缺氧微環境誘導膠質母細胞瘤耐藥機制研究進展*

高雨歌 王韓兵 張巖 李里 綜述 姜秋穎 審校

缺氧微環境誘導膠質母細胞瘤耐藥機制研究進展*

高雨歌 王韓兵 張巖 李里 綜述 姜秋穎 審校

膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）的耐藥性是導致其臨床治療失敗的主要原因。目前，諸多研究認為腫瘤內部缺氧的微環境能夠誘導GBM對放化療的抵抗。GBM的生長極為迅速，貧瘠的氧供不能滿足其對氧氣的需求，缺氧的微環境由此形成。缺氧可通過不同機制影響GBM的耐藥性。本文將根據缺氧微環境的形成與缺氧誘導GBM耐藥的機制進行綜述。

膠質母細胞瘤 缺氧 微環境 化療耐藥

膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）是原發于中樞神經系統的惡性腫瘤，目前對于GBM的治療主要采用手術，術后輔以放化療，但其總體預后仍然很差［1］。GBM耐藥發生率較高是導致其不良預后的重要原因。在所有實體瘤中，高級別膠質瘤的血管化最為明顯，“微血管增生”已成為膠質母細胞瘤的一項特征。變異的血管產生不規律的血流，使腫瘤細胞迅速地傳播到組織中氧氣擴散之外的區域。然而新生的毛細血管網不能有效維持腫瘤組織對氧的需求，從而形成腫瘤內部氧濃度梯度。這種低氧的微環境有助于腫瘤細胞對抗放療和化療的殺傷作用。因此，對于GBM中缺氧微環境的研究將為發現新藥物或輔助療法提供新的思路。

1 GBM腫瘤微環境中微血管增生與缺氧并存

在人腦組織中存在兩個特征性神經微環境，分別為前腦側腦室下區（subventricular zone，SVZ）和顆粒下層（subgranular zone，SGZ），在海馬區齒狀核駐留著休眠期干細胞和具有有絲分裂活性的前體細胞，有研究表明膠質瘤最可能來源于SVZ［2］。在所有實體腫瘤中，高級別膠質瘤的血管化最為明顯，新生血管增生與缺氧誘導的壞死已成為GBM的重要特征，且這兩項特征與預后不良相關［3］。受細胞間相互作用和細胞外環境的影響，腫瘤血管生成是一個非常復雜的過程。腫瘤中的毛細血管與正常組織相比，結構和功能也有所差異，腫瘤組織中毛細血管無基底膜、具有較高滲透性、結構不規則、具有盲端、缺少血管平滑肌和一些受體［4-5］。以上特點形成了不規則的血流并使腫瘤細胞可以傳播到超過氧氣擴散距離（約100 μm）之外的組織之中，同時形成了一種低氧且營養供給困難的腫瘤生長環境［5］。而在此環境中的細胞反應性地誘導新血管生成以供給更多的氧，此過程可由低氧誘導，即缺氧誘導因子介導的血管生成。然而這種新生的血管不能有效支持生長迅速的腫瘤組織，因而會形成腫瘤內部的氧氣濃度梯度，這是所有實體瘤均具有的特征［5］。健康腦組織中氧氣濃度范圍為12.5%～2.5%（pO2=200～100 mmHg），絕大多數GBM存在不同程度缺氧，其氧氣濃度介于2.5%～0.5%［6-8］。由于缺氧嚴重，腫瘤細胞不得不通過改變自身分子或遺傳性狀而適應貧瘠的氧氣與營養供應［9-10］。顯微鏡檢中經?？砂l現不斷擴大的腫瘤組織在靠近血管的位置且腫瘤中心具有壞死區［11］。這些壞死區與增生的微血管間存在時間與空間的聯系，是具有特征性的柵欄狀壞死區。在GBM中，腫瘤細胞大量凋亡或腫瘤生長超過血液供給能力均會導致腫瘤組織壞死［12］。已有研究顯示，在所有GBM患者的腫瘤組織中均有不同程度的壞死，且該壞死與腫瘤體積大小并無明顯關系［10］。

2 缺氧微環境可通過不同機制對GBM耐藥產生影響

2.1 缺氧可誘導Bad、Livin、BVR表達

缺氧的微環境可通過誘導蛋白表達和激活腫瘤的多藥耐藥機制促進GBM對化療藥物的耐藥性。B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，BCL-2），是細胞凋亡研究中最受重視的癌基因之一。Bad是BCL-2家族中與BCL-2和BCL-XL相關的促凋亡基因。缺氧會誘導促凋亡蛋白Bad的112位絲氨酸磷酸化，抑制Bad與促生長蛋白BCL-XL結合，從而保護GBM細胞減弱紫杉醇藥物的細胞毒效應［12-13］。缺氧還可使腫瘤細胞內促凋亡通路受到抑制，當GBM細胞暴露于低氧環境中或將GBM異種移植到缺氧環境中時，凋亡抑制蛋白Livin表達將會增加，而Livin與GBM對替莫唑胺耐藥相關［14］。另有實驗表明，低氧誘導的GBM對替莫唑胺及紫杉醇耐藥性在膽綠素還原酶（biliverdin reductase，BVR）耗盡時可發生逆轉，重新對藥物敏感，而BVR在低濃度氧環境中可獲得高表達，這說明低氧誘導GBM耐藥可能與BVR有關［15］。

