高效液相色譜法測(cè)定金振口服液中6種成分含量

楊智慧 ，程 誠(chéng) ，姚 青

（1.江蘇省連云港市藥品檢驗(yàn)所，江蘇 連云港 222006； 2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001）

高效液相色譜法測(cè)定金振口服液中6種成分含量

楊智慧1，程 誠(chéng)1，姚 青2

（1.江蘇省連云港市藥品檢驗(yàn)所，江蘇 連云港 222006； 2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001）

目的 建立測(cè)定金振口服液中黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、甘草酸、大黃素和大黃酚6種成分含量的高效液相色譜法。方法 色譜柱為Phenomenex C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 m），流動(dòng)相為甲醇（A） －0.05% 磷酸溶液(B)，梯度洗脫，流速為 1.0 mL ／min，柱溫為 30 ℃，波長(zhǎng)切換時(shí)間序列采樣（黃芩苷 0 ～15.0 min、280 nm，蘆薈大黃素、大黃酸 15.0 ～35.0 min、254 nm，甘草酸 35.0 ～39.8 min、237 nm，大黃素、大黃酚 39.8～50.0 min、254 nm）。結(jié)果 黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、甘草酸、大黃素和大黃酚進(jìn)樣量分別在 0.043 2～2.162 5 g，0.012 8 ～0.638 0 g，0.018 5 ～0.926 0 g，0.035 8 ～1.792 5 g，0.049 8 ～2.488 0 g，0.052 9 ～2.643 5 g 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，平均加樣回收率 分別為 98.84% ，99.49% ，99.89% ，100.31% ，99.55% ，99.54% ， RSD 分別為 1.10% ，1.03% ，1.49% ，1.23%，0.98%，1.19%（n＝9）。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)單快捷，準(zhǔn)確可靠，可用于金振口服液的質(zhì)量控制。

高效液相色譜法；金振口服液；黃芩苷；蘆薈大黃素；大黃酸；甘草酸；大黃素；大黃酚

金振口服液收載于2015年版《中國(guó)藥典(一部)》，由山羊角、平貝母、大黃、黃芩、青礞石、石膏、人工牛黃、甘草8味中藥組方，具有清熱解毒、祛痰止咳的功效[1]，主要用于小兒急性支氣管炎的治療。方中大黃含有多種蒽醌類化合物，具有瀉下攻積、清熱瀉火的功效，主要成分為大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸等，用于實(shí)熱積滯等癥[2－6]；黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，主要成分為黃芩苷，用于濕溫、暑濕等癥[7－9]；甘草具有補(bǔ)脾益氣、祛痰止咳的功效，主要成分為甘草酸、甘草苷，用于脾胃虛弱、倦怠乏力等癥[10－11]。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)黃芩中的黃芩苷以高效液相色譜（HPLC）法進(jìn)行了含量控制。基于中藥具有多組分、多靶點(diǎn)、協(xié)同作用的特點(diǎn)[12－14]，本研究中以黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、甘草酸、大黃素和大黃酚作為指標(biāo)成分，采用HPLC法，通過(guò)波長(zhǎng)切換法實(shí)現(xiàn)同時(shí)測(cè)定6種成分的含量，簡(jiǎn)單快捷，準(zhǔn)確可靠，為該藥品質(zhì)量控制提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀，包括G－1311C型高壓四元泵，G－1329B型自動(dòng)進(jìn)樣器，G－1316A型柱溫箱，G1315D型二極管陣列檢測(cè)器（DAD）及 EZChrom Elite3.3.2.1037 色 譜 工 作 站 （ 美 國(guó) Agilent公 司 ）；BP211D型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；SK250HP型超聲儀（上海利導(dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)為 110715－201318，純度為93.3%），蘆薈大黃素對(duì)照品（批號(hào)為 110795－201007，純度為 98.0%），大黃酸對(duì)照品（批號(hào)為 110757－200206），甘草酸銨對(duì)照品（批號(hào)為 110731－200615），大黃素對(duì)照品（批號(hào)為110756－200110），大黃酚對(duì)照品（批號(hào)為 110796－201319，純度為 99.6%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；金振口服液（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)分別為 160721，160906，161108）；水為高純水；磷酸（分析純，北京化工廠，批號(hào)為160512）；甲醇(色譜純，批號(hào)為160201)由Fisher Scientific提供；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A） －0.05% 磷酸溶液（B）梯度洗脫（0～12 min，48%A；12～15 min，48%A→65%A；15～40 min，65%A；40～45 min，65%A→48%A；45～50 min，48%A）；流速：1.0 mL ／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm （0 ～ 15.0min，黃芩苷），254 nm （15.0 ～ 35.0 min，蘆薈大黃素、大黃酸），237 nm（35.0 ～ 39.8 min，甘草酸），254 nm （39.8 ～50.0 min，大黃素、大黃酚）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

