小鼠胚胎成纖維細胞滋養層對小鼠誘導多能干細胞的作用研究

孟媛+王紅雷+任曉莉

[摘要]目的：探討小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblasts，MEFs）滋養層對小鼠誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells， iPSCs）適宜的培養條件及其作用機制。方法：取E12.5～14.5d ICR孕鼠，培養小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblasts，MEFs），制備滋養層，收集第2～3代（P2～P3）和第6代（P6）培養2～4d MEFs滋養層細胞培養基（MEF-CM），ELISA檢測P2～P3和P6 MEF-CM中Activin A、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）的濃度水平。iPSCs與滋養層細胞共同培養，并進行細胞鑒定。結果：ELISA檢測結果顯示P2～P3 MEF-CM中Activin A 、LIF的濃度顯著高于P6 MEF-CM，差異有顯著性意義（P<0.05）。iPSCs呈克隆狀生長，細胞鑒定結果顯示：擬胚體形成；堿性磷酸酶染色呈陽性；0CT4表達陽性。結論：E12.5～14.5d來源的P2～P3 MEFs滋養層能有效的抑制iPSCs的分裂，支持iPSCs的生長并維持其全能性。

[關鍵詞]誘導多能干細胞；小鼠胚胎成纖維細胞；滋養層；Activin A；白血病抑制因子

[中圖分類號]R783.5 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2017）10-0056-03

Abstract： Objective To establish mouse embryonic fibroblasts （MEFs） as the feeder layers for supporting induced pluripotent stem cells （iPSCs） and to discuss the effects of MEFs on iPSCs. Methods Mouse embryonic fibroblast cells for primary culture were derived from ICR mouse embryos （pregnant 12.5-14.5 days）. MEFs were treated with mitomycin-C by 10ug/ml as feeder layer. MEF-conditioned medium （MEF-CM） was collected from the second or third and the sixth passage of MEFs. The concentration of Activin A and leukemia inhibitory factor （LIF） in MEF-CM was detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. iPSCs were cultured on MEFs. Theexpression of alkaline phosphatase （ALP） and Octamer-4（OCT4） of iPSCs was tested. EB formation was achieved. Results After being treated with mitomycin-C，MEFs proliferation could be effectively repressed and be made into the feeder layer for iPSCs clonal expansion. ELISA was shown that the concentration of Activin A and LIF in the third passage of MEF-CM was significantly higher than that in the sixth passage of MEF-CM（P<0.05）. iPSCs cultured on the feeder layer grew well and maintained undifferentiation and vitality， which could form the “nest” morphology as embryonic stem cells clone， and also formed EB. iPSCs expressed the positive result of ALP and OCT4. Conclusion MEF feeder layer derived from mouse embryos （E12.5-14.5d） could effectively support mouse iPSCs undifferentiation and self-renewal.

Key words： induced pluripotent stem cells； mouse embryonic fibroblasts； feeder layer； activin A； leukemia inhibitory factor

小鼠誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells， iPSCs）是由小鼠皮膚細胞重編程獲得的一類具有自我復制、自我更新能力的多潛能干細胞[1]。在形態、增殖、表面抗原、基因表達、染色質性質等方面與胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）相似，又克服了ESCs研究中所涉及的倫理道德爭議[2]。而患者來源的iPSCs避免了細胞移植可能出現的免疫排斥反應[3]。iPSCs的出現給人類帶來了新的希望，在發育生物學和再生醫學領域具有重要意義。目前iPSCs的培養主要采用小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblasts，MEFs）作為滋養層，而MEFs是如何支持ESCs和iPSCs的生長，目前機制不十分清楚。有學者認為滋養層細胞可以分泌多種因子，促進誘導多能干細胞生長和抑制誘導多能干細胞分化，從而維持誘導多能干細胞自我更新和無限增殖能力。本研究采用滋養層法培養iPSCs，探討MEFs滋養層細胞適宜的培養條件以及對iPSCs的支持作用，為利用iPSCs進行再生醫學和發育生物學的研究提供有力支持。endprint

