蛋殼膜對生產肉雞抗病力和免疫力的影響

方紹培,劉晨龍,堯國榮,朱錢龍,文 虹,鄒志恒,熊立根*

(1.江西省農業科學院 畜牧獸醫研究所,江西 南昌 330200;2.江西農業工程職業學院,江西 樟樹 331200;3.江西省獸藥飼料監察所,江西 南昌 330029)

蛋殼膜對生產肉雞抗病力和免疫力的影響

方紹培1,劉晨龍1,堯國榮2,朱錢龍2,文 虹3,鄒志恒1,熊立根1*

(1.江西省農業科學院 畜牧獸醫研究所,江西 南昌 330200;2.江西農業工程職業學院,江西 樟樹 331200;3.江西省獸藥飼料監察所,江西 南昌 330029)

將蛋殼膜按不同比例添加于肉雞的日糧中,分析了其對肉雞免疫力和接種禽流感H5N1-H9N2二價疫苗后抗體水平的影響。結果表明：蛋殼膜能夠顯著提高雞血清總蛋白和白蛋白濃度以及H5N1-H9N2抗體水平。說明蛋殼膜對雞的免疫力有增強作用,能夠作為一種功能性飼料添加劑用于提高肉雞的抗病力和免疫力。

蛋殼膜；肉雞；抗病力；免疫力

蛋殼是種禽場的主要副產品之一,由表面鈣化的外殼和外殼下面的一層蛋白膜(殼膜)組成。蛋殼膜(Eggshell Membranes, ESM)是一種主要由膠原蛋白和角蛋白組成的纖維結構蛋白。此外, 蛋殼膜還包括一些具有抗菌、抗氧化和免疫調節功能的蛋白或多肽,比如溶菌酶、轉鐵蛋白、卵清蛋白、卵黏蛋白和防御素等[1]。其中許多蛋白質在功能上類似于乳蛋白,可以對新生兒出生后起到保護作用,幫助腸道微生物的形成以及腸道的成熟等[2-3]。抗菌多肽不僅可以抵御大部分的細菌和真菌等微生物,還可以發揮佐劑功能,增強對外源抗原的抵抗力[4]。本研究在肉雞日糧中添加不同量的ESM,分析了ESM對增強肉雞抗病力的作用；同時通過檢測接種禽流感H5N1-H9N2雙價疫苗后的抗體水平來分析ESM對肉雞免疫力的影響,以期為蛋殼膜功能性飼料添加劑探索更廣闊的應用前景。

1 材料與方法

1.1實驗動物及其飼養

本研究隨機選取90日齡左右的地方雞種修水翻毛雞,于江西省農業科學院畜牧獸醫研究所地方雞飼養中心進行網上飼養。將實驗雞隨機分為4組:對照組、試驗組Ⅰ、試驗組Ⅱ以及試驗組Ⅲ,每組8只雞,并且每組3個重復。試驗組與對照組肉雞的基礎日糧相同,試驗組Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分別在基礎日糧中添加0.25%、0.50%和0.75%的蛋殼膜。使用破碎機對蛋殼膜進行破碎,破碎后蛋殼膜大小為60～80目。

1.2血清樣品的采集

首先對試驗雞進行7 d的預飼養,在預飼期的日糧中不添加蛋殼膜。7 d預飼后開始在日糧中添加不同劑量的蛋殼膜進入正式試驗。在飼喂試驗飼養7 d后對各組肉雞接種禽流感二價疫苗(H5N1-H9N2),按說明用量與方法接種。于接種疫苗后14 d、21 d和28 d分3次通過翅靜脈法進行血液的采集。血液采集后在室溫下靜置2 h,待析出血清后在離心機內用3000 r/min的轉速進行離心,將血清用移液槍吸出至新的1.5 mL離心管內,置于-20 ℃冰箱保存備用。

1.3血清生化指標的檢測

本研究所測血清生化指標有血清總蛋白、白蛋白和免疫球蛋白。使用南京建成生物工程研究所的檢測試劑盒進行檢測。

血清總蛋白采用BCA法進行定量。首先將血清樣品用生理鹽水稀釋50倍,然后按照試劑盒說明書配制好工作液。在96孔V型微量反應板中每孔加入250 μL工作液,然后在空白孔、標準孔和測定孔中分別加入雙蒸水、標準品(563 μg/mL)以及待測樣本各10 μL,混勻,在37 ℃下孵育30 min,最后使用酶標儀在波長562 nm處測定各孔的吸光度值。總蛋白濃度的計算公式為:總蛋白濃度(μg/mL)=[(測定孔的OD值-空白孔的OD值)/(標準孔的OD值-空白孔的OD值)]×標準品濃度563 μg/mL×樣品測試前稀釋倍數。

