孕酮對β淀粉樣蛋白致傷神經干細胞存活及其Caspase-3表達的影響

肖韓艷 馮 瑩 徐甜穎 張本卓 袁春華 畢鵬翔

(牡丹江醫學院第二附屬醫院神經內科，黑龍江 牡丹江 157011)

孕酮對β淀粉樣蛋白致傷神經干細胞存活及其Caspase-3表達的影響

肖韓艷 馮 瑩 徐甜穎 張本卓 袁春華 畢鵬翔1

(牡丹江醫學院第二附屬醫院神經內科，黑龍江 牡丹江 157011)

目的研究孕酮(PROG)對β淀粉樣蛋白(Aβ)1～40致傷的海馬神經干細胞增殖及其Caspase-3表達的影響。方法應用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)檢測不同濃度PROG對Aβ1～40致傷神經干細胞增殖能力的影響，Western印跡法檢測PROG干預后Aβ1～40致傷的神經干細胞Caspase-3活性的變化及對致傷神經干細胞凋亡的影響。結果PROG能劑量依賴地對抗Aβ1～40致傷后引起的大鼠海馬神經干細胞存活率降低。結論1 pmol/L及10 pmol/L PROG在48 h時對Aβ1～40致傷的海馬神經干細胞增殖保護作用最強，10 pmol/L濃度PROG在7 d時對Aβ1～40致傷的海馬神經干細胞凋亡保護作用最強。

孕酮;β-淀粉樣蛋白;神經干細胞;神經毒性;阿爾茨海默病

阿爾茨海默病(AD)的發病機制不完全明確，目前有多種假說提示其可能的發病原因，其中β淀粉樣蛋白(Aβ)瀑布假說是較公認的〔1〕。該假說提示Aβ的生成及清除失衡是導致神經元變性及癡呆發生的始動因素〔2〕。本實驗建立了Aβ1～40致傷的AD干細胞模型給予濃度梯度孕酮(PROG)，研究不同濃度PROG對AD干細胞模型存活及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1動物、主要試劑及儀器 雄性Wistar大鼠，由佳木斯大學動物中心提供；四甲基偶氮唑藍(MTT，上海艾研生物科技有限公司)、Aβ1～40(Biosouxee公司)；二抗(進口分裝)；Nestin(北京博奧森生物技術有限公司)；二氨基聯苯胺(DAB)試劑盒(北京中山生物技術有限公司)；β-actin多克隆抗體(Santa Cruz公司)；酶標計數儀 E1X800(BioTEK公司)；IBE2003倒置熒光顯微鏡(重慶光學儀器廠)。

1.2方法 取出生72 h內Wistar大鼠海馬組織加入培養液(DMEM/F12 1∶1，2%B27，bFGF 20 μg/L，表皮生長因子20 μg/L)5 ml，每8天傳代；行Nestin細胞免疫化學檢測，Nestin 陽性細胞為神經干細胞。取第3代神經干細胞懸液，接種于96孔板，分別加入PROG終濃度為：0.01、0.10、1.00、10.00、100.00 pmol/L組，孵育30 min后加入Aβ1～405 μmol/L，并設立空白對照組(培養基中加入等量的培養液)和AD模型組(Aβ1～405 μmol/L加入傳代3次后的神經干細胞中)。上述各組孵育0、12、24、48、72 h、7 d各時間點行MTT法檢測，在0 h、1 d、2 d、3 d、7 d、14 d、21 d時間點行Western印跡檢測。

1.3MTT法 加入MTT溶液，使其培養液中的終濃度為5 mg/ml，繼續培養4 h，將96孔板內的培養基棄去加入溶解液二甲基亞砜(DMSO)200 μl振蕩10 min使其充分溶解結晶產物在酶標儀上以波長490 nm檢測每孔的OD值。每組設3個孔，實驗重復3次，取平均值。

1.4Western印跡檢測海馬神經干細胞Caspase-3的表達 倒去96孔板中的培養液，用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗一次，每孔加入細胞裂解液100 μl，冰上孵育20 min，將細胞裂解物刮下、移入 EP 管中，4℃ 12 000 r/min離心5 min，吸取上清液轉移入EP管，用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白質濃度，加入上樣緩沖液，配膠，上樣，電泳，半干轉膜，封閉，羊抗鼠Caspase-3多克隆抗體(1∶800)4℃孵育過夜，PBS-T洗膜4次，每次15 min，加二抗(1∶2 000)，搖勻，室溫孵育1.5 h，PBS-T洗膜4次，每次15 min，電化學發光(ECL)，感光膠片記錄，Image J 軟件分析。

1.5統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗及單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組細胞存活率比較 隨著PROG濃度的增加，在490 nm處的吸光度也增加，反映細胞相應數目的增加，并有一定的劑量依賴性。PROG在不同時間點均可促進神經干細胞增殖，與空白對照組及其他濃度組相比，在48 h時1.00 pmol/L和10.00 pmol/L PROG促進神經干細胞增殖作用最強，但二者無明顯差別(Pgt;0.05)。見表1。

