白細胞介素-8基因在鼻息肉組織中的表達及對鼻黏膜上皮細胞凋亡的影響

鄭慧媛 馬新春 石 磊 李建民

(青海大學附屬醫院耳鼻喉科，青海 西寧 810001)

白細胞介素-8基因在鼻息肉組織中的表達及對鼻黏膜上皮細胞凋亡的影響

鄭慧媛 馬新春 石 磊 李建民

(青海大學附屬醫院耳鼻喉科，青海 西寧 810001)

目的探討白細胞介素(IL)-8基因在鼻息肉組織中的表達及對鼻黏膜上皮細胞凋亡的影響。方法Western印跡檢測IL-8在鼻息肉組織及下鼻甲組織中的表達；從鼻息肉組織中分離培養人鼻黏膜上皮細胞(HNEC)，將IL-8小干擾RNA(IL-8-siRNA)和陰性對照(siRNA-NC)轉染細胞，以空脂質體轉染的細胞作為對照組，Western印跡檢測轉染效果；各組轉染細胞培養48 h后，流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況，Western印跡檢測酶切caspase3蛋白表達。結果IL-8在鼻息肉組織中的表達顯著高于下鼻甲組織(Plt;0.01)；siRNA-NC組與對照組差異無統計學意義(Pgt;0.05)，IL-8-siRNA組顯著低于對照組(Plt;0.01)；siRNA-NC組細胞凋亡率及酶切caspase3蛋白表達與對照組比較差異無統計學意義(Pgt;0.05)，IL-8-siRNA組均顯著高于對照組(Plt;0.01)。結論IL-8在鼻息肉組織中高表達，沉默IL-8的表達能通過上調酶切caspase3蛋白表達促進HNEC凋亡。

白細胞介素-8基因；鼻息肉；鼻黏膜上皮細胞；凋亡

目前鼻息肉發病原因及機制尚不清楚〔1〕。近年來研究發現多種細胞因子參與了鼻息肉的發生發展〔2〕。白細胞介素(IL)-8是一種多源性細胞因子，在炎癥和腫瘤中可激活血管內皮細胞及白細胞。IL-8的激活可促進血管內皮細胞的增殖、抑制細胞的凋亡〔1〕。IL-8基因在鼻息肉形成中的作用目前研究尚不清楚。本研究旨在探討IL-8在鼻息肉組織中的表達及其對鼻黏膜上皮細胞凋亡的影響及機制。

1 材料與方法

1.1一般材料 收集青海大學附屬醫院2014年6月至2015年7月手術切除后存檔的慢性鼻竇炎鼻息肉組織石蠟包埋標本40例，其中男27例，女13例，年齡20～71歲，中位年齡45.1歲?；颊呔鶠槭状伪窍⑷庹g，且在術前2 w未使用多抗組胺類藥物、糖皮質激素。對照組選擇同時期在我院進行鼻中隔矯正術患者的下鼻甲組織，其中男16例，女12例，年齡21～51歲，中位年齡34.2歲。所有樣品采集均經過患者及家屬的知情同意。試劑和儀器：胰蛋白酶購自美國Sigma；DMEM/F12細胞培養基、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自美國Invitrogen Gibco；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天；IL-8、酶切caspase3單克隆抗體及辣根過氧化物標記的二抗均購于美國 Abcam；細胞凋亡試劑盒購自ACTGene公司；酶標儀購自Thermo Labsystems公司；流式細胞儀購自美國BD；CO2細胞培養箱購自美國SIM公司。