1 材料和方法

1.1 小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblasts，MEFs）分離培養：取E12.5～14.5d ICR孕鼠，斷頸處死，于超凈臺內無菌條件下暴露子宮。用顯微鑷取出整個子宮，用PBS沖洗三次，棄除表面殘余血跡。沿子宮系膜側剪開子宮，取出胚胎，置于有PBS的平皿內，充分洗滌，棄除表面紅細胞。剝除胎膜，取出胎鼠，用PBS洗滌三次。用眼科剪剪除胚胎頭部、內臟和四肢，將軀干部用PBS洗滌三次，充分棄除紅細胞。再將鼠胚軀干剪成1mm3以下的碎塊， 吸置于離心管內，加入0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化10min。然后加入足量培養液終止消化。在4℃條件下，1000r/min，離心5min。棄掉上清，加適量培養液（DMEM+10%FBS），反復吹打20次，接種到培養瓶中，置37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養。待細胞互相重疊爬滿整個培養瓶底時即可傳代。

1.2 滅活MEFs制備滋養層：培養的MEFs中加入10μg/ml絲裂霉素C混勻。置培養箱中3h。吸棄廢液，用PBS（不含鈣鎂）沖洗5～6次。加入0.25%胰酶（含0.02%EDTA）消化2min。隨后加入MEFs培養液終止消化。1000轉，離心5min。以2.0×105/ml密度鋪在預先明膠處理過的培養瓶上。

1.3 ELISA檢測細胞因子的濃度：收集培養2～4d的P2～P3和P6 MEF滋養層細胞上清液（MEF-CM）。用濾器（Corrigtwohill，愛爾蘭）過濾，-80℃冷藏備用。iPSCs高糖DMED培養液作空白對照。各組培養液中ActivinA、LIF濃度采用酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測，檢測試紙由美國R&D公司提供，檢測儀器為奧地利Anthos2010型全自動酶標免疫分析系統，具體操作過程嚴格按試劑盒說明書進行。在酶標儀上檢測450nm處測量吸光值，計算標本濃度。

1.4 iPSCs的培養：小鼠iPS-C5系購買于中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院。從液氮中取出一支凍存的iPSCs，放入37℃水浴中解凍復蘇，吸取凍存管內的細胞懸液至PBS中，常規離心。吸棄上清液，加入高糖DMEM培養液 （含15%滅活胎牛血清、1%非必須氨基酸、1%丙醇酸鈉、0.1%2-巰基乙醇），制成單細胞懸液，以2×105/ml密度接種在已經鋪好MEFs滋養層的培養瓶中培養。

1.5 iPSCs的鑒定：擬胚體（embryonic body，EB）形成：iPSCs常規消化、重懸，采用懸滴法[4]生成EB。

堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase， ALP）染色：4%多聚甲醛固定iPSCs 15min。堿性磷酸酶染色液37℃避光染色15min。無水乙醇ⅰ、無水乙醇ⅱ中依次10min，二甲苯中20min。樹膠封固、拍照。

細胞免疫熒光染色：4%多聚甲醛固定iPSCs15min，0.25%Triton X-100孵育15min，4%山羊血清封閉30min。OCT4一抗（1∶100，Santa Cruz公司，美國），Rhodamine 標記二抗（1∶200，Santa Cruz公司，美國）。5μg/ml Hoechst 33342（Sigma公司，美國）襯染細胞核15min。熒光顯微鏡 （Olympus公司，日本）拍照。

1.6 統計學分析：所有數據采用SPSS12.0統計學軟件進行處理，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MEFs形態學觀察：E12.5～14.5d來源的MEFs原代細胞中混有一些雜細胞，傳到第2～3代時，雜細胞逐漸減少。電鏡下MEFs多為梭形，形態規則，呈放射狀相互交錯排列。第6代MEFs可見部分細胞腫脹，突起變短或消失，空泡細胞比例增多。（圖1）

2.2 MEF-CM中Activin A、LIF的濃度水平：ELISA檢測各組培養液中Activin A、LIF的濃度水平，檢測結果顯示與對照組高糖DMED培養液相比，P2～P3和P6 MEF-CM中Activin A、LIF的濃度均有統計學意義；P2～P3 MEF-CM中Activin A、LIF的濃度顯著高于P6 MEF-CM中細胞因子濃度，差異有統計學意義（圖2）。

