遠(yuǎn)志皂苷對(duì)APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體的保護(hù)作用

帥智峰 韓麗君 弓 箭 王俊蘋(píng) 李公啟 吳淑琴 董海影

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院臨床病理診斷中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

遠(yuǎn)志皂苷對(duì)APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體的保護(hù)作用

帥智峰 韓麗君 弓 箭 王俊蘋(píng) 李公啟 吳淑琴 董海影

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院臨床病理診斷中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的觀察遠(yuǎn)志皂苷對(duì)APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體功能的調(diào)控，探討遠(yuǎn)志皂苷的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。方法將APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠分為模型組，遠(yuǎn)志皂苷低、中和高劑量組(18.5、37.0和74.0 mg·kg-1·d-1)，選同月齡C57BL/6小鼠為空白對(duì)照組，采用免疫熒光檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，比色法等檢測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)活力和丙二醛(MDA)含量。結(jié)果與空白對(duì)照組相比，模型組線粒體膜電位降低，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率增高，SOD，過(guò)氧化氫酶(CAT)和(GSH-PX)活性明顯降低，MDA 含量明顯增高；與模型組相比，遠(yuǎn)志皂苷各劑量組的線粒體膜電位升高，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率下降，SOD，CAT 和GSH-PX活性明顯升高，MDA 含量明顯降低(Plt;0.05)。結(jié)論遠(yuǎn)志皂苷可能通過(guò)調(diào)控線粒體功能，發(fā)揮保護(hù)海馬神經(jīng)元的作用。

遠(yuǎn)志皂苷；APP/PS1；線粒體

阿爾茨海默病(AD)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知功能減退為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，迄今為止發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，藥物的療效也不十分明確〔1〕。遠(yuǎn)志為遠(yuǎn)志科多年生草本植物，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性溫，味苦、辛，具有抗氧化、抗衰老、抗癡呆和腦保護(hù)作用等多種生理活性〔2〕。遠(yuǎn)志的主要藥理活性成分為遠(yuǎn)志皂苷(TEN)，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，TEN具有防治AD的作用〔3，4〕。本文主要探討TEN對(duì)APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體功能的調(diào)控，探討TEN的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑 TEN由南京景竹生物科技有限公司提供(CAS：JZ20160327A)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)均由南京建成生物工程研究提供(批號(hào)：20150422、20150423、20150423和20150417)。

1.2動(dòng)物 APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠(南京生物醫(yī)藥研究院，編號(hào)D000268)，4月齡，50只均為雄性；C57BL/6J小鼠10只。所有小鼠均飼養(yǎng)于齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)飼養(yǎng)室。

1.3方法

1.3.1分組和給藥 將APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠分為模型組，TEN低、中和高劑量組(18.5、37.0和74.0 mg·kg-1·d-1)，選同月齡C57BL/6小鼠為空白對(duì)照組，空白對(duì)照組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃2 w。

1.3.2海馬線粒體制備 末次行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，在冰臺(tái)上分離海馬組織，置于勻漿器中，加入適量的0～4℃線粒體分離介質(zhì)，制備勻漿，離心取上清，再離心取沉淀，加入分離介質(zhì)，離心取沉淀，加入分離介質(zhì)，獲取線粒體懸液。

1.3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 將獲取的線粒體懸液加入熒光染色液，然后進(jìn)行避光孵育，用流式細(xì)胞儀分析。

1.3.4SOD、CAT、GSH-PX活力和MDA 含量的檢測(cè) 將獲取的線粒體懸液用酶標(biāo)法檢測(cè)SOD，硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA，分光光度法檢測(cè)CAT，比色法檢測(cè)GSH-PX。

1.3.5免疫熒光檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位 取新鮮海馬組織樣本并壓平，清洗后浸入染色液，置于37℃培養(yǎng)箱孵育，抽去染色液，清洗后切片，鏡下觀察拍照。

1.4統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS16.0軟件，組間比較用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1TEN對(duì)各組腦組織海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率的影響 與空白對(duì)照組〔(4.97±0.27)%〕比較，模型組細(xì)胞凋亡率〔(35.22±8.05)%〕明顯增高(Plt;0.05)；與模型組相比，TEN高、中、低劑量組〔(7.59±0.96)%,(8.04±1.09)%,(17.73±3.34)%〕均能明顯降低細(xì)胞凋亡率 (Plt;0.05)，且TEN高、中劑量組間相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。