1.2方法

1.2.1IL-8在鼻息肉組織中的表達檢測 將鼻息肉組織及下鼻甲組織放入研缽研磨成粉末后，加入適量的裂解液置于冰上反應30 min，4℃，12 000 r/min離心20 min，收集上清。按照BCA試劑盒操作說明檢測提取的蛋白濃度。充分混勻蛋白樣品與上樣緩沖液，100℃變性5 min，將變性蛋白加入到制好的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠，每孔加入25 μl，電泳結束后取出凝膠，4℃轉膜1.5 h，5%的脫脂奶粉封閉聚偏氟乙烯(PVDF)膜2 h，以IL-8單克隆抗體作為一抗(1∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(1∶1 000稀釋)，37℃孵育2 h。TBST清洗后加入增強化學發光法(ECL)發光劑顯影，自動凝膠成像系統采集圖像。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內參，分析蛋白表達水平。

1.2.2人鼻黏膜上皮細胞(HNEC)的分離培養 取鼻息肉組織，用4℃的PBS多次沖洗后，加入0.25%的胰酶消化16～18 h，制成細胞懸液。錐蟲藍染色法確定細胞的活性后，將細胞懸液稀釋為每升含有108個細胞，置于37℃，5% CO2的培養箱中培養1 h，去除成纖維細胞，轉移細胞至6孔細胞培養板中(已加入蓋玻片)，加入含有5 mg/L轉鐵蛋白、5 mg/L胰島素、10 μg/L霍亂霉素、0.36 mg/L氫化可的松、100 μg/L維生素A酸，20 μg/L三碘甲狀腺氨酸、25 μg/L表皮生長因子、3.75 mg/L內皮細胞生長因子的DMEM/F12培養基，隔天換液1次，進行無血清原代培養4～5 d。細胞融合度達到80%以上進行消化傳代。

1.2.3細胞轉染 取生長至對數期的HNEC，調整細胞濃度為106個/ml，接種于6孔細胞培養板中。每孔加2 ml細胞懸浮液，培養24 h。將對照組(空脂質體轉染組)、siRNA-NC(轉染100 nmol/L的陽性siRNA)、IL-8-siRNA(轉染100 nmol/L的IL-8-siRNA)轉染到細胞內，室溫放置15 min后，取500 μl轉染復合物加入到細胞中，置于37℃，5% CO2的培養箱中培養6 h，更換細胞培養液繼續培養。

1.2.4細胞凋亡檢測 取轉染后的上述3組細胞，以3×104個/ml接種于96孔細胞培養板中，取1 ml細胞懸液轉移至離心管中，4℃，1 000 r/min離心8 min，棄上清，加入提前預冷的PBS 3次洗滌細胞后，在細胞沉淀中加入200 μl緩沖液，加入 PI和 Annexin-V各5 μl，充分混勻后放置避光條件下反應20 min，加400 μl緩沖液，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5Western印跡檢測酶切caspase3蛋白表達 取轉染后培養48 h的1.2.3中的3組細胞，適量的Trizol置于冰上裂解反應30 min后，4℃，12 000 r/min離心15 min，吸取蛋白上清液，BCA試劑盒檢測提取的蛋白濃度。按照1.2.1檢測酶切caspase3蛋白表達。

1.3統計學方法 應用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1IL-8在鼻息肉組織中的表達 IL-8在鼻息肉組織中的表達(0.468±0.035)顯著高于下鼻甲組織(0.162±0.023，Plt;0.01)。見圖1。

2.2IL-8在轉染后細胞中的表達 siRNA-NC組細胞中IL-8蛋白表達(0.606±0.035)與對照組(0.611±0.039)差異無統計學意義(Pgt;0.05)，IL-8-siRNA組(0.224±0.023)顯著低于對照組(Plt;0.01)。見圖2。

2.3IL-8對HNEC凋亡的影響 siRNA-NC組細胞凋亡率〔(2.28±0.92)%〕及酶切caspase3蛋白表達(0.092±0.009)與對照組〔(2.23±0.77)%，0.108±0.010〕比較差異不顯著(Pgt;0.05)，IL-8-siRNA組細胞凋亡率〔(15.12±1.43)%〕及酶切caspase3蛋白表達(0.311±0.029)顯著高于對照組(Plt;0.01)，見圖3。

