漢防己甲素對膠質瘤細胞的抑制作用

鄂 震 高國棟

(第四軍醫大學唐都醫院神經外科，陜西 西安 710000)

漢防己甲素對膠質瘤細胞的抑制作用

鄂 震 高國棟

(第四軍醫大學唐都醫院神經外科，陜西 西安 710000)

目的探討漢防己甲素(Tet)對膠質瘤的作用及其機制。方法MTT實驗與接種腫瘤雞胚絨毛尿囊膜(CAM)實驗檢測Tet對U87人膠質瘤細胞增殖的影響；流式分析漢防己甲素對U87人膠質瘤細胞凋亡、周期的影響；蘇木素-伊紅(HE)染色分析漢防己甲素對血管新生的影響；免疫組織化學實驗檢測Tet對增殖細胞核抗原(PCNA)與信號傳導及轉錄激活因子(p-STAT3)分布表達影響；Western印跡實驗分析Tet對U87人膠質瘤細胞STAT3蛋白及與凋亡相關蛋白表達的影響。結果增殖細胞核抗原能夠抑制U87人膠質瘤細胞增殖，呈時間、劑量依賴性；Tet能夠誘導U87細胞凋亡呈劑量依賴性；Tet抑制血管新生；Western印跡結果表明Tet降低STAT3磷酸化，STAT3下游基因包括Bcl-2,CyclinD1,HIF-α和VEGFA在Tet處理之后表達減少；PARP、caspase-3、酶切caspase-9蛋白表達增加，促凋亡蛋白Bax表達上調。結論Tet抑制膠質瘤細胞增殖，誘導膠質瘤細胞凋亡，抑制血管新生可能與降低STAT3磷酸化有關。

漢防己甲素；膠質瘤;STAT3

膠質瘤是常見的腦部腫瘤〔1〕。外殼手術是治療膠質瘤的第一選擇。但不能完全切除膠質瘤；常見的化學治療包括卡莫司汀和替莫唑胺等。由于腫瘤耐藥性及反復發作化學治療僅能夠將存活時間提高到14個月〔2〕。漢防己甲素(Tet)是從防己(Moore)根部提取的雙芐基異喹啉類生物堿。Tet通過活性氧(ROS)調控的線粒體通路誘導腫瘤細胞凋亡，促進線粒體色素C釋放，切割PARP并且減少Bcl-XL水平〔3〕。信號轉導及轉錄激活(STAT)3作為一種轉錄因子而被發現，被細胞因子和生長因子激活〔4〕。有些抗腫瘤藥物例如隱丹參酮和5-氟尿嘧啶等通過使STAT3失活抑制腫瘤生長〔5〕。本文探究Tet是否能夠通過STAT3信號通路抑制膠質瘤。

1 材料與方法

1.1主要試劑 Tet購自Sigma-Aldrich公司。U87細胞購自中國科學院。DMEM培養基購自Gibco Life Technologies公司。PARP、caspase-3、酶切caspase-9、caspase-8、 Bax、Bcl-2、增殖細胞核抗原(PCNA)、CyclinD1、信號傳導及轉錄激活因子(STAT3)、phospho-STAT3和HIF-α抗體購自Cell Signalling Technology公司，GAPDH購自Santa公司。

1.2細胞和胚胎培養 U87人膠質瘤細胞(中國科學院)在含有10%胎牛血清及100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素(Invitrogen，美國)DMEM(Gibco Life Technologies,Paisley,Scotland,UK)培養基中培養。培養條件為5% CO2及37℃人為環境中。雞胚孵育在人工孵育器中。

1.3噻唑蘭(MTT)實驗 將細胞接種于96孔板中，細胞密度3×103個，并且設置4個副孔。接種24 h后，分兩組處理。第一組用不同濃度Tet(0、3.2、7.5、15、30和60 μg/ml)或白細胞介素(IL)-6處理U-87細胞48 h。第二組用15 μg/ml Tet處理U-87MG細胞24、48、72 h。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞，每孔U-87細胞中加入20 μl的5 mg/ml MTT試劑，放在細胞培養箱中培養4 h。丟棄MTT溶液，加入200 μl二甲基亞砜(DMSO)溶液，然后在搖床上搖蕩10 min，用酶聯免疫檢測儀在570 nm處檢測吸光度值。