2.2免疫熒光檢測(cè)各組線粒體細(xì)胞膜電位的變化 與空白對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞膜電位下降(紅色熒光明顯減少，綠色熒光增加)，與模型組相比，TEN低劑量組紅色熒光增加，中劑量組和高劑量組的紅色熒光明顯增強(qiáng)，說(shuō)明線粒體膜電位開(kāi)始回升。見(jiàn)圖1。

2.3TEN對(duì)腦組織SOD、CAT、GSH-PX活力和MDA 含量的影響 與空白對(duì)照組比較，模型組腦組織SOD、CAT、GSH-PX活性明顯降低，MDA 含量明顯增高(Plt;0.05)；與模型組比較，TEN高、中劑量組均能明顯升高SOD、CAT、GSH-PX活性(Plt;0.05)，TEN高、中劑量組均能明顯降低MDA 含量(Plt;0.05)，且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)效應(yīng)；上述參數(shù)TEN高、中劑量組間比較無(wú)明顯差異(Pgt;0.05)。見(jiàn)表1。

圖1 線粒體細(xì)胞膜電位變化(×200)

組別GSH-PX(U/mg)MDA(nmol/mg)SOD(U/mg)CAT(U/mg)空白對(duì)照組609.69±45.597.75±1.3633.59±3.0830.89±2.81模型組314.61±54.311)15.17±4.771)17.30±2.151)13.12±1.081)TEN低劑量組403.77±27.831)12.37±2.1621.28±3.102)19.76±3.372)TEN中劑量組515.04±33.342)8.59±2.072)27.48±2.782)24.72±3.072)TEN高劑量組567.28±48.922)8.08±1.752)26.55±3.562)23.31±2.752)

與空白對(duì)照組比較：1)Plt;0.05；與模型組比較：2)Plt;0.05

3 討 論

AD病因?qū)W研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)缺陷和功能改變是導(dǎo)致AD 病人腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的重要因素，線粒體對(duì)細(xì)胞凋亡發(fā)揮著中心調(diào)控作用〔5〕。線粒體是由外膜、內(nèi)膜、膜間隙和基質(zhì)構(gòu)成的封閉囊狀結(jié)構(gòu)。線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生的能量是維持腦內(nèi)神經(jīng)元正常功能的必須要素。線粒體的基本功能就是通過(guò)氧化磷酸化為細(xì)胞生命活動(dòng)提供必需能量，其產(chǎn)生能量的過(guò)程主要依賴(lài)跨膜電位，線粒體基質(zhì)內(nèi)的質(zhì)子由質(zhì)子泵進(jìn)入內(nèi)外膜間隙，形成橫跨線粒體內(nèi)膜的線粒體跨膜電位，從而在ATP 合酶的作用下生成ATP〔6〕。線粒體膜電位是生物膜兩側(cè)離子濃度不同產(chǎn)生的跨膜電位差，可以作為評(píng)價(jià)線粒體功能的敏感指標(biāo)〔6〕。當(dāng)膜電位下降時(shí)，就會(huì)引起線粒體氧化磷酸化效率下降，進(jìn)而生成大量的氧自由基，導(dǎo)致細(xì)胞損傷與凋亡〔7〕。對(duì)抗活性氧簇(ROS)的抗氧化防御體系包括酶系統(tǒng)，如SOD、GSH和CAT，這些酶代表著機(jī)體的第一道抗氧化防御體系。其中SOD是體內(nèi)天然存在的氧自由基清除劑，其活性的高低可以作為機(jī)體清除氧自由基能力的指標(biāo)，而GSH是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化劑，能夠清除自由基，發(fā)揮抗氧化作用；MDA是體內(nèi)的脂質(zhì)代謝產(chǎn)物，是脂質(zhì)過(guò)氧化的主要降解產(chǎn)物，其含量的高低可以作為機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊程度的指標(biāo)〔8〕。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，益智中藥遠(yuǎn)志的有效成分具有抗癡呆、御氧化和防衰老等藥理活性〔9〕。本文研究結(jié)果顯示，TEN能顯著抑制APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡，在改善線粒體膜電位的同時(shí)還能顯著抑制SOD、CAT和GSH活性并MDA含量，呈現(xiàn)劑量依賴(lài)效應(yīng)，治療效果最佳濃度為74.0 mg·kg-1·d-1。可見(jiàn)，TEN對(duì)線粒體的功能具有較好的保護(hù)作用，可能與其通過(guò)維持線粒體膜電位的穩(wěn)定性，保持線粒體氧化磷酸化的偶聯(lián)程度，提高抗氧化酶活性與減少自由基的產(chǎn)生，抑制細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制有關(guān)。

