厄貝沙坦對帕金森病大鼠的保護作用

楊發滿 黃 新 敬澤慧 蔣德旗

(青海大學附屬醫院老年病科，青海 西寧 810000)

厄貝沙坦對帕金森病大鼠的保護作用

楊發滿 黃 新 敬澤慧 蔣德旗1

(青海大學附屬醫院老年病科，青海 西寧 810000)

目的探討厄貝沙坦對魚藤酮致帕金森病(PD)大鼠模型的保護作用。方法48只大鼠按隨機數字表法分成對照組、PD模型組、PD+厄貝沙坦組、厄貝沙坦組，每組12只。2.5 mg·kg-1·d-1魚藤酮溶于二甲基亞砜和聚乙二醇(1∶1)混合液中，埋于PD模型組、PD+厄貝沙坦組微量滲透泵中，余2組給予等質量的生理鹽水；PD+厄貝沙坦組、厄貝沙坦組同時給予1 mg·kg-1·d-1厄貝沙坦每天上午8時灌胃，其余2組給予等體積生理鹽水灌胃，試驗周期為4 w。行為學檢測評定運動功能等損害癥狀；高效液相檢測黑質區多巴胺含量；免疫組化染色檢測大鼠黑質區酪氨酸羥化酶(TH)陽性細胞數目；Western印跡檢測黑質部位α-共核蛋白、caspase-3、核因子(NF)-κB蛋白表達水平。結果與對照組比較，PD模型組體質量、多巴胺含量顯著下降，黑質區TH陽性細胞數目明顯減少，α-共核蛋白、caspase-3、NF-κB蛋白表達水平顯著上升(Plt;0.05)；但與PD模型組比較，PD+厄貝沙坦組經厄貝沙坦干預后，體質量、多巴胺含量顯著提高，TH陽性細胞數目顯著增加，α-共核蛋白、caspase-3、NF-κB蛋白表達顯著下調(Plt;0.05)。結論厄貝沙坦可通過提高多巴胺含量、抑制黑質區TH陽性細胞凋亡和下調α-共核蛋白、caspase-3、NF-κB蛋白表達而起到魚藤酮致PD模型大鼠的保護作用。

帕金森病;魚藤酮;厄貝沙坦;α-共核蛋白;多巴胺

帕金森病(PD)屬于慢性神經退行性疾病，≥65歲人群發病率為1.5%〔1〕，神經元內出現α-共核蛋白(synuclein)沉積組成的路易小體，黑質區多巴胺能神經元變性、脫水等為PD主要病理特征，α-synuclein異常沉積與認知、行為失常有關，是PD早期病理關鍵環節。研究發現，腦組織內的腎素-血管緊張素系統(RAS)與PD發生發展密切相關，且血管緊張素(Ang)Ⅱ受體拮抗劑或管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)具有保護多巴胺能神經元的作用〔2～4〕。本研究探討血管緊張素轉換酶(AT)1受體厄貝沙坦片對魚藤酮致PD模型大鼠的保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物及試劑 健康成年清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠48只，體質量250～270 g，購自甘肅中醫學院動物實驗中心。魚藤酮、二甲基亞砜、酪氨酸羥化酶(TH)抗體、α-synuclein抗體購自美國Sigma公司；厄貝沙坦片，商品名：安博維，國藥準字號：J20080060，法國 Sanofi Pharma Bristol-Myers Squibb SNC產品，賽諾菲(杭州)制藥有限公司分裝；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3抗體、核因子(NF)-κB抗體購自美國CST公司；羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗購自北京中杉金橋生物技術公司。

1.2實驗分組與PD模型制備 大鼠按隨機數字表法分成對照組、PD模型組、PD+厄貝沙坦組及厄貝沙坦組各12只。100 g/L水合氯醛麻醉充分后，2ML4微量滲透泵(美國Alzet公司)包埋于各組大鼠背部皮下。2.5 mg·kg-1·d-1魚藤酮溶于二甲基亞砜和聚乙二醇(1∶1)混合液中，埋于大鼠微量滲透泵中；其他3組給予等質量的生理鹽水裝于微量滲透泵中：PD+厄貝沙坦組同時給予1 mg·kg-1·d-1厄貝沙坦(混于0.5%甲基纖維素)，每天上午8時灌胃，對照組給予等體積生理鹽水灌胃。每周一上午10時測量血壓和體質量，血壓測量采用無創尾動脈血壓測量儀(BP-2000，美國Visitech公司)。實驗設計及實施均經過青海大學附屬醫院動物倫理委員會的審核批準，實驗操作遵循《實驗動物學》有關規定。

