究較少，初步推斷Csn-miR156a和CsSPLs表達機制可能是茶樹生長過程中的重要組成部分，Csn-miR156a表達量越高，CsSPLs表達量越低，植物生長可能越快，反之，則越慢，推測 Csn-miR156a和CsSPLs表達機制可作為判斷植物生長快慢的重要分子指標。

高溫脅迫下不同茶樹品種（系）、不同處理時間 Csn-miR156a和CsSPLs表達有所差異，說明在高溫脅迫下存在調控關系。在脅迫處理第1天，Csn-miR156a通過急劇上調減少高溫對植物體的傷害，與Xin等[38]、Stief等[15]研究結果一致。蕓薹屬蔬菜作物受高溫脅迫后，miR156也是下調SPL2來增加耐受性[39]。干旱條件下研究miR156與其呈負調控關系的靶基因SPL6、SPL12、SPL13的表達模式時，發現SPL6、SPL12表達不顯著，無規律，而SPL13表達量明顯下調從而增加氣孔導度、減少水分缺失。推測在干旱脅迫中，miR156調控SPL13占主導部分從而提高抗旱能力[16]。SPL基因家族在響應鹽脅迫后會刺激二級代謝產物如 VATP、GRP、NHX1、RCI2、H＋-ATP酶和SOS1等的合成，從而直接或間接地參與逆境脅迫[17,40-41]。在本研究中，不同茶樹品種（系）在高溫脅迫下，CsSPL9與Csn-miR156a呈負相關，可能是因為茶樹在高溫脅迫下Csn-miR156a通過下調CsSPL9來增加耐高溫性，而其他CsSPLs成員的作用則可能是通過刺激二級代謝產物的合成來達到抵抗高溫的作用，但目前這些產物及其作用機制還是未知的，需進一步研究。

本研究通過茶樹生長勢測定或者高溫脅迫初步揭示 Csn-miR156a-CsSPL的表達機制可以反映植物的生長快慢以及耐高溫程度。但關于 miR156-SPLs處于怎樣的調控網絡，miR156的表達受哪些上游基因的時序調控，及SPLs的下游調控基因是什么等問題都有待更多研究去揭示。

[1]Klein J, Saedler H, Huijser P. A new family of DNA binding proteins includes putative transcriptional regulators of the Antirrhinum majus floral meristem identity gene SQUAMOSA [J]. Mol Gen Genet, 1996, 250(1): 7-16.

[2]Yu S, Galvao V C, Zhang Y C, et al. Gibberellin regulates theArabidopsisfloral transition through miR156-targeted SQUAMOSA promoter binding-like transcription factors [J].Plant Cell, 2012, 24(8): 3320-3332.

[3]Wu G, Poethig R S. Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis thaliana by miR156 and its target SPL3 [J]. Development, 2006, 133(18): 3539-3547.

[4]Wang J W, Czech B, Weigel D. miR156-Regulated SPL transcription factors define an endogenous flowering pathway inArabidopsis thaliana[J]. Cell, 2009, 138(4):738-749.

[5]Schwarz S, Grande A V, Bujdoso N, et al. The microRNA regulated SBP-box genesSPL9andSPL15control shoot maturation inArabidopsis[J]. Plant Molecular Biology,2008, 67(1/2): 183-195.

[6]Jung J H, Seo P J, Kang S K, et al. miR172 signals are incorporated into the miR156 signaling pathway at theSPL3/4/5genes inArabidopsisdevelopmental transitions [J].Plant Molecular Biology, 2011, 76(1/2): 35-45.

[7]Eriksson M, Moseley J L, Tottey S, et al. Genetic dissection of nutritional copper signaling in chlamydomonas distinguishes regulatory and target genes [J]. Genetics, 2004,168(2): 795-807.

[8]Yang Z, Wang X, Gu S, et al. Comparative study of SBP-box gene family in Arabidopsis and rice [J]. Gene, 2008,407(1/2): 1-11.

[9]Rhoades M W, Reinhart B J, Lim L P. Prediction of plant microrna targets [J]. Cell, 2002, 110(4): 513-520.

[10]Gandikota M, Birkenbihl R P, H?hmann S, et al. The miRNA156/157 recognition element in the 3' UTR of theArabidopsisSBP box gene SPL3 prevents early flowering by translational inhibition in seedlings [J]. Plant Journal for Cell amp; Molecular Biology, 2007, 49(4): 683-693.