1官 杰，李 浩，劉建剛，等.還腦益聰方組分對(duì)APP轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織炎癥因子和氧化應(yīng)激的影響〔J〕.中國(guó)病理生理雜志，2011；27(4)：732-8.

2滕紅梅，胡正海.遠(yuǎn)志的生物學(xué)及化學(xué)成分研究進(jìn)展〔J〕.中草藥,2007；38(8)：1276-9.

3陳 勤，陳逸青，葉海燕，等.遠(yuǎn)志皂苷通過(guò)UPP 通路清除AD 大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞代謝廢物積聚的作用機(jī)制研究〔J〕.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2015；35(3)：327-32.

4黃 炎，陳逸青，陳 勤，等.遠(yuǎn)志皂苷對(duì)Aβ1-40 誘導(dǎo)癡呆大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體的保護(hù)作用〔J〕.中藥藥理與臨床，2015；31(1)：93-7.

5Han XJ，Tomizawa K，F(xiàn)ujimura A，etal. Regulation of mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases〔J〕.Acta Med Okayama，2011；65(1)：1-10.

6Ly JD，Grubb DR，Lawen A.The mitochondrial membrane potential(Δψm) in apoptosis，an update〔J〕.Apoptosis，2003；8(2)：115-28.

7Fariss MW,Chan CB，Patel M，etal.Role of mitochondria in toxic oxidative stress〔J〕.Mol Interv，2005；5(2)：94-11.

8Tarozzi A，Angeloni C，Malaguti M，etal.Sulforaphane as a potential protective phytochemical against neurodegenerative diseases〔J〕.Oxid Med Cell Longev，2013;2013：415078.

9葉海燕，陳 勤.遠(yuǎn)志皂苷對(duì)Aβ1-40 誘導(dǎo)的AD 大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙的保護(hù)作用機(jī)制研究〔J〕.中國(guó)新藥雜志，2013；22(22)：2674-8.

〔2017-02-28修回〕

(編輯 郭 菁)

ProtectiveeffectofsengeninonhippocampusneuronalmitochondriaofAPP/PSIdoubletransgenicrat

SHUAIZhi-Feng,HANLi-Jun,GONGJian,etal.

PathologyDiagnosisCenterQiqiharMedicalUniversity,Qiqihaer161006,Heilongjiang,China

ObjectiveTo observe the regulation of the sengenin on APP/PSI double transgenic rats' hippocampus neuronal mitochondria, explore the protection of the sengenin to the nerves.MethodsAPP/PSI double transgenic rats were divided into model, sengenin high, middle and low dose groups(18.5, 37.0 and 74.0 mg·kg-1·d-1), the same month old C57BL/6 rats were chosen as the control group. Hippocampus neuronal mitochondria potential was detected by immunofluorescence, cell apoptotic rate was measured by flow cytometry, SOD, GSH-PX activity and MDA content were detected by colorimetry.ResultsCompared with control group, mitochondrial membrane potential was decreased, the apoptotic rate of neuron cell was increased, the activity of SOD，CAT and GSH-PX were decreased significantly, the content of MDA of model group was increased significantly. Compared to model group, the mitochondrial membrane potential was increased, the apoptotic rate of neuron cell was decreased, the activity of SOD, CAT and GSH-PX were increased, the content of MDA was decreased significantly in each sengenin group (allPlt;0.05).ConclusionsSengenin could protect the function of hippocampal neurons by regulating mitochondria function.

Sengenin; APP/PS1; Mitochondrion

R745.1

A

1005-9202(2017)22-5493-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.004

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(No.81403131)；黑龍江省普通本科高等學(xué)校青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃(UNPYSCT-2015107)

董海影(1982-)，女，博士，講師，主要從事神經(jīng)精神疾病的病理學(xué)研究。

帥智峰(1982-)，女，碩士，講師，主要從事神經(jīng)精神疾病的病理學(xué)研究。