頭孢曲松鈉對大鼠腦損傷后海馬神經細胞凋亡的影響

李 萍 李月紅 孟伶俐 周洪霞

(唐山工人醫院功能檢驗科，河北 唐山 063000)

頭孢曲松鈉對大鼠腦損傷后海馬神經細胞凋亡的影響

李 萍 李月紅 孟伶俐 周洪霞1

(唐山工人醫院功能檢驗科，河北 唐山 063000)

目的探討頭孢曲松鈉對腦損傷大鼠學習記憶及神經細胞凋亡的影響。方法選用SPF級SD大鼠，隨機分為假手術組、腦損傷組、治療組。采用液壓沖擊法制備腦損傷模型，治療組于致傷前5 d注射頭孢曲松鈉(200 mg/kg)，連續5 d。通過Morris水迷宮檢測大鼠空間學習記憶能力，干濕比重法檢測腦組織含水量，免疫組織化學法及Western印跡法檢測caspase-3和caspase-9蛋白表達水平。結果與腦損傷組比較，治療組明顯增強液壓沖擊性腦損傷的空間學習記憶能力(Plt;0.05)，減輕腦組織含水量(Plt;0.05)，下調凋亡相關蛋白caspase-3 和caspase-9蛋白表達(Plt;0.05)。結論頭孢曲松鈉治療可以通過減輕海馬神經細胞凋亡改善大鼠腦損傷后的學習記憶能力。

腦損傷；頭孢曲松鈉；海馬；凋亡；腦水腫

創傷性腦損傷(TBI)的具體病理機制目前未完全闡明。研究顯示腦損傷后出現神經細胞凋亡可能參與TBI的病理生理過程〔1〕。據報道β-內酰胺類抗生素頭孢曲松鈉具有一定的腦保護作用〔2,3〕，但機制未明，且頭孢曲松鈉對大鼠腦損傷后神經細胞凋亡的影響鮮有文獻報道。本研究建立液壓沖擊腦損傷大鼠模型，觀察頭孢曲松鈉對腦損傷大鼠的空間學習記憶能力及海馬caspase-3 和caspase-9蛋白表達變化的影響。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級雄性SD大鼠72只(體重280～320 g)，河北醫科大學實驗動物中心提供，在標準環境(12 h黑夜/白天，25℃)飼養7 d，大鼠可以自由獲取食物和水。兔抗大鼠的caspase-3、 caspase-9多克隆抗體及小鼠抗大鼠的β-actin單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司。羊抗兔(或鼠)的辣根過氧化物酶(HRP)標記IgG購自美國Southern Biotech公司。SABC免疫組織化學試劑盒及二氨基聯苯胺(DAB)蛋白濃度測定試劑盒購自武漢博士德生物技術有限公司。

1.2TBI模型制備及動物分組 72只健康雄性SD大鼠隨機分為：假手術組，腦損傷組，治療組(n=24)。每組又分為12、24、48及72 h 4個時間點，每時間點6只。模型制備應用腹腔注射2%戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉大鼠，采用Dixon法〔4〕制備液壓沖擊腦損傷模型。大鼠出現弓背、豎毛、前肢屈曲、后肢強直、肌張力增高及心率加快等表現表明液壓沖擊性腦損傷大鼠模型制備成功。假手術組常規麻醉開顱，但不給予液壓沖擊處理。治療組大鼠在手術操作前5 d，給予腹腔注射頭孢曲松鈉(200 mg/kg)，并連續注射5 d。

1.3Morris水迷宮試驗 水迷宮由圓柱形水池和圖像采集處理系統兩部分組成。水池水深25 cm，水溫(25±0.5)℃，將平臺固定于某一象限水面下2 cm。在定位航行試驗中記錄大鼠逃避潛伏期，將大鼠面向池壁分別從4個不同象限入水點放入水池中，記錄大鼠在水池中找到水面下方平臺所需時間。空間探索試驗是在定位航行試驗結束后，去除隱藏在水面下平臺，然后將大鼠放入水池中，選擇任選入水點，記錄大鼠每分鐘穿越平臺所在象限的次數，檢測大鼠對原平臺的記憶能力。

1.4腦組織含水量測定 各組行Morris 水迷宮檢測后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，快速斷頭后剝離腦組織，依據參考文獻〔5〕采用干-濕比重法測定腦組織含水量。

