3種因素對蘭州百合不定芽誘導的影響

段四喜，徐春蓮，湯王外，畢海林，和桂青，和壽星

(云南省農業科學院 高山經濟植物研究所，云南 麗江 674100)

3種因素對蘭州百合不定芽誘導的影響

段四喜，徐春蓮，湯王外，畢海林，和桂青，和壽星*

(云南省農業科學院 高山經濟植物研究所，云南 麗江 674100)

為建立蘭州百合試管苗規范化生產技術體系，以蘭州百合鱗片為外植體，MS為基本培養基，對外植體消毒時間、鱗片放置方式，以及初代、繼一代和繼二代激素α-萘乙酸(NAA)和6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)濃度等影響不定芽產生的3個主要因素進行研究。結果表明:0.1%的氯化汞最佳滅菌時間12 min，與鱗片內側相比，鱗片外側小突起、不定芽、小突起+不定芽個數也均以12 min消毒處理效果最佳；與鱗片外側和近軸面向上放置相比，鱗片內側和近軸面向下放置更有利于芽的誘導；最佳誘導和繼一代培養基均為MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L，誘導培養30 d左右后不定芽數達7.00個，轉綠率和發芽率分別為80.83%和55.00%；繼一代發芽率和生葉率最高時可達45.02%和78.00%；蘭州百合繼二代培養時適當降低6-BA濃度，不僅不影響組培苗正常的生長發育，反而使葉片數和不定芽數達到23.67片和5.67個，以MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L為適宜培養基。

蘭州百合；不定芽；繼代；NAA；6-BA

蘭州百合(Liliumdavidiivar.unicolor)是百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)多年生球根作物，屬單子葉草本植物，其鱗莖瓣厚、豐潤、口感甜美、藥食同源，具有很高的營養價值和經濟價值[1]。目前借助組織培養技術，采用試管內形成鱗莖，在獲得大量幼苗的同時，還有利于保持親本的優良性狀，降低苗木抗病毒的幾率，已成為許多研究者所探索的快速繁殖的方法[2-5]。在蘭州百合組培過程中外植體滅菌時間[6-7]、鱗片放置方式[8-9]、激素種類和濃度(尤其是NAA、6-BA)[10-11]等3個因素是影響蘭州百合組培的關鍵因素。

截至目前，滅菌時間對蘭州百合鱗片影響的研究多傾向于與外植體成活率或污染率有關[6-7]，鮮有提及與鱗芽誘導的多少有關；鱗片放置方式對不定芽多少的影響幾乎沒有選用任何數據統計分析方法，局限性較多且缺乏客觀性；在組培過程中往往將蘭州百合組培分為初代、繼代和生根3個階段，并對3個階段的NAA和6-BA激素濃度進行了大量的研究[12-13]。而事實上，繼代培養通常需要連續多代的培養，在整個組培過程中占據的比例大、周期長[14-16]，隨著植物繼代次數的延長，植物體內源激素、營養物質、生化物質、染色體等會發生變化[16-18]，在這個動態變化的過程中添加在培養基中的激素濃度是否有必要適時調整呢？基于此，本試驗的目的一是探討初代鱗片滅菌時間與鱗芽誘導的關系；二是采用更加科學合理的數據統計方法篩選適宜的鱗片放置方式；三是對蘭州百合初代和不同繼代次數間的NAA和6-BA濃度是否需要調整進行研究。旨在找到獲得高質量蘭州百合試管苗的培養條件，從而提高蘭州百合再生植株的效率，為蘭州百合組織培養和種質資源的保存奠定技術基礎。

1 材料與方法

1.1試驗時間和地點

于2015年5月開始在云南省農業科學院高山經濟植物研究所組培室進行鱗片組織培養。

1.2試驗材料

1.2.1 材料 材料為蘭州百合鱗莖，采集于麗江市龍山鎮百合基地。選擇鱗片保持完好、抱合緊密、健壯、無病斑、色澤光亮、無機械損傷、鱗莖盤無損壞的蘭州百合作為供試材料。

1.2.2 培養條件 先在4 ℃冰箱中保存30 d，之后采用固體MS培養基，培養基中蔗糖30 g/L，瓊脂7 g/L，將pH值調節為5.8，根據試驗要求添加不同濃度的NAA和6-BA，121 ℃高壓滅菌25 min,接種后放到培養室中培養，培養溫度為(25±2) ℃，日光燈光源，光照強度2000 lx，光照時間16 h/d。