1.4膠質瘤模型建立 在雞胚形成第9天，將雞胚隨機分組，且將小塑料環放在雞胚絨毛尿囊膜(CAM)。將細胞重懸于DMEM培養基，分別用不同濃度Tet(0、4、8 mg/ml)處理細胞，之后注射到CAM上的環。然后用透明膠帶包住受精卵。每天在體式顯微鏡下觀察。胚胎形成14 d，用4%多聚甲醛固定，拍照。在低溫下處死雞胚。腫瘤體積(V)=4/3πr3。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色和免疫組織化學 根據標準流程進行HE染色。對于免疫組化染色，先將石蠟包被的切片在65℃放置1～1.5 h，二甲苯中脫蠟，然后在不同濃度的乙醇脫水。過氧化氫孵育10 min。枸櫞酸鈉緩沖液(10 mmol/L，pH6.0)，淹沒切片，蓋上鍋蓋，高壓鍋內煮沸，上汽3 min后緩慢冷卻(可用自來水在高壓鍋外沖，以助冷卻)。正常血清封閉60 min。用濾紙吸去血清，不洗，直接滴加第一抗體，包括PCNA和p-STAT3，置于4℃冰箱過夜。PBS洗5 min，2次。滴加生物素化的二抗，37℃，40 min。PBS洗5 min，2次。滴加鏈霉親合素生物素抗體復合物(SABC)復合物，37℃，40 min。PBS洗5 min，2次。二氨基聯苯胺(DAB)顯色，鏡下觀察，適時終止(自來水沖終止)。

1.6Western印跡實驗 將U87細胞中培養基棄掉，用PBS洗兩次。每個小皿加入80 μl裂解液，在冰上裂解20 min。刮蛋白，4℃,13 000 r/min離心13 min，收集總蛋白裂解液。二喹啉甲酸(BCA)工作液根據牛血清白蛋白(BSA，0.5 mg/ml)制備標準曲線，檢測不同處理細胞蛋白濃度，制備上樣蛋白。等量蛋白總量在8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠中分離。之后電轉到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。PVDF膜用5%脫脂牛奶在室溫封閉1 h，PBS洗3次，每次5 min。孵育PARP,caspase-3、酶切caspase-9、caspase-8、Bax、Bcl-2、PCNA、CyclinD1、STAT3,p-STAT3(Tyr705)、HIF-α、VEGFA和GAPDH，放在4℃，過夜。PBS洗3次，每次5 min。孵育相應的二抗。PBS洗3次，每次10 min。在膜上均勻撒化學增濕發光法(ECL)發光液在化學發光成像系統中顯影。

1.7CAM血管新生實驗 在雞胚形成第9天，將塑料環放置在CAM上，隨機分組。60 μl的(0、4、8 mg/ml)Tet滴在塑料環中央，每天滴加。在第12天，CAM樣品在4%多聚甲醛固定30 min。低溫處死雞胚之后，在體式顯微鏡下觀察。

1.8凋亡檢測 Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒根據生產商使用說明檢測細胞凋亡，然后用流式分析。U87細胞接種于六孔板中，接種密度為0.5×105個，分為兩組，一組為對照組，不同濃度Tet處理細胞24 h。之后PBS洗滌細胞，胰蛋白酶消化細胞，4℃,1 000 r/min離心5 min。細胞重懸于200 μl PBS中。再次離心，重懸于500 μl 1×Annexin結合緩沖液。然后將100 μl細胞與5 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶在室溫下孵育15 min。之后用FACScan流式分析儀分析細胞凋亡情況。

1.9統計學方法 應用SPSS20.0軟件進行單因素方差，GraphPad Prism5.0進行統計作圖。

2 結 果

2.1Tet抑制膠質瘤生長 MTT實驗表明Tet能夠抑制U87細胞增殖，與對照組(0 μg/ml組)相比〔(93.4±2.5)%〕，不同濃度Tet組的細胞存活率顯著降低〔3.2、7.5、30.0、60.0 μg/ml Tet組存活率分別為(87.6±2.1)%、(76.5±4.3)%，(56.7±2.2)%，(43.7±1.8)%，(38.9±1.4)%，Plt;0.05〕，且對U87細胞抑制作用呈時間、劑量依賴性。15 μg/ml Tet處理24、48、72 h，U87細胞存活率分別為(73.6±2.6)%、(58.4±2.4)%，(38.7±1.8)%。不同濃度Tet注射CAM之后第1天，三組腫瘤大小沒有明顯差異；處理之后第3和第5天，對照組(0 μg/ml組)腫瘤明顯大于處理組；4 mg/ml Tet處理CAM 5 d后，腫瘤體積為(305.5±63.2)mm3，8 mg/ml Tet處理CAM 5 d后為(131.81±40.4)mm3，對照組(0 mg/ml組)為(2 323.31±131.5)mm3，Tet處理之后腫瘤體積顯著低于對照組(Plt;0.01)。見圖1。