2.3 iPSCs形態學觀察及鑒定：小鼠iPSCs接種到滅活處理的第3代MEFs滋養層細胞上培養，電鏡下可觀察到iPSCs呈克隆團狀生長，細胞克隆形態多樣，呈島狀或者巢狀，克隆數量多，生長旺盛。iPSCs懸滴到六孔板上蓋，2d后懸滴的液體中可看到白色圓球體形成，用吸管吸出擬胚體至六孔板內繼續培養，待貼壁后有細胞向外遷移。iPSCs堿性磷酸酶染色呈棕紅色，染色陽性。細胞免疫熒光染色結果顯示：細胞內轉錄因子-4（Octamer-4， OCT4）表達陽性 （圖2） 。

3 討論

2006年Takahashi等將4種轉錄因子（Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4） 導入小鼠成纖維細胞，通過重編程獲得可以和ESCs相媲美的全能干細胞，即iPSCs[1]。隨后，美國及日本兩個研究小組采用不同的轉錄因子將人的皮膚細胞轉化為iPSCs[5-6]。很多研究證明iPSCs具有ESCs類似的功能，可以向人體內三個胚層的所有細胞分化[7-9]。人體細胞來源的誘導多能干細胞繞開了胚胎干細胞研究一直面臨的倫理障礙，而患者特異性的誘導多能干細胞大大降低了細胞移植可能出現的免疫排斥反應[3]，為干細胞的研究帶來了新的突破。本研究介紹了iPSCs的體外培養方法，為利用iPSCs進行的組織器官再生或缺損修復治療提供有力的支持。

MEFs常被用作培養ESCs的滋養層細胞[10]，E12.5～14.5d來源的MEFs，第3代時雜細胞較小，細胞增殖能力較強，細胞壽命長，傳到第6代時細胞即可見空泡細胞增加，提示細胞壽命較短，較易老化。本研究采用E12.5～14.5d來源的第3代MEFs作為滋養層，培養的iPSCs克隆數量多，生長旺盛。iPSCs鑒定結果顯示：可以形成EB；ALP、OCT4表達陽性。EB是一種類似早期胚胎的球體結構，包括外、中、內三胚層結構，是胚胎干細胞在體外自發形成[11]。ALP、OCT4陽性表明iPSCs還處于未分化狀態。OCT4是胚胎干細胞的特異性標志之一。這些結果都證明了本研究培養的iPSCs具有ESCs相似的生物學特性。endprint

MEFs滋養層是如何支持ESCs和iPSCs的生長，目前機制不十分清楚。有學者認為滋養層細胞可以分泌FGF、VEGF、IGF等生長因子，促進干細胞的克隆生長；另外還可以分泌白血病抑制因子（LIF）等，抑制干細胞的分化[12]。Chin等[13]對MEF培養基的蛋白組分析結果證明了Activin A的存在。還有學者認為MEFs的條件培養基中Activin A、Nodal和FGF介導的信號通路能維持hESCs的自我更新[14]。Furue認為LIF是是一種能抑制ESCs自發性分化的分泌性多肽細胞因子，滋養層中的LIF具有抗凋亡的作用[15]。Smith等認為LIF是維持ESCs全能性的重要因子，從滋養層培養基中撤銷LIF，ESCs會很快分化成各種類型的細胞[16]。本研究采用E12.5～14.5d來源的MEFs作為培養iPSCs的滋養層，ELISA檢測MEFs培養基中Activin A和LIF的水平，結果顯示MEF-CM中Activin A、LIF的濃度顯著高于未培養的高糖DMED培養液，而第3代MEF-CM中Activin A、LIF的濃度顯著高于第6代。結果表明MEFs滋養層細胞分泌的Activin A和LIF，支持iPSCs的自我更新和未分化特性。有學者在無飼養層的培養條件下加入LIF，并不能維持ESCs的自我復制的狀態[17]，表明了滋養層為ESCs和iPSCs生長提供了復雜的微環境。

總而言之，E12.5～14.5d來源的第3代MEFs滋養層，能有效的支持iPSCs的生長，MEFs為iPSCs提供了復雜的微環境，其作用機制并不完全明確，除了Activin A和LIF，其他哪些關鍵因子還發揮重要作用，尚待深入研究。

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[收稿日期]2016-11-21 [修回日期]2017-09-06

編輯/張惠娟endprint