[11]Zhang Y, Schwarz S, Saedler H, et al. SPL8, a local regulator in a subset of gibberellin-mediated developmental processes inArabidopsis[J]. Plant Molecular Biology, 2007, 63(3):429-439.

[12]Wang J W, Schwab R, Czech B, et al. Dual effects of miR156-targeted SPL genes and CYP78A5/KLUH on plastochron length and organ size inArabidopsisthaliana[J].Plant Cell, 2008, 20(5): 1231-1243.

[13]Shikata M, Koyama T, Mitsuda N, et al.ArabidopsisSBP-box genes SPL10, SPL11 and SPL2 control morphological change in association with shoot maturation in the reproductive phase [J]. Plant amp; Cell Physiology, 2009,50(12): 2133-2145.

[14]Cui L, Shan J, Shi M, et al. The miR156-SPL9-DFR pathway coordinates the relationship between development and abiotic stress tolerance in plants [J]. Plant Journal for Cell amp;Molecular Biology, 2014, 80(6): 1108-1117.

[15]Stief A, Altmann S, Hoffmann K, et al.ArabidopsismiR156 regulates tolerance to recurring environmental stress through spl transcription factors [J]. The Plant Cell, 2014, 26(4):1792-1807.

[16]Arshad M, Feyissa B A, Amyot L, et al. MicroRNA156 improves drought stress tolerance in alfalfa (Medicago sativa) by silencing SPL13 [J]. Plant Science, 2017,258:122-136.

[17]Wang M, Wang Q, Zhang B. Response of miRNAs and their targets to salt and drought stresses in cotton (Gossypium hirsutumL.) [J]. Gene, 2013, 530(1): 26-32.

[18]Lei K J, Lin Y M, An G Y. miR156 modulates rhizosphere acidification in response to phosphate limitation inArabidopsis[J]. Journal of Plant Research, 2016, 129(2):275-284.

[19]宋長年, 錢劍林, 房經貴, 等. 枳 SPL9和 SPL13全長cDNA克隆、亞細胞定位和表達分析[J]. 中國農業科學,2010, 43(10): 2105-2114.

[20]Miura K, Ikeda M, Matsubara A, et al. OsSPL14 promotes panicle branching and higher grain productivity in rice [J].Nature Genetics, 2010, 42(6): 545-549.

[21]Li M, Zhao S Z, Zhao C Z, et al. Cloning and characterization of SPL-family genes in the peanut (Arachis hypogaeaL.) [J]. Genetics and Molecular Research, 2015,14(1): 2331-2340.

[22]Zhang X, Dou L, Pang C, et al. Genomic organization,differential expression, and functional analysis of the SPL gene family inGossypium hirsutum[J]. Molecular Genetics and Genomics, 2015, 290(1): 115-126.

[23]趙曉初, 李賀, 代紅艷, 等. 草莓 miR156靶基因 SPL9的克隆與表達分析[J]. 中國農業科學, 2011, 44(12):2515-2522.

[24]李磊. 不同肥料處理對茶樹生長和茶葉品質的影響[D].泰安: 山東農業大學, 2010.

[25]Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood,evolutionary distance, and maximum parsimony methods [J].Molecular Biology and Evolution, 2011, 28(10): 2731-2739.

[26]Erika V G. Stem-Loop qRT-PCR for the detection of plant microRNAs [M]. Totowa N J: Humana Press, 2016.

[27]謝小芳. 茶樹 miRNA靶基因的鑒定及在低溫脅迫下的表達分析[D]. 合肥：安徽農業大學, 2016.

[28]張永福, 任禛, 莫麗玲, 等. 葡萄品種生長勢差異的相關機制研究[J]. 北方園藝, 2015 (2): 1-5.

[29]楊雨華, 宗建偉, 楊風嶺. 不同生長勢馬尾松光合日變化研究[J]. 中南林業科技大學學報（自然科學版）, 2014, (8):25-29.

[30]Yamasaki K, Kigawa T, Inoue M, et al. A novel zinc-binding motif revealed by solution structures of DNA-binding domains of Arabidopsis SBP-family transcription factors [J].Journal of Molecular Biology, 2004, 337(1): 49-63.

[31]Birkenbihl R P, Jach G, Saedler H, et al. Functional dissection of the plant-specific sbp-domain: overlap of the dna-binding and nuclear localization domains [J]. Journal of Molecular Biology, 2005, 352(3): 585-596.