混合對(duì)照品溶液：取各對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成黃芩苷 432.5 μg ／mL，蘆薈大黃素 127.6 μg ／mL，大黃素 185.2 μg ／mL，甘草酸 358.5 μg ／mL，大黃素497.6 μg ／mL，大黃酸 528.7 μg ／mL 的混合對(duì)照品貯備液，4℃貯存，備用。精密吸取上述貯備液5 mL置50 mL窬量瓶中，加甲醇稀釋，定容，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液：取樣品（批號(hào)為161108）5支的內(nèi)容物，混勻，精密量取10 mL，精密加入甲醇－鹽酸（10∶1）混合液 90 mL，稱定質(zhì)量，超聲（250 W，50 kHz）提取60 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇 － 鹽酸（10 ∶1）混合液補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：按處方比例分別稱取除大黃、除黃芩和除甘草以外的其余中藥材，按金振口服液的制備工藝分別制備缺大黃、缺黃芩和缺甘草的陰性樣品，并按供試品溶液的制備及測(cè)定方法進(jìn)行處理和測(cè)定。結(jié)果陰性樣品溶液色譜中，在與供試品溶液色譜中黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、甘草酸、大黃素和大黃酚相應(yīng)保留時(shí)間位置上未見(jiàn)色譜峰，說(shuō)明其他藥材對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：取混合對(duì)照品貯備液 5，2，1，0.5，0.2，0.1 mL，分別置 10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制得6個(gè)質(zhì)量濃度的系列混合對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品的進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)、峰面積值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 線性關(guān)系、定量限和檢測(cè)限考察結(jié)果（n＝6）

檢測(cè)限和定量限考察：將黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、甘草酸、大黃素和大黃酚的混合對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋后進(jìn)樣分析，當(dāng)信噪比(S／N)為10時(shí)，計(jì)算各成分定量限（LOQ），S／N為3時(shí)測(cè)定各成分檢測(cè)限（LOD）。結(jié)果見(jiàn)表1。

精密度試驗(yàn)：精密量取同一混合對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)定其峰面積。結(jié)果黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、甘草酸、大黃素和大黃酚含量的 RSD分別為 1.36% ，0.98% ，1.28% ，1.15% ，0.96% ，1.19%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為160721），按供試品溶液制備方法制備溶液，室溫放置，分別于 0，1，3，5，8，12 h時(shí)進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積。結(jié)果黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、甘草酸、大黃素和大黃酚含量的 RSD分別為1.16% ，0.98%，1.13% ，1.40%，1.33% ，1.08%（n ＝6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密量取同一批（批號(hào)為160721）樣品，依法制備供試品溶液6份，測(cè)定含量。結(jié)果黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、甘草酸、大黃素和大黃酚的平均含量分別為 0.397 5，0.126 2，0.185 8，0.397 6，0.499 8，0.587 0 g／L， RSD 分 別 為 1.07% ，1.05% ，1.12% ，0.99%，1.15%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取已知含量的樣品（批號(hào)為160906）內(nèi)容物 5 mL，共 9份，每3份1組，分別精密加入上述混合對(duì)照品貯備液3 mL和甲醇－鹽酸（10∶1）混合液92 mL，混合對(duì)照品貯備液5 mL和甲醇－鹽酸（10∶1）混合液90 mL，混合對(duì)照品貯備液8 mL和甲醇－鹽酸（10∶1）混合液87 mL，按擬訂色譜條件進(jìn)行測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