1.3行為學評分 參照陳忻等〔5〕大鼠行為學評分標準，分為7個等級，0分：大鼠活動正常，無異常反應；1分：大鼠出現拒捕行為減弱、豎毛、毛色變黃、弓背、主動活動減少；2分：有1分的表現，且主動活動減少明顯、動作遲緩或有步態不穩；4分：有2分的表現，且步態不穩，或不能直線行走或行走時向一側旋轉；6分：向單側斜臥，單側前肢和(或)后肢癱瘓、行走困難、近似困難；8分：單側，前肢和(或)后肢完全癱瘓，四肢拘攣，體質量大幅度減輕，不能進食；10分：瀕死狀態或死亡。大鼠分組后每周進行一次評分，共持續4 w。

1.4高效液相色譜檢測黑質區多巴胺含量 實驗第4周末，麻醉后直接斷頭取腦，分離黑質腦組織，吸干表面水分稱重，冰箱保存備用。待測時加0.1 mol/L高氯酸去除蛋白，制成勻漿后4℃低溫10 000 r/min，離心30 min，取上清經0.22 μm濾膜過濾，即可用高效液相色譜儀(型號：LC1200，美國Agilent公司)檢測。流動相為0.05 mol/L磷酸二氫鈉：0.02 mol/L檸檬酸鉀：甲醇=72∶23∶5，λ=280 nm。參照峰值面積計算其測定值，以計算值/腦組織濕重(μg/g)表示。

1.5免疫組化染色檢測TH陽性細胞 實驗第4周末，麻醉后直接斷頭取腦，分離黑質腦組織，多聚甲醛4℃固定24 h，包埋成蠟塊，進行石蠟切片，每張厚5 μm，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，滴加正常非免疫動物血清，室溫下5 min，滴加1∶300稀釋的兔抗TH多克隆抗體，置4℃冰箱過夜，PBS洗3次，免疫球蛋白(Ig)G-辣根過氧化物酶(HRP)(1∶500)二抗孵育，PBS洗3次，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，脫水，脫敏，中性樹脂膠封片，400倍顯微鏡下觀察并計數，取平均值。

1.6Western印跡檢測黑質區α-synuclein、caspase-3、NF-κB蛋白的表達 實驗完成后取各組大鼠黑質腦組織，加組織裂解液超聲破碎成漿液，4℃低溫10 000 r/min，離心20 min，取上清低溫保存，蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分離后，恒流轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脫脂奶粉封閉，三羥甲基氨基甲烷-吐溫緩沖液(TBST)洗膜，之后加入相應的一抗(1∶1 000)、二抗(1∶5 000)進行孵育并洗膜，增強化學發光法(ECL)檢測目標蛋白的表達情況。

1.7統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1各組行為學比較 對照組和厄貝沙坦組活動正常，毛色光滑、無異常行為；PD模型組和PD+厄貝沙坦組給藥3 d后出現拘捕行為減弱，主動活動減少，毛色逐漸變黃，豎毛明顯；第4周時，PD模型組2只死亡，其余10只均出現不同程度的PD癥狀；PD+厄貝沙坦組死亡1只，其余11只出現PD癥狀，但行為學評分小于PD組。見表1。

2.2各組血壓、體質量、黑質多巴胺含量比較 PD模型組體質量較對照組明顯減輕，PD+厄貝沙坦組減輕較PD模型組顯著少(Plt;0.05)。各組間血壓變化均無明顯差異(Pgt;0.05)。PD模型組黑質區多巴胺含量較對照組明顯低，PD+厄貝沙坦組較PD模型組明顯提高(均Plt;0.05)。見表2。

2.3黑質區TH陽性細胞數目比較 PD模型組〔(21±3)個〕、PD+厄貝沙坦組TH陽性細胞數目〔(56±6)個〕較對照組〔(103±11)個〕均明顯減少(Plt;0.05)，PD+厄貝沙坦組TH陽性細胞數目較PD模型組顯著增加(Plt;0.05)，厄貝沙坦組TH陽性細胞數目〔(98±10)個〕較對照組變化不顯著(Pgt;0.05)。見圖1。

2.4Western印跡檢測各組黑質區α-synuclein、caspase-3、NF-κB的蛋白表達 與對照組比較，PD模型組α-synuclein、caspase-3、NF-κB 3種蛋白表達水平顯著提高(Plt;0.05)；PD+厄貝沙坦組干預后，α-synuclein、caspase-3、NF-κB蛋白表達均較PD模型組顯著下調(Plt;0.05)。見表3、圖2。