1.3試驗方法

1.3.1 最佳滅菌時間的篩選 除去內外層鱗片，將中層健康的鱗片置于小燒杯中，自來水流水沖洗干凈后放入超凈工作臺，用75%的酒精浸泡30 s，無菌水沖洗4次，再分別用濃度為0.1%的氯化汞溶液滅菌6、9和12 min(前期試驗表明，0.1%的氯化汞消毒時間在6 min以下時外植體污染率較多高，在12 min以上時外植體死亡率較多，所以試驗采用6、9和12 min處理觀察鱗片滅菌效果)，無菌水沖洗5～6次，在滅菌濾紙上吸干表面水分，之后用鑷子切成1 cm×1 cm大小，接種于MS+NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.1 mg/L的誘導培養基上。每瓶接種1個外植體，每處理均接種30個外植體，重復3次。通過接種后30 d左右統計不定芽、小突起、不定芽+小突起個數確定最佳滅菌時間。

1.3.2 最佳鱗片放置方式的篩選 在篩選出氯化汞最佳消毒時間的基礎上，將鱗片分為近軸面向上和近軸面向下2個處理接種于MS+NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.1 mg/L的培養基。每瓶接種1個外植體，每處理接種30個外植體，重復3次。通過每隔一段時間觀察記錄外植體的成活率、轉綠率和發芽率，接種后30 d左右統計不定芽、小突起、不定芽+小突起個數確定最佳的鱗片放置方式。

1.3.3 最佳誘導培養基的篩選 在最佳氯化汞消毒時間和鱗片放置方式的基礎上，放到MS附加不同濃度的NAA和6-BA的培養基上進行培養，即放到MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L、MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L、MS+NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.1 mg/L 3個處理進行培養，并分別記為A、B、C等3個處理，每瓶接種1個外植體，每處理接種30個外植體，重復3次。通過每隔一段時間觀察3個處理，并記錄轉綠率和發芽率，接種后30 d左右統計不定芽和小突起個數，選出最佳誘導培養基。

1.3.4 最佳繼一代培養基的篩選 從初代培養生長健壯的蘭州百合試管苗中篩選長勢基本一致的幼苗，將其進行切割，每瓶接種4個點，放到MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L、MS+NAA 0.5 mg/L+MS+6-BA 0.5 mg/L和MS+NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.1 mg/L 3個處理進行培養，并分別記為A、B、C，每處理接種30瓶，重復3次。通過每隔一段時間觀察3個處理，并記錄發芽率和生葉率篩選出最佳繼一代培養基。

1.3.5 最佳繼二代培養基的篩選 從繼一代培養生長健壯的蘭州百合試管苗中篩選長勢基本一致的幼苗，將其進行切割，每瓶接種4個點，接種到MS培養基中，3個處理的NAA濃度均為0.1 mg/L，6-BA濃度分別為0.50、0.75和1.00 mg/L，每處理接種30瓶，重復3次。通過每隔一段時間觀察并記錄發芽率、生葉率、葉片數和不定芽數篩選出最適宜的繼二代培養基。

1.3.6 相關計算公式 外植體轉綠率/%=(轉綠個數/未污染的外植體總數)×100%

外植體發芽率/%=(發芽的個數/未污染的外植體總數)×100%

外植體生葉率/%=(長葉個數/未污染的外植體總數)×100%

1.4統計分析

采用Microsoft Excel 2003和SPSS軟件統計分析數據。

2 結果與分析

2.1不同滅菌時間對蘭州百合鱗片滅菌效果的影響

由表1可知，在不同消毒時間內，鱗片內側小突起、不定芽和小突起+不定芽個數均明顯高于鱗片外側，說明鱗片內側更有利于蘭州百合外植體的誘導。小突起和不定芽比較而言，無論內側、外側或整個外植體，小突起個數均明顯高于不定芽。盡管消毒時間存在差異，但是不定芽個數除鱗片內側12 min消毒處理低于6、9 min消毒處理外，小突起以及小突起+不定芽個數在鱗片內側和整個外植體間均無顯著差異。在鱗片外側，小突起、不定芽、小突起+不定芽個數均以12 min消毒處理效果最佳，與6、9 min消毒處理相比差異顯著，而6、9 min處理間則無顯著差異。綜合來看，12 min消毒處理最有利于芽的誘導形成。

表1 消毒時間對芽誘導形成的影響 個

注：同列數據中不同小字母表示同一項目差異達到顯著水平(Plt;0.05)，相同則不顯著(Pgt;0.05)。下同。

2.2鱗片放置方式對蘭州百合初代鱗片誘導的影響

由表2可知，不同鱗片放置方式的外植體成活率在接種后17、34 d時差異顯著，在接種后13、27 d時差異不顯著。各個階段外植體的成活率除接種后34 d為近軸面向下略高于近軸面向上外，其余均為近軸面向下略低于向上。無論近軸面向上或者向下放置轉綠率和發芽率無顯著差異，均以近軸面向上略高于向下。