2.4 樣品含量測(cè)定

依法對(duì)3批樣品中的黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、甘草酸、大黃素和大黃酚含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 3批樣品含量測(cè)定結(jié)果（g／L）

3 討論

3.1 提取條件選擇

[8]，比較了加熱回流法、冷浸提取法和超聲提取法3種方法，分別以甲醇、70%甲醇溶液、甲醇－鹽酸（10∶1）混合液和甲醇 － 鹽酸（10∶1）混合液為提取溶劑，分別提取 30，45，60，80 min，結(jié)果表明，甲醇 － 鹽酸（10∶1）混合液超聲提取60 min后黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、甘草酸、大黃素和大黃酚的提取效率最高。

3.2 流動(dòng)相選擇

有機(jī)相曾比較甲醇和乙腈，結(jié)果在相同梯度條件下使用甲醇作有機(jī)相，目標(biāo)化合物能獲得更好的分離效果。水相比較了0.1%磷酸溶液和0.05%磷酸溶液，結(jié)果表明，使用0.05%磷酸溶液作水相，目標(biāo)化合物各色譜峰出峰時(shí)間適宜且分離度和峰形均明顯優(yōu)于0.1%磷酸溶液。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

根據(jù)黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、甘草酸、大黃素和大黃酚紫外吸收掃描結(jié)果，為進(jìn)一步提高測(cè)定的靈敏度和準(zhǔn)確性，本研究中采用了檢測(cè)波長(zhǎng)切換技術(shù)，選擇在黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、甘草酸、大黃素和大黃酚的最大吸收波長(zhǎng)處進(jìn)行檢測(cè)，即280 nm（0～15.0 min，黃芩苷），254 nm（15.0 ～35.0 min，蘆薈大黃素、大黃酸），237 nm（35.0 ～39.8 min，甘草酸），254 nm（39.8 ～50.0 min，大黃素、大黃酚）。

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Simultaneous Determination of 6 Components in Jinzhen Oral Solution by HPLC

Yang Zhihui1,Cheng Cheng1,Yao Qing2
(1.Lianyungang Institute for Drug Control,Lianyungang,Jiangsu,China 222006; 2.Jiangsu Kangyuan Pharmaceutical Company Limtied,Lianyungang,Jiangsu,China 222001)

Objective To establish an HPLC method for simultaneous determination of baicalin,aloeemodin,rhein,glycirrizic acid,emodin and chrysophanol in Jinzhen Oral Solution.Methods The chromatographic column was Phenomenex C18column(250 mm × 4.6 mm,5 μm),the mobile phase was methanol(A)－ 0.05% phosphoric acid solution (B)with gradient elution,the flow rate was 1.0 mL ／min,the column temperature was 30 ℃ ,the detection wavelength was 280 nm for baicalin(0－15.0 min),254 nm for aloeemodin and rhein(15.0 － 35.0 min),237 nm for glycirrizic acid(35.0 － 39.8 min),254 nm for emodin and chrysophanol(39.8 － 50.0 min).Results The linear range of baicalin,aloeemodin,rhein,glycirrizic acid,emodin and chrysophanol were 0.043 2 －2.162 5 μg,0.012 8 － 0.638 0 μg,0.018 5 － 0.926 0 μg,0.035 8 － 1.792 5 μg,0.049 8 － 2.488 0 μg,0.052 9 － 2.643 5 μg,respectively.The average recovery rates were 98.84%,99.49%,99.89%,100.31%,99.55%,99.54%,respectively,theRSDs were 1.10%,1.03%,1.49%,1.23%,0.98%,1.19%(n ＝ 9).Conclusion This method is simple and fast,which can be used for quality control of Jinzhen Oral Solution.

HPLC;Jinzhen Oral Solution;baicalin;aloeemodin;rhein;glycirrizic acid;emodin;chrysophanol

R284.1；R286

A

1006－4931(2017)23－0022－04

10.3969 ／j.issn.1006 － 4931.2017.23.007

楊智慧，女，大學(xué)本科，研究方向?yàn)樗幬锓治觯娫挘?518－85836780（電子信箱）814120942＠qq.com。

2017－07－10；

2017－08－31)