皂刺粗黃酮對(duì)小鼠移植U14宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及機(jī)制

張 妍 阮連國(guó) 曾友玲 曾 潔

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院，湖北 武漢 430032)

皂刺粗黃酮對(duì)小鼠移植U14宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及機(jī)制

張 妍 阮連國(guó)1曾友玲 曾 潔

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院，湖北 武漢 430032)

目的觀察皂刺粗黃酮對(duì)小鼠移植U14宮頸癌細(xì)胞的影響，并探討其可能機(jī)制。方法制備皂刺粗黃酮浸膏，建立小鼠宮頸癌模型，將小鼠分為觀察組1(皂刺粗黃酮低劑量)、觀察組2(皂刺粗黃酮中劑量)、觀察組3(皂刺粗黃酮高劑量)、環(huán)磷酰胺組和對(duì)照組(生理鹽水組)，稱(chēng)取小鼠始體重、終體重、瘤重，計(jì)算抑瘤率和生命延長(zhǎng)率，放射免疫法測(cè)定血清白細(xì)胞介素(IL)-2和腫瘤壞死因子(TNF)-α水平；免疫組化SP法測(cè)定腫瘤組織中p53和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá)。結(jié)果觀察組1、觀察組2、觀察組3小鼠的瘤重低于對(duì)照組(Plt;0.05)，但高于環(huán)磷酰胺組(Plt;0.05)；觀察組1、觀察組2、觀察組3小鼠的抑瘤率和生命延長(zhǎng)率低于環(huán)磷酰胺組(Plt;0.05)。觀察組1、觀察組2、觀察組3小鼠的存活天數(shù)高于對(duì)照組(Plt;0.05)，但低于環(huán)磷酰胺組(Plt;0.05)。觀察組1、觀察組2、觀察組3小鼠血清IL-2和TNF-α高于環(huán)磷酰胺組和對(duì)照組(Plt;0.05)。觀察組1、觀察組2、觀察組3小鼠的p53和PCNA表達(dá)低于對(duì)照組(Plt;0.05)，但高于環(huán)磷酰胺組(Plt;0.05)；環(huán)磷酰胺組小鼠的p53和PCNA表達(dá)低于對(duì)照組(Plt;0.05)。結(jié)論皂刺粗黃酮可升高血清IL-2和TNF-α水平、促進(jìn)宮頸癌組織中p53和PCNA表達(dá)，抑制小鼠移植U14宮頸癌的生長(zhǎng)。

皂刺粗黃酮；U14細(xì)胞；宮頸癌

尋找毒副作用小、療效顯著的中藥對(duì)宮頸癌的治療具有重要意義。皂刺是傳統(tǒng)的中藥材，具有殺蟲(chóng)、排毒、消腫等功效，具有抗腫瘤作用〔1，2〕。黃酮類(lèi)化合物毒性比較低，具有抗致癌物質(zhì)致癌以及抑制腫瘤發(fā)生等抗腫瘤作用〔3〕，但不同黃酮類(lèi)化合物的抗腫瘤作用不完全相同。本文提取皂刺粗黃酮治療小鼠移植U14宮頸癌，觀察其對(duì)宮頸癌的影響并探討可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6～8周齡、雌性、昆明小鼠，體重17～23 g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2004-0001。瘤株及主要試劑：宮頸癌U14細(xì)胞株(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)，環(huán)磷酰胺(山西泰盛制藥有限公司)，鼠抗p53(突變型)單克隆抗體及鼠抗增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)單克隆抗體、白細(xì)胞介素(IL)-2和腫瘤壞死因子(TNF-α)放射免疫試劑盒(美國(guó)Sigma公司)等。

1.2制備皂刺粗黃酮浸膏 稱(chēng)取皂刺醇2 kg粉碎，加入95%乙醇提取2次，將2次提取液減壓濃縮得到皂刺醇浸膏。將皂刺醇浸膏懸浮到水中，濾除不溶物得到水溶物，加入石油醚分層，將石油醚溶解物去除，分步萃取4次得到水相，加入乙酸乙酯，再分步萃取4次得到乙酸乙酯相，減壓濃縮得到皂刺粗黃酮浸膏。采用《天然藥物化學(xué)》中黃酮類(lèi)化合物顯色反應(yīng)對(duì)皂刺粗黃酮進(jìn)行顯色定性鑒定。