1.5免疫組織化學法檢測 腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，用多聚甲醛進行灌流固定后剝離出腦組織，在預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)中清洗后，置于4%多聚甲醛中固定24～48 h。常規沖水過夜，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。切片機制作石蠟切片(5 μm)，烤片，水化后進行免疫組織化學染色，按免疫組織化學試劑盒說明書操作。兔抗大鼠的caspase-3多克隆抗體的稀釋濃度為1∶50，兔抗大鼠的caspase-9多克隆抗體的稀釋濃度為1∶100。

1.6Western印跡法檢測caspase-3、-9蛋白 低溫充分裂解腦組織，勻漿后離心留取上清液。依據文獻〔6〕蛋白變性后上樣(20 μg)進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，干轉法轉至PVDF膜上，5%牛血清白蛋白(BSA)進行膜封閉2 h。分別滴加兔抗大鼠的caspase-3、caspase-9多克隆抗體，或小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體(1∶500)，4℃孵育過夜。隨后滴加HRP標記IgG室溫孵育2 h。條帶曝光顯色后應用Image J軟件對條帶的灰度值進行分析，β-actin作為內參。

1.7統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.1各組學習記憶能力比較 與假手術組相比，腦損傷組傷后各時間點間逃避潛伏期明顯延長，每分鐘穿越平臺的次數明顯減少(Plt;0.05)，治療組各時間點大鼠與腦損傷組相比，逃避潛伏期明顯縮短，每分鐘穿越平臺的次數也明顯增多(Plt;0.05)，見表1，表2。

2.2各組腦組織含水量比較 大鼠液壓沖擊致傷后腦組織含水量與假手術組相比明顯增加(Plt;0.05)。給予頭孢曲松鈉治療后各時間點腦組織含水量顯著減少(Plt;0.05)，見表3。

2.3各組腦組織caspase-3 和caspase-9蛋白免疫組織化學檢測結果比較 假手術組大鼠海馬組織caspase-3 和caspase-9陽性細胞較少，呈現弱陽性。腦損傷組海馬組織caspase-3 和caspase-9陽性細胞數目明顯增多，呈現強陽性，定位于神經細胞的胞質及胞核中。治療組較腦損傷組caspase-3 和caspase-9 的陽性細胞數減少，免疫反應性減弱，見圖1，圖2。

表1 各組逃避潛伏期比較

與假手術組比較：1)Plt;0.05；與腦損傷組比較：2)Plt;0.05，下表同

表2 各組穿越平臺所在象限次數比較次/min)

表3 各組大鼠腦組織含水量的比較

圖1 各組24 h海馬組織caspase-3免疫組織化學染色結果(DAB,×400)

圖2 各組24 h海馬組織caspase-9免疫組織化學染色結果(DAB,×400)

2.4Western印跡檢測各組caspase-3 和caspase-9蛋白表達 假手術組各時間點caspase-3 和caspase-9蛋白表達量均較低。與假手術組相比，腦損傷后12 h caspase-3 和caspase-9蛋白表達水平開始升高(Plt;0.05)，于24 h達高峰(Plt;0.05)，隨后逐漸降低。治療組腦損傷各時間點caspase-3 和caspase-9的蛋白表達量均較腦損傷組顯著下降(Plt;0.05)，見表4。

表4 各組海馬組織caspase-3、-9蛋白Western印跡檢測結果比較

3 討 論

研究顯示腦損傷后繼發性神經細胞死亡中有10%～50%是神經細胞凋亡引起的〔7〕。與細胞凋亡密切相關的caspases分子包括上游起始caspases(caspase-2、8、9和10等)和下游效應caspases(如caspase-3、6和7等)。其中caspase-3在凋亡程序中處于核心位置，是級聯“瀑布”下游最關鍵的凋亡執行者，被稱為 “死亡蛋白酶”，是細胞凋亡發生的關鍵酶〔8〕。而caspase-9是一種啟動酶，接受并感知上游凋亡信號，并引起下游效應caspases的級聯式活化〔9〕。本實驗結果顯示液壓沖擊性腦損傷后海馬區神經細胞出現明顯凋亡，凋亡相關蛋白caspase-3和caspase-9的蛋白表達量隨著腦損傷病程時間的延長不斷增加。吳思榮等〔10〕發現大鼠腦損傷后廣泛存在神經細胞凋亡，且持續時間可達14 d，擴大了急性腦損傷的治療時間窗，凋亡啟動的時程變化與治療時間窗的選擇密切相關。同時還證實腦損傷中的凋亡除了具有明顯的時序性外，還具有典型的空間分布特征，在腦組織中海馬、齒狀回等區域為凋亡的易損區。這種現象可能與損傷程度和受損部位腦組織的敏感性存在差異有關。

