pEGFP-N1-NUCB2真核表達質粒的構建及在SH-SY5Y細胞中的轉染效率

田小菲 陳財良 高如陽 張建嶺 史滿金 張國徽

(河北北方學院法醫教研室，河北 張家口 075000)

pEGFP-N1-NUCB2真核表達質粒的構建及在SH-SY5Y細胞中的轉染效率

田小菲 陳財良 高如陽1張建嶺1史滿金 張國徽

(河北北方學院法醫教研室，河北 張家口 075000)

目的構建pEGFP-N1-NUCB2重組子并比較Lipofectamine 2000和Xfect兩種轉染試劑在進行神經細胞轉染時的轉染效率。方法構建pEGFP-N1-NUCB2重組子，然后采用堿裂解法進行質粒DNA的提取，PEG-MgCl2進行質粒DNA的純化，最后將純化的質粒DNA分別用兩種不同轉染試劑分別在HEK293細胞和SH-SY5Y細胞中進行轉染。結果采用Lipofectamine 2000進行pEGFP-N1-NUCB2重組子的轉染實驗，發現在HEK293細胞中可以轉染成功，但是在SH-SY5Y細胞中基本沒有熒光顯現；采用Xfect進行pEGFP-N1-NUCB2重組子的轉染實驗，發現在SH-SY5Y細胞中雖有熒光顯現，但是轉染效率非常低。結論Xfect的轉染效率高于Lipofectamine 2000，pEGFP-N1-NUCB2在SH-SY5Y細胞中采用脂質體進行轉染很難成功。

Lipofectamine 2000;Xfect；SH-SY5Y；細胞轉染

過表達研究是機體內低表達基因進行基因功能分析的強有力手段。SH-SY5Y細胞系是帕金森病(PD)等神經退行性疾病發病機制研究中一種常見的體外模型，因其有多巴胺能神經元的一些特性〔1〕，此細胞可分泌酪氨酸羥化酶(TH)、β-多巴胺羥化酶和多巴胺轉運蛋白；而且，此細胞株經不同誘導作用后可以分化為帶有不同基因型和不同生物化學特征的成熟型神經細胞。pEGFP-N1是常用的真核表達載體，其自身攜帶的GFP熒光標記便于轉染結果的觀測和后續的實驗分析。本研究構建pEGFP-N1-NUCB2重組子，進一步分析NUCB2過表達之后對百草枯引起的SH-SY5Y細胞死亡是否有抑制作用。

1 材料與方法

1.1實驗材料 神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)購于中科院細胞中心(源自美國ATCC)；胎牛血清(FBS)和DMEM/F12培養基，Hyclone公司；Trizol試劑，Millpore公司；KpnⅠ和BglⅡ限制性內切酶，連接酶，Takara；Lipofectamine 2000轉染試劑，Invitrogen公司；Xfect轉染試劑，Takara公司；TOP10感受態細胞，天根公司。

1.2細胞培養 SH-SY5Y細胞用含有10% 胎牛血清的DMEM/F12培養液(青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml)懸浮，以5×106個/ml密度接種于直徑10 cm培養皿，置于細胞培養箱中，在37℃，5%CO2，濕化條件下培養，待細胞覆蓋率達90%左右時，常規胰酶消化傳代。

1.3pEGFP-N1-NUCB2重組子的構建 NUCB2克隆引物的設計：上游引物5'-GAAGATCTTTTATTTACCTGCCTGAACATGAGGTGGA-3'，下游引物5'-GGGGTACCCAAATGTGTGGCTCAAACTTCAATTCTCC-3'，收取SH-SY5Y細胞的總RNA，反轉錄成cDNA，進行NUCB2基因PCR擴增。將擴增產物和pEGFP-N1載體相同條件下采樣KpnⅠ和BglⅡ進行酶切，純化后進行連接反應。連接產物在TOP10感受態細胞中進行轉化，最后進行質粒DNA的提取和純化，測序驗證連接產物的序列。

1.4轉染 將細胞種于35 mm培養皿中，每孔5×105個細胞，此步驟中用的培養基為DMEM/F12含10%FBS，不含抗生素。24 h內做轉染處理，細胞換液，換雙無DMEM/F12培養基，每孔加入4 μg質粒DNA，8 μl轉染試劑，培養箱中孵育4～6 h。轉染試劑處理4～6 h之后，細胞換DMEM/F12含10%FBS，不含抗生素的培養基，繼續培養箱中孵育48 h。熒光顯微鏡下觀察轉染結果，并采集圖片。