1.3建立小鼠宮頸癌模型 將U14宮頸癌細(xì)胞株從液氮中取出，水浴融化，離心，棄去上清液，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞率超過(guò)95%時(shí)，將細(xì)胞調(diào)整為1×107個(gè)/ml，取0.3 ml U14細(xì)胞接種到小鼠腹腔內(nèi)，在小鼠體內(nèi)傳代10 d，無(wú)菌條件下取小鼠體內(nèi)U14細(xì)胞，實(shí)體瘤模型取0.2 ml(2×106個(gè)/ml)接種到小鼠右前肢腋下，腹水瘤模型取0.2 ml細(xì)胞注射到腹腔內(nèi)，接種成功率為100.0%。

1.4分組和處理 將70只昆明小鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為觀察組1、觀察組2、觀察組3、環(huán)磷酰胺組和對(duì)照組，每組14只。觀察組1、觀察組2、觀察組3分別給予皂刺粗黃酮70、140、280 mg/kg三種劑量灌胃(0.1 ml/10 g)，給藥容量0.2 ml/10 g；環(huán)磷酰胺組給予環(huán)磷酰胺0.1 ml/10 g腹腔注射；對(duì)照組給予0.2 ml/10 g生理鹽水灌胃；各組小鼠均每天給藥1次，共10 d。停藥后第2天實(shí)體瘤各組按要求取血測(cè)量血清IL-2和TNF水平，然后處死各組小鼠。

1.5血清IL-2和TNF-α水平測(cè)定 將實(shí)體瘤各組小鼠眼球血離心留取血清，采用放射免疫法測(cè)定血清IL-2和TNF-α水平。

1.6測(cè)定實(shí)體瘤抑瘤率及腹水瘤生命延長(zhǎng)率 實(shí)體瘤各組小鼠處死后取瘤塊稱(chēng)重，計(jì)算抑瘤率。腹水瘤各組小鼠自然死亡，觀察各組小鼠存活天數(shù)，計(jì)算小鼠生命延長(zhǎng)率，生命延長(zhǎng)率=(藥物治療組存活天數(shù)-對(duì)照組存活天數(shù))/對(duì)照組存活天數(shù)×100%。

1.7測(cè)定腫瘤組織中p53和PCNA表達(dá) 將實(shí)體瘤小鼠的瘤體進(jìn)行石蠟包埋，免疫組化SP法測(cè)定腫瘤組織中p53和PCNA表達(dá)情況，以細(xì)胞核呈棕黃色顆粒染色為陽(yáng)性，取8個(gè)高倍視野計(jì)算100個(gè)腫瘤細(xì)胞中染色陽(yáng)性細(xì)胞，求平均值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件，多組均數(shù)之間比較采用方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠宮頸癌抑制率比較 5組小鼠始體重和終體重比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)，瘤重和抑瘤率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)，其中觀察組1、觀察組2、觀察組3小鼠的瘤重低于對(duì)照組(Plt;0.05)，但高于環(huán)磷酰胺組(Plt;0.05)；觀察組1、觀察組2、觀察組3小鼠的抑瘤率低于環(huán)磷酰胺組(Plt;0.05)；觀察組1、觀察組2、觀察組3之間瘤重和抑瘤率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠宮頸癌抑制率比較

與環(huán)磷酰胺組比較:1)Plt;0.05;與對(duì)照組比較:2)Plt;0.05；下表同

2.2各組小鼠存活天數(shù)和生命延長(zhǎng)率比較 5組小鼠存活天數(shù)和生命延長(zhǎng)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)，其中觀察組1、觀察組2、觀察組3小鼠的存活天數(shù)高于對(duì)照組(Plt;0.05)，但低于環(huán)磷酰胺組(Plt;0.05)；觀察組1、觀察組2、觀察組3小鼠的生命延長(zhǎng)率低于環(huán)磷酰胺組(Plt;0.05)。見(jiàn)表2。