表1 各組4 w后行為學評分比較(n=12，n)

表2 厄貝沙坦對大鼠體質量、血壓及黑質區多巴胺含量的影響

與對照組比較:1)Plt;0.05，與PD模型組比較：2)Plt;0.05，下表同

圖1 各組黑質區TH陽性表達(DAB，×400)

組別nα-synucleincaspase-3NF-κB對照組121.0±0.21.0±0.11.0±0.2PD模型組102.1±0.51)3.1±0.71)2.2±0.41)PD+厄貝沙坦組111.6±0.32)1.2±0.22)1.1±0.32)厄貝沙坦組121.1±0.20.9±0.21.2±0.2

圖2 Western印跡檢測各組α-synuclein、caspase-3、NF-κB表達

3 討 論

RAS存在于大腦多個器官組織，在PD等神經退行性疾病發生發展中發揮作用〔6〕。紋狀體中存在ATⅡ、ATⅡ受體及AT，ACEI或AT1受體拮抗劑在6-羥基多巴胺(OHDA)和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)致PD動物模型中保護多巴胺能神經元〔3,4〕。厄貝沙坦屬于AngⅡ受體抑制劑，能抑制AngⅠ轉化為AngⅡ，能特異性地拮抗AT1受體，抑制血管收縮和醛固酮的釋放，產生降壓作用。研究表明，厄貝沙坦可降低酒精性腦損傷大鼠血清及腦組織神經元特異性烯醇化酶水平，有望成為治療酒精性腦損傷患者的預防用藥〔7〕。厄貝沙坦可有效改善大腦中動脈阻斷(MCAO)大鼠腦損傷的作用〔8〕。阿司匹林聯合厄貝沙坦治療急性腦梗死的臨床療效確切，安全性較高，可有效改善血液流變學、減輕炎性反應、提高神經功能及生活質量〔9〕。厄貝沙坦通過上調糖尿病大鼠腎組織基質金屬蛋白酶(MMP)-9、下調NF-κB及MMP抑制劑(TIMP)-1的表達，達到減緩糖尿病腎病的發生發展〔10,11〕。白藜蘆醇聯合厄貝沙坦抑制大鼠肺纖維化及肺組織轉化生長因子(TGF)-β1、NF-κB表達，對博萊霉素誘導大鼠肺纖維化具有明顯的改善作用〔12〕。厄貝沙坦抑制糖尿病腎病大鼠腎臟內質網應激相關的C/EBP同源蛋白-氨基末端激酶(CHOP-JNK)-caspase-12凋亡途徑、減少細胞凋亡、保護腎臟功能〔13〕。本研究結果顯示，厄貝沙坦也可通過下調NF-κB，caspase-3的表達，增加大腦黑質區多巴胺含量和TH陽性細胞數目起到保護多巴胺能神經元的作用。厄貝沙坦可能通過抑制心肌組織中TGF-β1表達，進而減少骨膜蛋白(periostin)表達水平實現抗病毒性心肌炎慢性期小鼠心肌纖維化的作用〔14〕。厄貝沙坦拮抗高糖環境中胰島細胞凋亡，可能與抑制AT1R、AngⅡ mRNA表達，阻斷RAS通路及抑制煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶介導的氧化應激有關〔15〕。厄貝沙坦可降低高血壓小鼠血管組織前纖維蛋白(Profilin)-1表達及轉錄激活因子(STAT)3磷酸化水平，促使血管氧化應激水平改善，降低血壓〔16〕。厄貝沙坦下調糖尿病大鼠心肌組織TGF-β1和結締組織生長因子的表達，從而抑制糖尿病心肌纖維化，改善心功能〔17〕。

綜上所述，厄貝沙坦對魚藤酮所致PD模型大鼠具有保護作用：①改善魚藤酮所致的PD大鼠行為學變化；②增加大鼠黑質區多巴胺含量及TH陽性細胞數目；③抑制凋亡相關蛋白NF-κB，caspase-3的表達；④減少α-synuclein的表達與沉積。

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〔2016-06-04修回〕

(編輯 苑云杰/王一涵)

R742.5

A

1005-9202(2017)22-5533-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.020

廣西自然科學基金資助項目(No.2016GXNSFBA380040)

1 玉林師范學院生物與制藥學院

蔣德旗(1986-)，男，講師，博士，主要從事神經藥理研究。

楊發滿(1963-)，男，主任醫師，主要從事老年血液病學研究。