2.2 缺氧誘導因子-1α的作用

缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）能夠直接影響GBM化療耐藥，近期更有實驗表明HIF-1α在缺氧環境可以與Livin啟動子結合調節Livin的表達，從而調節腫瘤細胞耐藥［14］。已有實驗結果證明，與對照組相比HIF-1α基因敲低的T98G細胞中多耐藥相關蛋白1（multidrug resistance associated protein 1，MRP1）表達減低，且細胞對阿霉素與依托泊苷治療敏感［16］。曾有科學家在鋅離子誘導HIF-1α下調的實驗中發現ABC轉運蛋白與MDR1轉錄水平降低相關，因而ABC轉運蛋白也可能參與了缺氧誘導的化療耐藥［17］。HIF-1α下調還可降BCL-2表達，這也說明缺氧的微環境通過誘導HIF-1α參與了多種化療藥物的耐藥機制。

2.3 不同缺氧類型可通過ABCB1影響GBM耐藥

不同細胞呈現的不同缺氧類型亦可導致不同程度化療耐藥。如在周期性循環缺氧的條件下（1 h缺氧后供氧30 min），與正常氧供組及間斷供養組相比，U87MG和GBM8401細胞系中觀察到ABCB1 mRNA及蛋白（P-糖蛋白）過表達，P-糖蛋白在循環缺氧環境中會增加U87MG細胞對卡莫司汀和阿霉素的耐藥性［18］。而HIF-1α基因敲除可抑制多藥耐藥性蛋白的三磷酸腺苷結合轉運蛋白B1（ATP-binding cas?sette subfamily B member 1，ABCB1）基因表達，推測HIF-1α可通過ABCB1影響GBM細胞耐藥。

2.4 缺氧導致pH降低誘導腫瘤細胞代謝改變

血供貧乏而又低氧的狀態可增強腫瘤細胞的糖酵解通路，使組織產酸增加，產生瓦伯格效應，導致腫瘤內pH降低［19］。電極測量顯示：人類腦腫瘤中最低pH值為5.9，平均pH值約為6.8，而正常腦組織的平均pH值為7.1［12］。與正常腦組織相比，偏低的pH值是GSM腫瘤微環境重要的組成部分，酸性環境與腫瘤許多生理活動相關，如增殖、血管生成、免疫抑制、侵襲和化療耐藥［19-20］。膠質瘤中pH值降低會減慢腫瘤細胞的生長速度，但可以增強其對于多種化療藥物的耐藥性，也能通過抑制抗腫瘤藥物的跨膜運輸從而降低其療效［21］。這是由于被動運輸中不帶電的分子跨膜效率最高，而環境pH值降低會導致藥物被質子化，從而減少了細胞對藥物的攝?。?2］。

3 缺氧微環境可通過對膠質瘤干細胞的作用促進GBM耐藥

3.1 缺氧微環境與膠質瘤干細胞

腫瘤干細胞（cancer stem cells，GSCs）通常位于腫瘤壞死區周圍，這里缺氧的環境可以促進其“干細胞性”及其耐藥性［23］。在GBM中，缺氧與患者預后不良相關，這亦是干細胞所處微環境的重要性之一［24］。在健康腦組織中，氧氣水平的調節是構成正常信號的一個重要部分，能夠影響細胞增殖、分化和神經干細胞的自我更新［25］。低氧可以維持細胞多能性和抑制胚胎干細胞的分化。因此，缺氧可作為正常干細胞環境的功能成分［26］。GSCs在缺氧環境中富集，其干細胞特性的維持是包括HIFs、Notch、Wnt和HH通路等許多因素綜合作用的結果［27-29］。