2.2Tet誘導U87膠質瘤細胞凋亡 Tet能夠誘導U87細胞凋亡，并且呈梯度依賴性〔0.3、3.25、7.5、15.0、30.0、60.0 μg/ml Tet組凋亡率分別為(4.5±0.8)%、(12.4±1.2)%、(20.7±1.3)%、(35.4±1.2)%、(55.2±1.4)%、(72.5±1.2)%〕(Plt;0.01)。30 μg/ml Tet處理U87細胞24 h后，細胞凋亡率達到52.75%。Tet處理后U87細胞在G0/G1期分布顯著增加，S期顯著減少，見圖2A(Plt;0.01)。Western印跡結果表明不同濃度Tet處理U87細胞24 h后，PARP、caspase-3、酶切caspase-9蛋白表達增加，而caspase-8沒有明顯差異，Bcl-2家族中促凋亡蛋白Bax表達上調，Tet處理之后抑制PCNA表達(圖2B；Plt;0.05)。免疫組織化學結果表明，不同濃度(0、4、8 mg/ml)Tet處理后抑制移植瘤中PCNA表達〔PCNA陽性分別為(88.7±2.7)%；(20.2±2.9)%，(18.7±3.1)%〕(圖2C，Plt;0.01)。

2.3Tet抑制血管新生 圖3A顯示移植瘤周圍脈管系統，8 mg/ml Tet顯著降低血管面積與CAM面積比值(VA/CAM%)〔28.7±1.1)%〕，與對照組(0 mg/ml)〔(40.6±2.3)%〕有統計學差異(Plt;0.05)；4 mg/ml Tet組VA/CAM為(40.9±4.1)%。圖3B顯示8 mg/ml Tet處理后CAM血管新生明顯少于對照組(0 mg/ml)；4 mg/ml Tet組為(22.4±11.7)%，8 mg/ml Tet顯著降低血管新生面積與CAM面積比值(VA/CAM%)〔(19.5±5.7)%〕，與對照組(0 mg/ml)〔(33.8±10.4)%〕有統計學差異(Plt;0.05)；4 mg/ml Tet組(22.4±11.7)%。8 mg/ml Tet處理之后顯著降低微小血管密度〔(0.9±0.2)N/mm2〕與對照組(0 mg/ml)〔(4.5±0.4)N/mm2〕相比差異顯著(Plt;0.05)；4 mg/ml Tet組為(3.5±0.4)N/mm2。見圖3C。

圖1 Tet對U87人膠質瘤細胞增殖影響

與0 μg/ml Tet比較：1)Plt;0.01，2)Plt;0.05圖2 漢防己甲素對U87細胞凋亡影響

2.4Tet對p-STAT3及其下游蛋白表達影響 Western印跡結果表明3.2、15.0、30.0 μg/ml Tet處理U87細胞后STAT3磷酸化(0.76±0.05，0.48±0.03，0.25±0.06)顯著少于對照組(0 mg/ml)(0.91±0.05，Plt;0.05)。STAT3下游基因包括Bcl-2,CyclinD1,HIF-α和VEGFA在Tet處理之后表達減少(Plt;0.05)，見圖4A，4B。在對照組中，p-STAT3在移植膠質瘤中的分布廣泛〔(39.7±3.4)%〕，與此同時，4 mg/ml和8 mg/ml Tet處理移植瘤之后降低p-STAT3表達〔(10.1±1.6)%，(5.1±0.8)%；Plt;0.01〕。見圖4C。

圖3 漢防己甲素對血管生成的影響

A、B：不同濃度Tet(0、3.2、15和30 μg/ml)處理U87細胞之后對p-STAT3，t-STAT3,Bcl-2,CyclinD1,HIF-α和VEGFA蛋白表達影響；C：免疫組織化學染色檢測p-STAT3表達圖4 漢防己甲素對p-STAT3以及下游蛋白表達的影響