由表3可知，接種后30 d左右，小突起、不定芽、小突起+不定芽3個指標除鱗片外側小突起、小突起+不定芽個數間有顯著差異為近軸面向上高于向下外，其余指標間均無顯著差異。但是無論是鱗片內側還是整個外植體，小突起、不定芽、小突起+不定芽個數均以近軸面向上略高于向下，近軸面向上更有利于蘭州百合芽誘導。鱗片內側與外側比較而言，鱗片外側僅在近軸面向上有少量小突起，因此鱗片內側更有利于蘭州百合芽誘導。培養30 d左右不定芽數量明顯增加，不定芽增殖方式為近軸面向上遠高于向下(圖1)。

表2 放置方式對誘導芽發生幾率的影響 %

注：/表示無相應情況發生。下同。

表3 放置方式對芽誘導形成的影響 個

2.3不同激素濃度對蘭州百合初代鱗片分化的影響

由圖2可知，從接種后6 d開始，外植體便開始陸續轉綠。在接種后6～16 d的轉綠率大小表現為Cgt;Agt;B，16～33 d則表現為Bgt;Cgt;A。接種后9 d時開始芽誘導便陸續發生，在接種后6～26 d不定芽誘導率以B處理的最高，在接種30 d后則表現為Cgt;Agt;B。小突起、不定芽、小突起+不定芽個數均以A處理的效果最好，分別比B、C處理增加1.85、15.67，4.19、4.67，2.39、8.06倍(表4)。由此可知，蘭州百合初代鱗片分化以MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L為適宜培養基。

1和2分別為近軸面向上和向下誘導30 d左右蘭州百合鱗片的生長情況。

圖2 激素濃度對初代苗轉綠率和發芽率的影響

表4 激素濃度對初代苗芽誘導的影響 個

2.4不同激素濃度對蘭州百合繼一代的影響

由圖3可知，在繼代接種10 d時發芽率最高，之后便不斷下降，以接種后10～17 d的下降趨勢最快，17 d以后變化平緩。從接種后10 d開始，3個處理的生葉率便不斷增多，以A處理的生葉率最高，繼一代接種10、17、27 d，A處理的生葉率分別比B和C處理高40.73%、54.6%，26.24%、32.54%和23.61%、13.00%。另外，在接種后20、30 d左右，3個處理的長勢均以A處理最好，B處理次之，C處理較差(圖4)。因此，蘭州百合繼代培養基以MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L為最佳培養基。

2.5不同激素濃度對蘭州百合繼二代的影響

由圖5可知，在整個繼二代增殖階段接種后13 d的發芽率最高，隨著接種后時間的延長，3個處理均呈現發芽率由多變少，生葉率由少變多的趨勢，到接種后38 d,株苗生長狀態幾乎完全變為生葉，生葉率高達100.00%，葉片數和不定芽數也隨著不斷增多(表5)。但是數目卻有一定的差別,其中尤以6-BA 0.50 mg/L處理的效果最佳，葉片數和不定芽數也均較多。尤其是在接種后30 d左右，這種現象更為明顯(圖6)。6-BA濃度的減少不僅不影響百合鱗片的增殖擴繁，反而在一定程度上增加了葉片數的和不定芽數，節約了成本，增加了經濟效益，而且更有利于蘭州百合的增殖快繁。因此，蘭州百合繼二代增殖培養以MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L為適宜培養基。

3 討論與結論

植物離體快繁體系建立的首要條件是獲得活性的無菌材料，其中消毒時間的選擇具有至關重要的作用[6-7,19]。本試驗研究結果表明，0.1%氯化汞消毒處理12 min效果最佳，不定芽+小突起個數高達15.67個。有關卷丹[8]、毛百合[9]、蘭州百合[20]等的研究結果表明：鱗片近軸面向上放置更有利于百合鱗片的誘導，這與本試驗研究結果一致。但本試驗首次采用差異顯著性統計檢驗，更加科學合理地說明鱗片近軸面向上放置更有利于百合鱗片的誘導，不定芽+小突起個數高達14.00個。