圖1 IL-8在鼻息肉組織及下鼻甲組織中的表達

圖2 轉染后各組細胞中 IL-8蛋白表達水平

圖3 IL-8對HNEC凋亡的影響

3 討 論

鼻息肉的發病機制目前尚不清楚，手術治療效果雖然有所提高，但病人術后仍有復發。目前研究認為鼻息肉的形成是由多種因素共同參與的慢性炎癥〔2〕。且有研究顯示，多種細胞因子影響了鼻息肉的發生及病理過程〔3〕。IL-8是一種炎性細胞因子，可誘導嗜酸性粒細胞、單核細胞、中性粒細胞遷移到炎癥或感染部位，在損傷、感染患者的血清中可發現IL-8的高表達〔4〕。研究顯示，在鼻息肉勻漿組織中檢測到IL-8的表達水平顯著高于對照組，在慢性鼻竇炎患者的竇黏膜也可檢測IL-8的高表達〔5〕。本研究中也檢測IL-8在鼻息肉組織中的高表達，其結果與前人的研究一致。RNA干擾是由雙鏈DNA引起的一種序列特異性的基因沉默，作為下調基因的工具已被廣泛用于基因功能的研究及疾病的治療〔6〕。本研究結果顯示，沉默IL-8的表達能促進HNEC的凋亡及酶切caspase3蛋白的表達。細胞凋亡是細胞在受到各種刺激因素后所發生的程序性死亡過程，其過程受到多種基因的調控。其中以caspase家族及Bcl-2家族為主。caspase3位于caspase所介導的蛋白酶級聯反應的下游，通常以非活化的酶原形式在細胞質中存在，其激活后可降解多種蛋白質底物，從而誘導細胞的凋亡〔7〕。本研究結果說明沉默IL-8的表達通過上調酶切caspase3蛋白的表達誘導HNEC的凋亡。

1Visciano C，Liotti F，Prevete N，etal.Mast cells induce epithelial-to-mesenchymal transition and stem cell features in human thyroid cancer cells through an IL-8-Akt-Slug pathway〔J〕.Oncogene，2015；34(40)：5175-86.

2王成碩，婁鴻飛，孟一帆，等.組織普酸粒細胞增多對慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉復義的預測價值研究〔J〕.中華耳鼻咽喉頭顱外科雜志，2016；51(4)：268-72.

3Wang LF，Chien CY，Tai CF，etal.Vitamin D decreases the secretion of eotaxin and RANTES in nasal polyp fibroblasts derived from Taiwanese patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps〔J〕.Kaohs J Med Sci，2015；31(2)：63-9.

4Beigelman A，Isaacson-Schmid M，Sajol G，etal.Randomized trial to evaluate azithromycin′s effects on serum and upper airway IL-8 levels and recurrent wheezing in infants with respiratory syncytial virus bronchiolitis〔J〕.J Allergy Clin Immunol，2015；135(5)：1171-8.

5Okano M，Fujiwara T，Kariya S，etal.Regulatory effect of TLR3 signaling on staphylococcal enterotoxin-induced IL-5，IL-13，IL-17A and IFN-γ production in chronic rhinosinusitis with nasal polyps〔J〕.Allergol Int，2016；65(1)：96-102.

6王 婷，高玉珍，沈明志，等.條件性 RNA 干擾技術研究進展〔J〕.現代生物醫學進展，2015；15(3)：547-50.

7林 歡，冷吉燕，于 靜，等.藍莓花色苷對人臍靜脈內皮細胞凋亡調控基因 Bax，Caspase-3 表達的影響〔J〕.中國老年學雜志，2015；35(15)：4157-8.

〔2017-04-15修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

R765.2

A

1005-9202(2017)22-5564-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.034

鄭慧媛(1975-)，女，碩士，主治醫師，主要從事鼻腔鼻竇腫瘤研究。