microRNA-21在非小細胞肺癌患者體內外周血和癌組織中的表達水平及其通過調節PTEN蛋白參與抑癌的機制

張軒斌 彭 飛

(南陽市中心醫院呼吸內科二病區,河南 南陽 473000)

microRNA-21在非小細胞肺癌患者體內外周血和癌組織中的表達水平及其通過調節PTEN蛋白參與抑癌的機制

張軒斌 彭 飛

(南陽市中心醫院呼吸內科二病區,河南 南陽 473000)

目的探討非小細胞肺癌(NSCLC)患者外周血清和癌組織中microRNA-21表達水平及其對肺癌細胞的侵襲和增殖影響。方法32例NSCLC患者為研究組，30例同期肺部良性病變患者為對照組，采用Real-time RCR檢測研究組腫瘤組織、癌旁組織及兩組血清中microRNA-21的表達水平；此外，對肺癌細胞株A549轉染microRNA-21的抑制物(inhibitor)或模擬物(mimics)后，采用transwell及CCK-8法觀察microRNA-21對肺癌細胞株的侵襲及增殖的變化，并采用Western印跡檢測A549中張力蛋白同源基因(PTEN)蛋白水平。結果研究組血清及腫瘤組織中microRNA-21的表達水平顯著高于對照組及癌旁組織(均Plt;0.05)；A549轉染microRNA-21 mimics后細胞的侵襲和增殖能力顯著增加(Plt;0.05)，轉染microRNA-21 inhibitor后，細胞的侵襲和增殖能力顯著降低(Plt;0.05)，而PTEN蛋白轉染后，表達水平與上述結果相反。結論NSCLC患者腫瘤組織和血清中高表達的microRNA-21可能通過抑制PTEN蛋白參與癌細胞侵襲和增殖能力的調節。

microRNA-21；非小細胞肺癌(NSCLC)；增殖；侵襲；張力蛋白同源基因(PTEN)

microRNA(miRNA)的異常表達在多種疾病，尤其是腫瘤的發病、診斷和預后中均發揮重要的作用〔1，2〕。microRNA-21能促進膠質母細胞瘤的細胞存活和侵襲，在卵巢癌患者血清中表達增加，并且與腫瘤的分級顯著相關，抑制腫瘤的生存〔3〕。研究發現，在卵巢癌上皮細胞中，microRNA-21通過調節張力蛋白同源基因(PTEN)的表達參與調節腫瘤細胞的生長和侵襲〔4〕。肺癌是目前世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，致死率高、預后差，其中，約4/5為非小細胞肺癌(NSCLC)〔5〕。miRNA-21的編碼基因定位于17q23.2，即液泡膜蛋白基因(VMP1)的第十內含子，且在子宮頸癌、胰腺癌、前列腺癌及大腸癌等標本組織中都檢測出miRNA-21表達水平異常升高，提示其可作為一個致癌性小RNA〔6〕。本文研究miRNA-21在NSCLC患者體內的表達情況及其對病情發生發展的影響。

1 材料與方法

1.1臨床資料 選擇2012年1月至2014年12月在南陽市中心醫院進行根治性切除術的NSCLC患者32例為研究組，手術標本經細胞學及病理學確診，未發現腫瘤遠處轉移，剔除術前經介入或放、化療治療者，合并其他慢性病如高血壓、糖尿病或其他腫瘤等患者。男18例，女14例，年齡31～76〔平均(41.5±9.2)〕歲。對照組為同期治療肺部良性病變患者30例。其中男17例，女13例，年齡31～75〔平均(48.1±11.3)〕歲。其中結核5例，炎性假瘤13例，肺囊腫12例。兩組性別、年齡差異無統計學意義(Pgt;0.05)，具有可比性。留取兩組外周血3 ml，靜置5～6 h后，離心取上清；術中取研究組肺癌組織及對應癌旁組織，-80℃凍存待測。

1.2細胞培養 人肺癌細胞A549(美國ATCC公司)，生長于DMEM培養基中〔含10%胎牛血清(FBS)，10×104U/L青霉素，100 mg/L鏈霉素〕，置于37℃、5%CO2培養箱中孵育培養。

1.3細胞轉染 采用脂質體LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)，按照LipofectamineTM2000產品說明書操作，將microRNA-21 inhibitor或mimics(上海吉瑪公司)轉染至A549細胞中，以磷酸鹽緩沖液(PBS)為空白對照，microRNA-21-NC作為陰性對照，轉染48 h后，檢測轉染效率。

1.4Real-time PCR檢測血清或組織中miRNA-21表達水平 取各組外周血清、腫瘤組織、癌旁組織及轉染miRNA-21抑制物(inhibitor)或模型物(mimics)的A549細胞，加入1 ml Trizol(美國Gibco公司)抽提RNA，并依照Real-time PCR試劑盒(美國ROCHE公司)產品說明書，檢測miRNA 21的表達水平(以U6作為內參)。定量PCR擴增儀(7900，美國ABI公司)檢測miRNA-21表達水平，采用2-ΔΔCt方法表示microRNA-21的相對表達量。引物：miRNA-21，正義：5′-ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGA-3′，反義：5′-GTGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3′。