2.3各組小鼠血清IL-2和TNF-α比較 5組小鼠血清IL-2和TNF-α比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Plt;0.05)，其中觀察組1、觀察組2、觀察組3小鼠血清IL-2和TNF-α高于環(huán)磷酰胺組和對(duì)照組(Plt;0.05)；觀察組1、觀察組2、觀察組3小鼠血清IL-2和TNF-α比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Pgt;0.05)，環(huán)磷酰胺組和對(duì)照組小鼠血清IL-2和TNF-α比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Pgt;0.05)。見(jiàn)表2。

2.4各組小鼠p53和PCNA表達(dá)比較 5組小鼠p53和PCNA表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)，其中觀察組1、觀察組2、觀察組3小鼠的p53和PCNA表達(dá)低于對(duì)照組(Plt;0.05)，但高于環(huán)磷酰胺組(Plt;0.05)；環(huán)磷酰胺組小鼠的p53和PCNA表達(dá)低于對(duì)照組(Plt;0.05)；觀察組1、觀察組2、觀察組3小鼠之間p53和PCNA表達(dá)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Pgt;0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠存活天數(shù)、生命延長(zhǎng)率、IL-2、TNF-α及P53和PCNA表達(dá)比較

3 討 論

黃酮類(lèi)化合物具有抗氧化、抗病毒、抗炎、保肝、降血脂、降膽固醇等作用，在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性、抗病毒等發(fā)面具有顯著活性〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)大豆異黃酮對(duì)前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌等多種癌癥具有抑制作用，能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化，抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖〔5～8〕。紅三葉草異黃酮對(duì)乳腺癌等有抑制作用〔9〕。皂刺粗黃酮對(duì)肺癌等癌癥有抑制作用〔10〕。本文表明皂刺粗黃酮對(duì)宮頸癌具有抑制作用，但其效果沒(méi)有環(huán)磷酰胺顯著。免疫調(diào)節(jié)是中藥抗腫瘤的最普遍的機(jī)制。IL-2對(duì)殺傷細(xì)胞的殺傷能力和T細(xì)胞的增殖分化具有重要作用，在正常機(jī)體免疫具有正向調(diào)節(jié)作用，在瘤體內(nèi)IL-2系統(tǒng)明顯被抑制〔11，12〕。TNF-α是機(jī)體重要的炎癥反應(yīng)和機(jī)體免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，在促進(jìn)創(chuàng)傷組織愈合、抗腫瘤、抗感染等方面具有重要作用，其活性可直接殺傷腫瘤細(xì)胞〔13〕。本研究表明，皂刺粗黃酮有升高小鼠血清IL-2和TNF-α水平的作用。野生型p53為腫瘤抑制基因，p53基因發(fā)生突變時(shí)其蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，使p53蛋白表達(dá)增強(qiáng)，突變型p53的腫瘤抑制活性喪失，在DNA復(fù)制水平調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，是導(dǎo)致腫瘤異常增殖的重要因素〔14，15〕。PCNA存在于細(xì)胞核內(nèi)，和DNA的復(fù)制關(guān)系密切，調(diào)節(jié)細(xì)胞由DNA合成前期向DNA合成期過(guò)度，與腫瘤細(xì)胞的增殖關(guān)系比較密切〔16，17〕。本研究結(jié)果表明，皂刺粗黃酮對(duì)小鼠宮頸癌組織中p53和PCNA表達(dá)有促進(jìn)作用。由此可見(jiàn)，皂刺粗黃酮抑制小鼠移植U14宮頸癌的機(jī)制可能與皂刺粗黃酮升高血清IL-2和TNF水平、促進(jìn)宮頸癌組織中p53和PCNA的表達(dá)有關(guān)。

1王瑩瑩，劉偉杰，杜鋼軍，等.皂角刺抗腫瘤的初步研究〔J〕.河南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2014；33(2)：88-90，103.