[32]Yang L, Conway S R, Poethig R S. Vegetative phase change is mediated by a leaf-derived signal that represses the transcription of miR156 [J]. Development, 2011, 138(2):245-249.

[33]Yoshikawa T, Ozawa S, Sentoku N, et al. Change of shoot architecture during juvenile-to-adult phase transition in soybean [J]. Planta, 2013, 238(1): 229-237.

[34]Gou J Y, Felippes F F, Liu C J, et al. Negative regulation of anthocyanin biosynthesis inArabidopsisby a miR156-targeted SPL transcription factor [J]. Plant Cell,2011, 23(4): 1512-1522.

[35]Salinas M, Xing S, H?hmann S, et al. Genomic organization,phylogenetic comparison and differential expression of the SBP-box family of transcription factors in tomato[J]. Planta,2012, 235(6): 1171-1184.

[36]馮圣軍. MicroRNA156調控煙草發育階段轉變的功能研究[D]. 臨安: 浙江農林大學, 2014.

[37]虞莎, 王佳偉. miR156介導的高等植物年齡途徑研究進展[J]. 中國科學, 2014, 59(15): 1398-1404.

[38]Xin M M, Wang Y, Yao Y Y, et al. Diverse set of microRNAs are responsive to powdery mildew infection and heat stress in wheat [J]. BMC Plant Biology, 2010, 10: 123-133.

[39]Yu X, Wang H, Lu Y Z, et al. Identification of conserved and novel microRNAs that are responsive to heat stress in Brassica rapa [J]. Journal of Experimental Botany, 2012,63(2): 1025-1038.

[40]Arshad M, Gruber M Y, Wall K, et al. An insight into microrna156 role in salinity stress responses of alfalfa [J].Frontiers in Plant Science, 2017, 8(658):356-370.

[41]Yu Z X, Wang L J, Zhao B, et al. Progressive regulation of sesquiterpene biosynthesis inArabidopsisand patchouli(Pogostemon cablin) by the miR156-Targeted SPL transcription factors [J]. Molecular Plant, 2014, 8(1): 98-110.

Cloning and Expression Analysis of miR156a-targeted Genes SPL 6 and SPL9 in Camellia sinensis

LIU Yaqin1, TIAN Kunhong1, SUN Qilu1, PAN Cheng1,LI Yeyun1, JIANG Jiayue1, JIANG Changjun1,2*

1. State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China;2. Henan Key Laboratory of Tea Biology, Xinyang Normal University, Xinyang 464000, China

MicroRNA156a-SQUAMOSA promoter binding-like protein（miR156a-SPLs）play important roles in growth process, formation of leaves and response to stress in tea plant (Camellia sinensis). Based on transcriptome data, two cDNACsSPL6(2 318 bp) andCsSPL9(1 954 bp) were cloned from tea plant. The nucleotide and amino acid sequences, biological information, phylogenetic tree and molecular expression models of theCsSPL6andCsSPL9were analyzed. Sequence analysis showed that the open reading frames ofCsSPL6andCsSPL9are 1 668 bp and 1 116 bp, encoding 555 and 371 amino acids respectively. Both genes contain typical SBP domain and the recognition sites of microRNA156a. Quantitative real-time PCR analysis showed that the expression profile of Csn-miR156a was the highest in the buds, and the lowest in the 7th leaves, which was negatively correlated withCsSPL6andCsSPL9. For different varieties(strains), the expression of Csn-miR156a was consistent with the growth of new shoots and the value of Photosynthesis index, but negatively correlated with the expression ofCsSPL6 and CsSPL9,indicating. Csn-miR156a,CsSPL6andCsSPL9were involved in the growth of tea plant and can be used as markers to assess growth abilities among varieties. In addition, the expression ofCsSPL9was negatively correlatedwith Csn-miR156a under heat stress in four varieties (strains), which might be associated with the enhanced heat tolerance ability. The results showed that the expression ofCsSPLswere negatively regulated by Csn-miR156a,which played an important role in the growth, development of tea plant and the stress resistance,providing a theoretical basis for understanding the growth and resistance mechanism of tea plant.

Camellia sinensis, growth potential, high temperature, miR156a, SPL

TS272.2；Q52

A

1000-369X(2017)06-551-14

2017-07-04

2017-08-05

茶樹響應低溫脅迫的microRNA發掘及其調控機制研究（31270729）、國家自然科學基金（31270729）

劉亞芹，女，碩士研究生，主要從事茶樹種質資源與育種。*通訊作者：jiangcj@ahau.edu.cn