2 結 果

pEGFP-N1-NUCB2重組子構建成功之后用酶切和測序兩種方法進行鑒定，結果均提示連接成功。首先用Lipofectamine 2000在HEK293細胞中進行重組子和空載體的轉染效率比較，結果發現pEGFP-N1空載體在HEK293細胞中采用Lipofectamine 2000轉染效率很高，但是pEGFP-N1-NUCB2重組子的轉染效率明顯降低，再將pEGFP-N1-NUCB2重組子選用Lipofectamine 2000相同條件下在SH-SY5Y細胞中進行轉染，結果顯示在SH-SY5Y細胞中空載體的轉染效率非常低，重組子的轉染基本沒有成功，見圖1，此結果說明，用Lipofectamine 2000進行轉染時，無論是HEK293細胞，還是SH-SY5Y細胞中的轉染，重組子的轉染效率均較空載體低。進一步采用Takara公司研發的Xfect轉染試劑進行SH-SY5Y細胞的轉染，結果顯示，重組子的轉染效率亦過低，但是明顯高于Lipofectamine 2000的轉染效率，見圖2。

圖1 采用Lipofectamine 2000在HEK293、SH-SY5Y細胞中轉染(×400)

圖2 Xfect在SH-SY5Y中轉染(×400)

3 討 論

NUCB2可參與腫瘤壞死因子(TNF)-腫瘤壞死因子受體(TNFR1)系統介導的細胞凋亡過程〔2〕，胞外TNFR1與NUCB2-Arts1(調節TNFR脫落的氨基肽酶)結合形成復合物，進而影響其與TNF-α的結合，從而影響TNFα-TNFR1系統介導的程序性細胞死亡過程的發生〔3〕。又有報道，細胞凋亡發生過程中的caspase能對NUCB2進行裂解〔4〕。本研究顯示NUCB2的表達量降低〔5〕，可引起SH-SY5Y細胞的凋亡，這與上述NUCB2的作用機制吻合。因此本研究小組構建了pEGFP-N1-NUCB2重組子，以期觀察NUCB2過表達之后的是否抑制了SH-SY5Y細胞的凋亡發生。本實驗結果顯示采用脂質體方法進行細胞轉染在SH-SY5Y細胞中很難成功，雖然Xfect的轉染效果要優于Lipofectamine 2000，但是這兩種試劑的轉染結果都很難進行后續的過表達研究分析。雖然有報道，在SH-SY5Y細胞中pEGFP-N1載體所構建的重組子進行轉染實驗可以達到后續實驗要求的轉染效率〔6〕，但是本研究數據提示，如果需要進行神經細胞的過表達研究，應該進行除脂質體轉染外的其他轉染方法的嘗試。

1Chade AR,Kasten M,Tanner CM.Nongenetic causes of Parkinson's disease〔J〕.J Neural Transm Suppl,2006;(70):147-51.

2Roy DN,Mandal S,Sen G,etal.14-Deoxyandrographolide desensitizes hepatocytes to tumour necrosis factor-alpha-induced apoptosis through calcium-dependent tumour necrosis factor receptor superfamily member 1A release via the NO/cGMP pathway〔J〕.Br J Pharmacol,2010;160(7):1823-43.

3Aebischer J,Sturny R,Andrieu D,etal.Necdin protects embryonic motoneurons from programmed cell death〔J〕.PLoS One,2011;6(9):e23764.

4Islam A,Adamik B,Hawari FI,etal.Extracellular TNFR1 release requires the calcium-dependent formation of a nucleobindin 2-ARTS-1 complex〔J〕.J Biol Chem,2006;281(10):6860-73.

5田小菲，張 曉，張經一，等.百草枯誘導的SH-SY5Y細胞中核連蛋白2基因的表達變化〔J〕.中國老年學雜志，2017；37(13)：3158-60.

6Yu XL,Gao DW.Overexpression of cytoglobin gene inhibits hypoxic injury to SH-SY5Y neuroblastoma cells〔J〕.Neural Regen Res,2013;8(23):2198-203.

〔2016-11-10修回〕

(編輯 曹夢園)

R39

A

1005-9202(2017)22-5545-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.025

河北省衛計委基金項目(20170179)；河北北方學院創新人才培育基金項目(CXRC1323)

1 河北北方學院2012級法醫學本科1班

張國徽(1962-),男,教授,碩士生導師,主要從事法醫學研究。

田小菲(1983-),女,講師,主要從事法醫學研究。