3 討 論

雞胚CAM實驗是一種腫瘤移植模型實驗，本研究結果提示，漢防已甲素能夠在體內體外抑制人膠質瘤細胞生長。已有報道表明Tet能夠誘導在人膀胱癌細胞與胸腺癌細胞中線粒體調節的凋亡〔6〕。Tet能夠明顯促進PARP總蛋白、PARP切割、caspase-3、酶切caspase-9和Bax蛋白表達，而不影響caspase-8表達，Tet可能通過線粒體通路誘導細胞凋亡。已有報道表明Tet能夠抑制腫瘤細胞增殖從而發揮抗腫瘤作用〔7〕。但Tet抑制腫瘤細胞增殖是在G0/G1期阻滯細胞還是G2/M期阻滯細胞存在爭議。本文發現Tet抑制神經膠質瘤是通過使細胞阻滯于G0/G1期。在CAM中充足的血液供養膠質瘤移植瘤生長〔8〕。本研究結果說明Tet抑制膠質瘤部分作用是通過抑制血管新生。有報道顯示細胞活性、增殖和血管新生是依賴于p-STAT3表達〔9〕。STAT3在惡性腫瘤中扮演重要角色，例如肝癌、結腸癌和前列腺癌及膠質瘤〔10～13〕。本研究結果表明U87細胞中p-STAT3和它的下游蛋白(Bcl-2,CyclinD1,HIF-α和VEGFA) 在Tet處理之后表達降低，并且呈劑量依賴性。

1Bonnet C,Thomas L,Psimaras D,etal.Characteristics of gliomas in patients with somatic IDH mosaicism〔J〕.Acta Neuropathol Commun,2016;4(1):31.

2程金湘.膠質瘤患者健康相關生命質量研究〔D〕.西安：第四軍醫大學,2013.

3殷華芳，錢曉萍，劉寶瑞.漢防己甲素抗腫瘤機制研究進展〔J〕.現代腫瘤醫學,2011；19(3):582-4.

4Snyder M,Huang J,Huang XY,etal.A signal transducer and activator of transcription 3.Nuclear Factor kappaB(Stat3.NFkappaB)complex is necessary for the expression of fascin in metastatic breast cancer cells in response to interleukin(IL)-6 and tumor necrosis factor(TNF)-alpha〔J〕.J Biol Chem,2014;289(43):30082-9.

5唐煥煥，沈曉燕，段小群，等.隱丹參酮抑制惡性神經膠質瘤細胞C6增殖及對JAK2-STAT3信號通路的影響〔J〕.安徽醫科大學學報,2016；51(6):769-72.

6李永生.漢防己甲素對膀胱腫瘤細胞BIU-87及BIU-87/ADM作用的實驗研究〔D〕.長沙：中南大學,2003.

7顧建華，王 毅，郭仁德.漢防己甲素抗腫瘤作用及其機制研究進展〔J〕.醫學綜述,2012；18(1):53-5.

8Nevo I,Woolard K,Cam M,etal.Identification of molecular pathways facilitating glioma cell invasion in situ〔J〕.PLoS One,2014;9(11):e11178311.

9Yeh JE,Frank DA.STAT3-interacting proteins as modulators of transcription factor function:implications to targeted cancer therapy〔J〕.Chem Med Chem,2016;11(8):795-801.

10Zuo M,Li C,Lin J,etal.LLL12,a novel small inhibitor targeting STAT3 for hepatocellular carcinoma therapy〔J〕.Oncotarget,2015;6(13):10940-9.

11溫玉婷，劉 偉，楊愛軍，等.IL-17和STAT3在結直腸癌組織中的表達及臨床意義〔J〕.第三軍醫大學學報,2011;33(17):1812-5.

12劉 鵬.IGF-IR與STAT3在前列腺癌組織中的表達及其臨床意義〔D〕.蚌埠：蚌埠醫學院,2016.

13Peng T,Zhou L,Zuo L,etal.MiR-506 functions as a tumor suppressor in glioma by targeting STAT3〔J〕.Oncol Rep,2016;35(2):1057-64.

〔2017-04-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

R73

A

1005-9202(2017)22-5568-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.036

高國棟(1954-)，男，博士，主任醫師，主要從事帕金森病、腦膠質瘤研究。

鄂 震(1990-)，男，博士，住院醫師，主要從事腦膠質瘤研究。