3.2 Notch通路激活可促進GBM耐藥

內皮細胞（endothelial cells，ECs）與GSCs之間存在相互作用，GSCs可分泌高水平的血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），通過血管內皮生長因子受體-2（vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2）作用于ECs促使血管新生［30］。ECs可分泌SHH（sonic hedgehog ligand）蛋白，通過其下游轉錄因子膠質瘤相關基因-1（glioma-as?sociated oncogene-1，Gli-1）激活GBM內HH信號通路［31］。在GSCs的Notch信號通路中，配體Delta-like 4（DLL4）和Jagged-1與Notch受體（Notch 1與Notch 2）結合可促進GSCs的干細胞潛能；而在腦微血管內皮細胞與GSCs在免疫缺陷小鼠體內聯合移植實驗中，敲除Notch配體基因可以使腫瘤生長速度減慢［32］。內皮細胞經放療后，其Jagged-1表達水平增高，這也提示Notch通路的激活可能與GBM放療抵抗相關［33］。缺氧可通過誘導HIF-1α和Notch胞內結構域（notch intracellular domain，NICD）間反應和隨后的轉錄機制促進GSCs的干樣細胞特性［28］。膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）陽性的癌細胞低表達Notch受體和CD133，但卻高表達DLL配體［32］，這表明內皮細胞或已分化細胞產生的配體可通過腫瘤微環境激活GSCs中Notch信號通路。除此之外，缺氧環境還可促進Shh、Smo和Gli過表達［34］。已有實驗證明，腫瘤細胞中Notch通路中RBPJ（re?combination signal-binding protein-J kappa）和MAML3（mammalian mastermind like 3）兩個轉錄調節因子與Smo和Gli過表達相關［35］。

3.3 缺氧微環境可維持GSCs表型

不同深度GBM組織中，均可觀察到CD133+細胞富集在腫瘤深部和缺氧區域，而且此處細胞分化標志物如GFAP和β-微管蛋白Ⅲ水平較腫瘤邊緣低［36］。而大多數CD133+細胞過表達MGMT（O6-methylguanine DNA methyltransferase），對替莫唑胺耐藥。因此，在GBM中存在著耐藥性和分化標記物隨氧分壓變化的梯度，氧分壓越低腫瘤的耐藥性越強。體外實驗顯示，將GSCs暴露于1%氧分壓環境中，干細胞表型相關蛋白（CD133、Bmi-1、NESTIN、SOX2）和耐藥相關蛋白（MGMT、MRP1、P-gp）表達均有所增加［37］。這也突出表明了干細胞表型的維持與腫瘤耐藥相關，而缺氧的環境可以對此產生促進作用。

4 結語

GBM中腫瘤細胞與腫瘤微環境共同構成一個相互作用又聯系緊密的整體，缺氧的條件可以根據腫瘤血管動力學、免疫調節及代謝改變等不同機制促進GBM的耐藥［38］。這其中包含各種細胞組分和非細胞組分的作用，涉及眾多信號轉導通路，其機制錯綜復雜，需要更多的基礎研究證實究竟哪一方面在GBM耐藥中占主導。也有研究表明，GBM可以通過各種生物信號抑制替莫唑胺誘導的GBM細胞衰老［39］，從而逃脫細胞衰老，產生耐藥。宏觀上，氧定量成像等方法可有助于對GBM缺氧微環境與其耐藥關系進行更深入的研究，如氧增強核磁共振能更加清晰地對缺氧區域進行識別，從而進一步探究GBM的耐藥模式，指導臨床治療［40］。對缺氧微環境誘導膠質母細胞瘤耐藥機制的深入研究仍在進行，相信在不久的將來，可能設計出阻斷缺氧微環境誘導細胞耐藥的方法途徑，使更多的患者受益，開啟GBM治療的新篇章。

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（2017-05-24收稿）

（2017-08-07修回）

（編輯：孫喜佳 校對：鄭莉）

Research progress on the mechanisms of chemotherapy resistance to glioblastoma induced by hypoxia microenvironment

Yuge GAO,Hanbin WANG,Yan ZHANG,Li LI,Qiuying JIANG

Department of Oncology,the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150001,China

Li LI;E-mail:lisophiali@aliyun.com

The chemotherapy resistance of glioblastoma is one of the main reasons leading to treatment failure.To date,many studies suggest that hypoxia microenvironment can induce resistance to chemotherapy and radiotherapy.Glioblastoma cells grow fast,and poor oxygen cannot supply enough nourishment.Thus,hypoxia microenvironment occurs.However,hypoxia can affect chemotherapy resistance of glioblastoma through different kinds of mechanisms.In this review,we by summarize the formation of hypoxic microenvironment and the pathogenesis of glioblastoma chemotherapy resistance induced hypoxia.

glioblastoma,hypoxia,microenvironment,chemotherapy resistance

哈爾濱醫科大學附屬第二醫院腫瘤內科（哈爾濱市150001）

*本文課題受第57批中國博士后科學基金項目（編號：2015M571493）資助

李里 lisophiali@aliyun.com

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.21.579

This work was supported by the 57th batch of China Postdoctoral Science Foundation(No.2015M571493).

高雨歌 專業方向為腫瘤內科學。E-mail：570536973@qq.com