圖3 激素濃度對繼一代苗發芽率和生葉率的影響

1、2分別表示接種后20、30 d左右的長勢。

圖5 激素濃度對繼二代苗發芽率和生葉率的影響

項目6-BA濃度/(mg/L)接種后天數/d1317233138葉片數0.5012.67±2.36a14.00±0.94a15.00±1.41a23.33±6.13a23.67±1.89a0.757.67±0.94a10.33±0.47a11.67±0.94a12.00±2.36a19.67±9.42a1.005.67±4.24a8.33±0.94a9.67±2.83a10.67±3.77a16.33±2.83a不定芽數0.504.00±0.00a3.67±0.00a3.33±0.47a5.00±0.47a5.67±0.94a0.752.67±0.00b3.00±0.47a2.67±0.47a3.00±0.47b4.00±1.41a1.002.67±0.47b2.33±0.47a2.67±0.47a3.33±0.47ab3.00±0.47a

組織培養中內源激素的形成速度慢，一般無法滿足植株生長需求，因此，植物生長物質的使用是誘導植物分化芽和根的關鍵因素[21]。培養基中加入不同量的NAA和6-BA，對外植體不定芽的分化率及分化鱗片數具有明顯的影響[22]。在蘭州百合組培過程中，適宜誘導和繼一代培養基均為MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L，誘導培養30 d左右不定芽個數高達7.00個，龍春林等[23]的研究結果也表明：誘導培養與增殖培養基可均為MS+NAA 0.2 mg/L+6-BA 2.0 mg/L但是在與本試驗產出一致的情況下(不定芽個數均為7.00個)，激素濃度卻增加了一倍，反而增加了成本，降低了產投比。本試驗初代誘導與胡友軍等[13]所采用的激素濃度相同，但不定芽數卻增多3.7～7.5倍左右，應與胡友軍等[13]用0.1%氯化汞消毒時間15 min過多和未篩選最佳鱗片放置方式致使有些不定芽無法誘導形成有關。另外，張紅巖等[20]采用MS+6-BA 1.5 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L+GA30.8 mg/L培養基，盡管出芽較多，但激素種類偏多，所用6-BA濃度比本試驗還高出1.5倍。本試驗盡管在繼一代培養中未統計不定芽數，但是發芽率和生葉率最高時可達45.02%和78.00%，且從圖4長勢來看不定芽數可達5左右。崔興林等[12]盡管以較低的6-BA濃度，使誘導倍數達4.5倍，但是由于未采用數據分析方法，研究結果局限性較多且缺乏客觀性。蘭州百合繼二代培養時適當降低6-BA濃度，不僅不影響組培苗正常的生長發育，反而使葉片數和不定芽數有所增加，發芽率、生葉率、葉片數和不定芽數可達44.49%、100%、23.67片和5.67個，所以蘭州百合繼二代培養以MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L為適宜培養基。因此，上述3種提高不定芽產生的方式甚為合理。但誘導與繼一代培養激素濃度需相同，繼二代6-BA濃度則稍有降低的原因尚需進一步進行研究。

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(責任編輯：曾小軍)

EffectsofThreeFactorsonInducementofAdventitiousBudsinLanzhouLily(Liliumdavidiivar.unicolor)

DUAN Si-xi, XU Chun-lian, TANG Wang-wai, BI Hai-lin, HE Gui-qing, HE Shou-xing*

(Institute of Alpine Economic Plant, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Lijiang 674100, China)

In order to establish the standardized production technology system of Lanzhou lily (Liliumdavidiivar.unicolor) test-tube plantlets, the author took the scale of Lanzhou lily as the explant, used MS as the basic culture medium, and studied the effects of three factors (explant sterilization time, mode of placing scales, and concentration of NAA and 6-BA) on the inducement of adventitious buds. The results showed that the optimum time of explant sterilization with 0.1% HgCl2was 12 min, and the number of both small protuberances and adventitious buds in the outside of scale was the highest under this condition. Placing scale with downward adaxial side was more advantageous to the inducement of adventitious buds than placing scale with upward adaxial side. The optimum medium for both the inducement and the first subculture of adventitious buds was MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L; after inducement culture for about 30 days, the number of adventitious buds reached 7.00, and the green-turning rate and germination rate were 80.83% and 55.00%, respectively; in the first subculture, the germination rate and leaf-producing rate could reach 45.02% and 78.00%, respectively. The best medium for the second subculture of Lanzhou lily was MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L, and the number of leaves and adventitious buds reached 23.67 and 5.67 separately under this condition.

Lanzhou lily; Adventitious bud; Subculture; NAA; 6-BA

S644.1

A

1001-8581(2017)12-0047-06

2017-08-29

段四喜，女，碩士研究生，主要從事植物組織培養研究。*通訊作者：和壽星。