1.5Western印跡檢測A549細胞中PTEN蛋白表達水平 收集轉染48 h后的肺癌A549細胞，加入RIPA蛋白裂解液(上海碧云天生物技術有限公司)，抽提細胞全蛋白；二喹啉甲酸(BCA)法測定細胞總蛋白濃度，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白后，濕轉法將蛋白轉到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉室溫震蕩封閉1 h，Tris鹽酸緩沖液(TBS-T)洗滌后，分別加入1∶2 000 抗PTEN抗體，1∶100抗β-actin抗體(均購自美國abcam公司)，4℃孵育過夜，TBS-T洗滌，10 min/次，洗滌3次，加入1：2000辣根過氧化物酶(HRP)的羊抗兔二抗(美國SantaCruz公司)，室溫孵育1 h后，TBS-T 洗滌，10 min/次，洗滌3次，化學發光并曝光成像，觀察PTEN蛋白表達變化。

1.6細胞遷移實驗 取轉染后人肺癌A549細胞5×104個，接種至transwell小室上層(24孔板懸掛式，美國Millipore公司)，小室下層加入800 μl的含有10% FBS的DMEM培養液。24 h后，去除24孔板下室中的培養液，棉簽擦去Transwell小室內室膜上的細胞，0.1%結晶紫溶液染色，室溫5 min，顯微鏡(日本Olympus公司)下觀察并進行細胞計數(隨機選取3個視野)。

1.7細胞增殖實驗 取對數生長期A549細胞接種至96孔板中，每孔0.8×104個細胞，每組設置4個平行復孔，以不含細胞的空白培養基作為陰性對照，24、48、72 h后，每孔加入10 μl八肽膽囊收縮素(CCK-8)試劑(美國sigma)后，培養箱中孵育4 h，酶標儀(Elx800，美國BioTek公司)檢測450 nm處的吸光度值(OD)。

1.8統計學方法 應用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1兩組外周血血清中miRNA-21表達水平比較 與對照組(1.08±0.33)比較，研究組(5.22±12.49)血清miRNA-21的表達水平顯著增加(t=9.028，P=0.000)；miRNA-21在肺癌患者腫瘤組織中表達水平(11.03±4.12)顯著高于癌旁組織(1.13±0.32；t=13.118，P=0.000)

2.2肺癌細胞中miRNA-21對細胞增殖的影響 A549轉染miRNA-21 mimics后，miRNA-21水平(2.28±0.16)及癌細胞的OD值顯著高于對照組(0.98±0.04)和空白組(1.06±0.07)(Plt;0.05)；而A549肺癌細胞轉染miRNA-21 inhibitor后，miRNA-21表達水平(0.28±0.17)及癌細胞的OD值明顯低于對照組和空白組(Plt;0.05)。見圖1。

2.3肺癌細胞中miRNA-21對細胞侵襲的影響 同對照組、空白組5個視野的細胞數(33.20±2.70，32.70±3.64)相比，A549肺癌細胞轉染miRNA-21 mimics后，癌細胞的侵襲能力(56.53±2.32)顯著增加(Plt;0.05)；而A549肺癌細胞轉染mi-croRNA-21 inhibitor，癌細胞的侵襲能力(19.60±2.17)顯著降低(Plt;0.05)。見圖2。

圖1 各組A549細胞中miR-21 mRNA增殖水平(×400)

2.4肺癌細胞高低表達miRNA-21后PTEN蛋白表達水平比較 與對照組(1.04±0.15)相比，轉染miRNA-21 mimics細胞中PTEN蛋白表達水平(0.24±0.02)顯著降低(Plt;0.05)；轉染microRNA-21 inhibitor細胞中PTEN蛋白表達水平(2.25±0.31)顯著增加(Plt;0.05)。空白組為1.01±0.19。見圖3。

圖2 各組A549細胞侵襲能力(×400)

圖3 各組A549細胞中PTEN蛋白表達水平

3 討 論

研究發現，肺癌的發病率及死亡率占所有類型惡性腫瘤的20%～25%〔7〕。肺癌中往往以NSCLC最為多見，占肺癌發病人群的4/5左右〔9〕。研究認為，NSCLC從發生、發展到最終的死亡是一個復雜的生物學過程，涉及眾多因素參與其中〔8〕。miRNA-21具有高度的組織特異性、時序性和保守性〔9〕。當miRNA-21異常表達時，與多種腫瘤的發病及預后關系密切，是重要的腫瘤“癌基因”調節因子，對腫瘤的診斷及預后具有重要作用〔10〕。本研究結果提示miRNA-21的異常表達與NSCLC的發生有關。研究發現在前列腺癌細胞中的miRNA-21表達水平增加，并認為miRNA-21是重要的腫瘤抑制分子〔11〕。 腫瘤細胞的侵襲和增殖能力影響腫瘤的發展和轉歸〔12，13〕。本研究結果表明，肺癌患者體內異常表達的miRNA-21可能直接影響肺癌細胞的增殖和侵襲能力。Yang等〔14〕在膠質瘤患者體內及膠質瘤細胞系中發現miRNA-21均高表達，且miRNA-21表達水平與患者的生存密切相關。PTEN基因也被稱為TEP1〔15〕。該基因由9個外顯子組成，編碼由403個氨基酸組成的蛋白質，具有磷酸酯酶的活性功能。研究表明，PTEN蛋白可通過拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性參與腫瘤的發生發展的抑制〔16〕。研究發現，在肝癌細胞中高表達的miRNA-21能夠直接通過靶向PTEN基因增加腫瘤細胞的增殖和侵襲〔17〕。本研究結果提示miRNA-21可通過靶向調節PTEN蛋白的表達參與肺癌細胞的增殖和侵襲過程，其可能作為NSCLC新靶點的診斷和治療的潛在分子。

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〔2017-05-27修回〕

(編輯 滕欣航)

R735.2

A

1005-9202(2017)22-5571-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.037

張軒斌(1981-)，男，碩士，主治醫師，主要從事肺癌及呼吸重癥相關研究。