血清白蛋白使用微量酶標儀法進行測定。首先使用生理鹽水將血清樣品稀釋10倍,按照說明書配制好溴甲酚綠工作液。于96孔V型微量反應板中每孔加入250 μL工作液,然后在空白孔、標準孔和測定孔中分別加入雙蒸水、標準品以及待測樣本各10 μL,混勻,在室溫下靜置10 min,最后使用酶標儀在波長630 nm處測定各孔的吸光度值。白蛋白含量的計算公式為:白蛋白含量(g/L)=[(測定孔的OD值-空白孔的OD值)/(標準孔的OD值-空白孔的OD值)]×白蛋白標準品濃度3.48 g/L。

血清免疫球蛋白(IgG)使用免疫比濁法進行測定。先在96孔V型微量反應板中每孔加入225 μL試劑R1,然后在空白、標準和測定孔中分別加入2 μL雙蒸水、標準液和樣品，混勻,在37 ℃下孵育3～5 min,使用酶標儀讀取吸光度A0；然后分別加入75 μL試劑R2,在37 ℃下孵育5 min,讀取吸光度A1,計算ΔA=A1-A0。使用多點定標曲線logit-log(4p)進行處理,用測定管的ΔA計算IgG含量。

1.4血凝(HA)和血凝抑制(HI)實驗

按照常規血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗方法進行禽流感H5和H9抗體的檢測,計算每個個體的效價。

1.5實驗數據統計與分析

使用EXCEL進行實驗數據的整理；使用R軟件(https://www.r-project.org/)對實驗數據進行統計分析(t檢驗),顯著性閾值設定為P≤0.05。

2 結果與分析

2.1血清總蛋白測定結果

本研究在接種禽流感疫苗后第14、21和28天進行血清總蛋白的測定,結果見圖1。

圖中“*”表示P≤0.05。下同。

從圖1中可以看出：在接種禽流感疫苗14 d后(A),3個添加殼膜試驗組的總蛋白濃度均比對照組要高,而且隨著殼膜添加量的增加,總蛋白濃度也相應增加,但是差異不顯著；接種21 d后(B),3個試驗組的總蛋白濃度同樣都比對照組高,其中添加0.25%殼膜量的試驗組濃度最高；接種28 d后(C),3個試驗組的總蛋白濃度仍然比對照組高,且0.25%添加量和0.75%添加量試驗組的總蛋白濃度均顯著高于對照組的(P=0.039和P=0.02)。說明添加不同量的殼膜能提高血清總蛋白濃度。

2.2血清白蛋白測定結果

從圖2可以看出,接種禽流感疫苗后第14、21和28天各試驗組的血清白蛋白濃度均比對照組高。具體來說，在接種疫苗14 d后(A),0.25%殼膜添加量試驗組的血清白蛋白濃度相對于對照組沒有顯著提高,而0.50%和0.75%殼膜添加量試驗組均有顯著提高(P=0.015和P=3.76×10-5)；在接種疫苗21 d后(B),0.25%殼膜添加量試驗組的血清白蛋白濃度較對照組沒有顯著提高,而0.50%和0.75%殼膜添加量試驗組均有顯著提高(P=0.0041和P=0.0035)；在接種疫苗28 d后(C),0.25%和0.50%殼膜添加量試驗組的血清白蛋白濃度較對照組沒有顯著提高,而0.75%殼膜添加量試驗組有極顯著提高(P=0.00018)。總體來說,殼膜添加量越多,血清白蛋白濃度越高。

圖中“**”表示P≤0.01,“***”表示P≤0.001。下同。

2.3血清免疫球蛋白測定結果

本研究使用免疫比濁法測定血清IgG濃度，計算得到ΔA(即A1-A0)。從表1中可以看到,在免疫接種14 d、21 d和28 d后,3個試驗組與對照組間的ΔA均無顯著性差異,說明添加殼膜對提高肉雞血清IgG濃度的作用不明顯。

2.4血清禽流感抗體H5N1和H9N2效價測定結果

使用HI和HA的方法進行禽流感抗體的檢測,以抗體效價的log2的平均值進行統計分析,結果如圖3和圖4所示。

表1 試驗組與對照組的ΔA平均值

縱坐標為抗體效價的log2計算值。

從圖3中可以看出：在接種疫苗14 d后(A),3個試驗組的H5N1抗體效價均較對照組沒有顯著提高；在接種21 d后(B),0.75%殼膜添加組相比于對照組,H5N1抗體效價顯著提高(P=0.01944),說明殼膜在接種疫苗21 d后開始起到提高雞血清H5N1抗體水平的作用；在接種28 d后(C),3個試驗組相比于對照組,H5N1抗體效價均有顯著提高(P值分別等于0.0121、0.0001968、0.003293)。上述結果說明殼膜能夠提高雞血清H5N1抗體水平,而且其效果隨著殼膜添加量(0.75%以內)的增加和使用時間的延長而提高。