2李 崗，仙云霞，王 曉，等.皂角刺化學(xué)成分及其抗腫瘤活性研究〔J〕.中草藥，2015；46(19)：2846-50.

3房 濤，張 靜，吳靖芳，等.金蓮花總黃酮對(duì)人甲狀腺乳頭癌 K1細(xì)胞三葉因子3表達(dá)變化的影響〔J〕.河北醫(yī)藥，2015；37(16)：2405-7.

4張 強(qiáng)，趙新淮，張 濤，等.黃酮醇化合物中B環(huán)結(jié)構(gòu)與其誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的關(guān)系〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2012；32(9)：1865-7.

5Lesinski GB，Reville PK，Mace TA，etal.Consumption of soy isoflavone enriched bread in men with prostate cancer is associated with reduced proinflammatory cytokines and immunosuppressive cells〔J〕.Cancer Prev Res (Phila),2015；8(11)：1036-44.

6Ahn-Jarvis JH，Clinton SK，Grainger EM，etal.Isoflavone pharmacokinetics and metabolism after consumption of a standardized soy and soy-almond bread in men with asymptomatic prostate cancer〔J〕.Cancer Prev Res (Phila)，2015；8(11)：1045-54.

7Takagi A，Kano M，Kaga C.Possibility of breast cancer prevention：use of soy isoflavones and fermented soy beverage produced using probiotics〔J〕.Int J Mol Sci,2015；16(5)：10907-20.

8Kim SH，Kim CW，Jeon SY，etal.Chemopreventive and chemotherapeutic effects of genistein，a soy isoflavone，upon cancer development and progression in preclinical animal models〔J〕.Lab Anim Res,2014；30(4)：143-50.

9Fritz H，Seely D，F(xiàn)lower G，etal.Soy，red clover，and isoflavones and breast cancer：a systematic review〔J〕.PLoS One,2013；8(11)：e81968.

10劉偉杰，杜鋼軍，李佳桓，等.皂角刺總黃酮對(duì)肺癌的防治作用及其機(jī)制研究〔J〕.中草藥，2013；44(20)：2878-83.

11Rosenberg SA.IL-2：the first effective immunotherapy for human cancer〔J〕.J Immunol,2014；192(12)：5451-8.

12Amin A，White RL Jr.High-dose interleukin-2：is it still indicated for melanoma and RCC in an era of targeted therapies 〔J〕?Oncology (Williston Park),2013；27(7)：680-91.

13Lebrec H，Ponce R，Preston BD，etal.Tumor necrosis factor，tumor necrosis factor inhibition，and cancer risk〔J〕.Curr Med Res Opin，2015；31(3)：557-74.

14Ji L，Xu J，Liu J，etal.Mutant p53 promotes tumor cell malignancy by both positive and negative regulation of the transforming growth factor β (TGF-β) pathway〔J〕.J Biol Chem，2015；290(18)：11729-40.

15Wang H，Bao W，Jiang F，etal.Mutant p53 (p53-R248Q) functions as an oncogene in promoting endometrial cancer by up-regulating REGγ〔J〕.Cancer Lett，2015；360(2)：269-79.

16Yuan SX，Tao QF，Wang J，etal.Antisense long non-coding RNA PCNA-AS1 promotes tumor growth by regulating proliferating cell nuclear antigen in hepatocellular carcinoma〔J〕.Cancer Lett，2014；349(1)：87-94.

17Galv?o HC，Gordón-Núez MA，de Amorim RF，etal.Immunohistochemical expression of protein 53，murine double minute 2，B-cell lymphoma 2，and proliferating cell nuclear antigen in odontogenic cysts and keratocystic odontogenic tumor〔J〕.Indian J Dent Res，2013；24(3)：369-74.

〔2017-03-10修回〕

(編輯 徐 杰)

R71

A

1005-9202(2017)22-5553-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.029

武漢市衛(wèi)計(jì)委基金項(xiàng)目(WZ16C23)

1 武漢市醫(yī)療救治中心

阮連國(guó)(1975-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事急救醫(yī)學(xué)研究。

張 妍(1979-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合婦科疾病研究。