2.2各組Caspase-3表達比較 各組孵育各時間點(0 h、1 d、2 d、3 d、7 d、14 d、21 d)后，與空白對照組相比，Caspase-3 活性表達逐漸增加(Plt;0.05)，且在2 d達到高峰(Plt;0.01)。與AD模型組相比，PROG組在各時間點均可降低 Caspase-3 的表達(Plt;0.05)，特別在7 d這個時間點更加明顯(Plt;0.01)，且隨PROG濃度增加Caspase-3下降越明顯，10.00 pmol/L下降最明顯，100.00 pmol/L反而輕度上升。而空白對照組在0 h、1 d、2 d、3 d、7 d、14 d、21 d Caspase-3活性未發生明顯改變(Pgt;0.05)。

表1 不同濃度PROG對Aβ1～40致傷神經干細胞存活率的影響值,n=3)

與空白對照組比較：1)Plt;0.05；與AD模型組比較：2)Plt;0.05；與其他濃度其他時間點比較：3)Plt;0.05，下表同

表2 不同濃度PROG對Aβ1～40致傷海馬神經干細胞Caspase-3表達的影響

3 討 論

干細胞是具有分裂潛能和自更新能力的母細胞，它可以通過不對等的分裂方式產生神經組織的各類細胞〔3〕。神經干細胞具有自更新能力，可以穩定增殖。本實驗的空白對照組也證實了這點。Aβ聚集是AD發病的中心環節，代謝異常引起Aβ寡聚體沉積形成斑塊〔4〕，導致繼發炎癥反應、引起氧化損傷神經細胞功能，出現神經元纖維纏結(NFTs)、軸突損傷和突觸丟失等級聯反應〔5〕，最終導致神經元凋亡誘發臨床出現癡呆癥狀。Aβ是AD患者中樞神經系統免疫炎性級聯反應的激活因素，異常沉積Aβ為免疫原、激活腦內膠質細胞、釋放炎癥介質，通過免疫炎癥應答對神經元產生毒性作用〔6〕，損傷神經細胞。另外，神經系統慢性炎性反應加劇Aβ的產生和沉積，形成惡性循環和級聯放大系統〔7〕。同時炎癥介質及各種神經毒性物質抑制AD患者內源性神經干細胞的增殖，影響內源性神經干細胞對損傷組織的修復。

細胞凋亡是維持體內環境的穩定及機體防御功能和正常生長發育所必需的。Caspase-3是細胞凋亡的特征性標志之一。本實驗提示在正常神經干細胞的發生過程中也存在凋亡，細胞凋亡參與了AD患者神經元退行性病變的過程。而PROG可以保護Aβ致傷的神經干細胞、抑制其凋亡。可能機制是PROG可降低核因子-κB及其在靶基因的表達、控制炎癥作用放大、下調多種酶的基因表達、進而抑制細胞凋亡的發生。Caspase-3、Bax和AKT蛋白在創傷后被激活，這些酶類啟動細胞凋亡程序〔8〕，PROG可以降低這些物質的表達，同時阻止細胞色素C激活Caspase-3，并上調抗凋亡蛋白Bcl-2等的表達。PROG可以上調創傷后抗凋亡蛋白細胞外信號調節激酶(ERK)的表達水平〔9〕。PROG可減輕氧自由基對細胞膜的破壞、抑制脂質過氧化反應。本實驗驗證了PROG可以下調Aβ致傷的海馬神經干細胞的凋亡進程。

1Tomkin GH.Treatment of type 2 diabetes,lifestyle,GLP1 agonists and DPP4 inhibitors〔J〕.World J Diabet,2014;5(5):636-50.

2Maiese K.Novel applications of trophic factors,Wnt and WISP for neuronal repair and regeneration in metabolic disease〔J〕.Neural Regener Res,2015;10(4):518-28.

3Dorn DC,Dorn A.Stem cell autotomy and niche interaction in different systems〔J〕.World J Stem Cells,2015;7(6):922-44.

4Desai P,Shete H,Adnaik R,etal.Therapeutic targets and delivery challenges for Alzheimer's disease〔J〕.World J Pharmacol,2015;4(3):236-64.

5廖 媛,官志忠.阿爾茨海默病發病機制中炎性反應的研究進展〔J〕.中國老年學雜志,2011;31(2):351-4.

6王 琦,周海霞.阿爾茨海默病中β淀粉樣蛋白對星形膠質細胞的作用〔J〕.中國老年學雜志,2011;31(18):3643-6.

7董賢慧,柴錫慶.阿爾茨海默病發病機制研究進展〔J〕.中國老年學雜志,2014;34(20):5906-12.

8李 林,張 蘭.中藥治療阿爾茨海默病的作用特點〔J〕.生物化學與生物物理進展,2012;39(8):816-28.

9Eagon PK.Alcoholic liver injury:influence of gender and hormones〔J〕.World J Gastroenterol,2010;6(11):1377-84.

〔2016-11-04修回〕

(編輯 曹夢園)

R741.02

A

1005-9202(2017)22-5551-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.028

黑龍江省中醫科研項目(2HY16-019)；牡丹江醫學院科學技術研究項目ZS201521

1 牡丹江醫學院附屬紅旗醫院神經內科

畢鵬翔(1980-)，男，碩士，副主任醫師，主要從事神經系統疾病研究。

肖韓艷(1981-)，女，碩士，主治醫師，講師，主要從事神經病學研究。