從圖4中可以看出：在接種疫苗14 d后(A),0.50%和0.75%殼膜添加組的H9N2抗體效價均較對照組顯著提高(P=0.006128和P=0.002476)；在接種21 d后(B)和28 d后(C),只有0.75%殼膜添加組的H9N2抗體效價較對照組有顯著提高(P=0.01105和P=0.0283)。表明添加低劑量水平的殼膜對H9N2抗體水平的提高作用不大,只有較高劑量(0.75%)的添加量才能提高雞血清H9N2抗體水平。

縱坐標為抗體效價的log2計算值。

3 討論

已有研究表明,有生長缺陷的雞的雞蛋副產品能夠改善家畜的營養水平[7-8]。目前對ESM的利用主要在化妝品[9]、蛋殼膜美容保健奶[10]、中醫藥(即鳳凰衣)[11]以及治療角膜潰瘍[12]等方面,而作為功能性飼料添加劑研究其對家禽抗病力和免疫力的影響尚未見報道。ESM含有大量的免疫調節蛋白或多肽[1,13-14]。從本研究試驗結果來推測,ESM作為飼料添加劑對雞的生理機能具有調節作用,可以作為一種功能性飼料添加劑，用于提高肉雞的抗病力和免疫力。

在本研究所檢測的5個指標(總蛋白、白蛋白、IgG、H5N1效價和H9N2效價)中, ESM除了對提高血清IgG濃度無作用外,對其余4個指標均有不同程度的提高。血清總蛋白與雞體的免疫功能有著密切的關系；本研究在接種禽流感滅活疫苗后21 d內都未檢測到血清總蛋白濃度的提高,只是在接種后28 d檢測到有提高,說明ESM對提高接種禽流感疫苗后雞體內的總蛋白濃度的作用不大。血清白蛋白具有物質結合和轉運功能,能結合許多內源性和外源性化合物,與藥物、營養物質的給予和療效、解毒和抗氧化作用密切相關,其能結合的藥物有抗生素和免疫抑制劑等[15]。因此雞體血清白蛋白濃度的增加有利于結合抗生素或免疫抑制劑,減少抗生素對雞體的影響或者防止雞體免疫力被抑制。本研究發現,在接種疫苗28 d后,3個試驗組的H5N1效價都顯著高于對照組的,其中0.50%添加量組的效價最高,說明0.50%的殼膜添加量是合適添加量；另外，蛋殼膜對雞體內H9N2抗體水平的提高只在接種疫苗后的前期有較明顯的作用,隨著時間的推移,其作用越來越小。總體來說，蛋殼膜能夠提高雞體H5N1、H9N2抗體水平,抵抗禽流感的感染。

綜上所述，蛋殼膜在一定程度上可以增強雞體的抗病力和免疫力，可以作為一種功能性飼料添加劑用于肉雞的飼養。但本研究只分析了蛋殼膜對H5N1型禽流感的防御力,是否會對其它型的禽流感具有相同作用,還需進行進一步的研究。

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(責任編輯:黃榮華)

EffectsofEggshellMembraneonDiseaseResistanceandImmunityofChickens

FANG Shao-pei1, LIU Chen-long1, YAO Guo-rong2, ZHU Qian-long2,WEN Hong3, ZOU Zhi-heng1, XIONG Li-gen1*

(1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang 330200, China; 2. Jiangxi Vocational College of Agricultural Engineering, Zhangshu 331200, China; 3. Jiangxi Provincial Institute of Veterinary Medicine and Feed Supervision, Nanchang 330029, China)

Different ratios of eggshell membrane (ESM) was added into the diet of chickens, and the effects of ESM on the immunity of chickens and their antibody level after inoculating avian influenza H5N1-H9N2 bivalent vaccines were analyzed. The results showed that ESM could significantly enhance the concentration of serum total protein and serum albumin, as well as the H5N1-H9N2 antibody level in chickens. Therefore, ESM can strengthen the immunity of chickens, and can be used as functional feed supplement to improve the disease resistance and immunity of chickens.

Eggshell membrane; Chicken; Disease resistance; Immunity

S831.9

A

1001-8581(2017)12-0077-05

2017-08-15

江西省科技計劃項目(20151BBF60065)。

方紹培(1972─),男,畜牧獸醫師,研究方向為畜禽健康養殖與疾病防治。*通訊作者:熊立根。