腦損傷中神經細胞變性以壞死和凋亡兩種形式共存，其中凋亡遲發性出現但持續時間較長。在液壓沖擊的當時，機械性外力直接導致神經細胞死亡，而后續的繼發性腦損傷(興奮性氨基酸、自由基、鈣離子超載及炎癥反應等)營造的局部不良微環境通過細胞凋亡誘導神經元的遲發性死亡〔11〕。神經細胞凋亡是液壓腦損傷后遲發性細胞死亡的主要方式，是腦創傷后神經行為學的改變、學習記憶功能障礙的病理基礎，并且與預后密切相關。

β-內酰胺類抗生素頭孢曲松鈉可有效地透過血腦屏障進入腦和脊髓中發揮相應作用〔12〕。頭孢曲松鈉作為第三代頭孢類抗生素，除了具有抗菌作用外還能夠快速發揮神經保護作用〔13,14〕。本文結果顯示，頭孢曲松鈉通過抑制TBT后海馬神經細胞凋亡水平，顯著改善大鼠的空間學習和記憶能力，進而發揮重要的神經保護作用。

1李 明,殷玉華,江基堯,等.急性腦損傷后神經細胞凋亡機制的研究進展〔J〕.實用臨床醫藥雜志,2013;17(7):156-9.

2顏志婷,熊建忠,林小小,等.頭孢曲松鈉對腦缺血再灌注模型大鼠的腦保護作用〔J〕.中國老年學雜志,2014;34(15):4241-2.

3劉 暢,賈玉潔,姜興千,等.頭孢曲松鈉對局灶性腦缺血大鼠腦組織Fas和NF-κB表達的影響〔J〕.中國老年學雜志,2012;32(19):4210-2.

4孫國柱,趙宗茂,張更申.大鼠液壓沖擊傷腦水腫AQP4表達及其與水腫關系〔J〕.中華實驗外科雜志,2009;26(11):1499-500.

5Bao HJ,Wang T,Zhang MY,etal.Poloxamer-188 attenuates TBI-induced blood-brain barrier damage leading to decreased brain edema and reduced cellular death〔J〕.Neurochem Res,2012;37(12):2856-67.

6Yan F,Gao J,Ying C,etal.Neuroprotective effects of resatorvid against traumatic brain injury in rat:involvement of neuronal autophagy and TLR4 signaling pathway〔J〕.Cellular Molec Neurobiol,2016;37(1):1-14.

7Yah IY，Yankner BA.Apoptosis in the nerve system〔J〕.Nature,2000;407(6807):802-9.

8Adamczyk A,Kazmierczak A,Czapski GA,etal.Alpha-synuclein induced cell death in mouse hippocampal (HT22) cells is mediated by nitricoxide-dependent activation of caspase-3〔J〕.FEBS Lett,2010;584(15):3504-8.

9陳廷福,金先慶,楊 坤,等.丙泊酚、神經節苷脂對幼鼠認知和caspase-3表達的影響〔J〕.解放軍醫學雜志,2010;35(7):845-8.

10吳思榮,惠國楨,李向東,等.大鼠創傷性腦損傷后神經細胞凋亡的動態變化及其與caspase-3基因表達的關系〔J〕.中華急診醫學雜志,2009;18(4):361-6.

11馮志仙,楊小鋒,鄭學勝,等.創傷性腦損傷后細胞凋亡及Bcl-2基因治療〔J〕.中華創傷雜志,2007;23(8):561-4.

12Spector R.Ceftriaxone transport through the blood-brain barrier〔J〕.J Infect Dis,1987;156(1):209-11.

13Cui C,Cui Y,Gao J,etal.Neuroprotective effect of ceftriaxone in a rat model of traumatic brain injury〔J〕.Neurol Sci Off J Italian Neurol Soc Italian Soc Clin Neurophysiol,2014;35(5):695-700.

14Feng D,Wang W,Dong Y,etal.Ceftriaxone alleviates early brain injury after subarachnoid hemorrhage by increasing excitatory amino acid transporter 2 expression via the PI3K/Akt/NF-κB signaling pathway〔J〕.Neuroscience,2014;268:21-32.

〔2016-07-19修回〕

(編輯 曹夢園)

R651.1+5

A

1005-9202(2017)22-5555-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.030

唐山市科學技術研究與發展計劃資助項目(12140209A-31)

1 華北理工大學基礎醫學院

周洪霞(1970-)，女，副教授，碩士生導師，主要從事腦損傷基礎研究。

李 萍(1978-)，女，碩士，檢驗師，主要從事腦損傷基礎研究。