阿江欖仁酸對LPS誘導的小鼠RAW264.7巨噬細胞的抗炎作用初步研究

權洪峰+閆欣+彭曉東

摘要：目的 探討阿江欖仁酸對脂多糖（LPS）誘導的炎癥反應的抗炎作用。方法 分別以5 μg/ml LPS和1、5、10、20、40、80和160 μmol/L阿江欖仁酸加入小鼠RAW 264.7細胞培養液培養24 h。采用MTT法測定細胞活力，Griess法檢測一氧化氮（NO）的含量，ELISA法檢測TNF-α和IL- 6水平。結果 阿江欖仁酸劑量在80 μmol/L時對細胞生存力無顯著影響。阿江欖仁酸可顯著降低LPS引起的NO，TNF-α和IL-6水平的升高。結論 阿江欖仁酸對LPS誘導的炎癥反應有抗炎作用。

關鍵詞：阿江欖仁酸；炎癥；一氧化氮；TNF-α

中圖分類號：R96 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1959（2017）23-0030-03

Preliminary Study on the Anti-inflammatory Effect of Azartipic Acid on LPS-induced Mouse RAW264.7 Macrophages

QUAN Hong-feng1，YAN Xin2，PENG Xiao-dong1

（1.School of Pharmacy，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，Ningxia，China；

2.Department of Pharmacy，the First People's Hospital of Yinchuan 750004；Ningxia，China）

Abstract：Objective To investigate the antiinflammatory effect of azartipic acid on lipopolysaccharide（LPS）induced inflammatory response.Methods The mice were cultured with 5 μg/ml LPS and 1，5，10，20，40，80 and 160 μmol/L azartiprofen acid respectively in RAW 264.7 cell culture medium for 24 h.The cell viability was determined by MTT assay.The content of nitric oxide（NO）was measured by Griess method，and the levels of TNF-α and IL-6 were detected by ELISA.Results There was no significant effect on the cell viability at 80 μmol/L.Azartic acid can significantly reduce the levels of NO， TNF-α and IL-6 induced by LPS.Conclusion Azinolinic acid has anti-inflammatory effect on LPS-induced inflammatory response.

Key words：Azartic acid；Inflammation；Nitric oxide；TNF-α

炎癥是一種應對感染或組織損傷的正常和有益的自我保護反應。在炎癥發生的初期，大量炎癥介質被釋放，最終使組織恢復正常結構和功能。然而，持續或慢性炎癥會繼發許多慢性疾病，如心血管疾病及糖尿病[1-3]。脂多糖（LPS）常用于建立體外巨噬細胞在炎癥模型進而評價天然產物的抗炎作用。LPS可誘導促炎細胞因子（TNF-α，IL-6）的表達，以及許多其他介質的高表達，如 NO[4-5]。三萜類化合物具有廣泛的生物活性，如降血糖、抗腫瘤及抗炎作用[6-7]。本課題深入研究了阿江欖仁酸的抗炎作用，旨在為其研發提供實驗依據。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1儀器 CO2恒溫培養箱（Thermo公司）；酶標儀（芬蘭雷勃酶標儀公司）；高速冷凍離心機（德國Eppendorf）。

1.1.2材料與試劑 阿江欖仁酸（CAS：465-00-9，上海源葉生物科技有限公司）小鼠RAW 264.7巨噬細胞株（中國科學院上海生命科學研究院）；青霉素/鏈霉素（南京凱基生物技術發展有限公司）；二甲亞砜（DMSO）（美國Corning公司）；MTT、LPS、Mouse NO試劑盒（美國Sigma公司）；Mouse TNF-α，IL-6 ELISA試劑盒（Bio Swamp公司）。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養 小鼠巨噬細胞RAW264.7培養于5% CO2、37 ℃培養箱中，用含100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素、10%熱滅活胎牛血清的RPMI-1640培養液傳代培養。實驗用細胞均處于對數生長期。細胞接種于96 孔培養板中，接種密度為1.5×104細胞/孔。實驗設計為空白對照組（不加LPS），模型對照組（加入LPS）、陽性對照組（雷公藤紅素，0.5 μmol/L）、阿江欖仁酸組（1，5，10，20，40， 80，160 μmol/L），培養24 h后，吸取上清液，檢測細胞生存率，以及NO、TNF-α和IL-6的水平。

1.2.2細胞生存率檢測 RAW 264.7細胞液接種于96孔培養板中，接種密度為1.5×104細胞/孔，貼壁生長24 h后，加入 5 μg/ml LPS和不同濃度阿江欖仁酸。培養24 h后，每孔加入20 μl MTT溶液，于37 ℃繼續培養4 h。4 h后棄掉MTT溶液，每孔加150 μl DMSO溶解沉淀，在570 nm測定OD值。endprint

1.2.3 Griess法檢測NO含量 RAW 264.7細胞液接種于96孔培養板中，接種密度為1.5×104細胞/孔，貼壁生長24 h。24 h后加入阿江欖仁酸（1，5，10，20，

40，80，160 μmol/L）、雷公藤紅素（0.5 μmol/L）并分別加入LPS（5 μg/ml）培養24 h。培養后在40 μl/孔的細胞上清液中加入40 μl的Griess反應試劑。在570 nm下測定OD值，計算NO含量。

1.2.4 ELISA法檢測TNF-α及IL-6表達量 按照試劑盒說明分別檢測TNF-α及IL-6的表達水平。

1.3統計學方法

實驗數據均以means±SD來表示，采用統計軟件SPSS19.0和作圖軟件Graphpad prism 5對所得數據進行統計與處理，統計方法采用單因素方差分析（One-way ANOVA），以P<0.05表示存在顯著性差異。

2 結果

2.1阿江欖仁酸藥物濃度的篩選

在加入LPS及不同給藥濃度后，以MTT法檢測阿江欖仁酸對細胞生存力的影響，結果顯示阿江欖仁酸不同濃度（0，1，5，10，20，40，80，160 μmol/L）處理組無統計學差異（見圖1），表明阿江欖仁酸濃度在80 μmol/L范圍內細胞生存力均>90%。

2.2阿江欖仁酸對 LPS誘導的 NO含量的影響

采用Griess法檢測NO的表達量。結果表明，加入LPS后的細胞液中NO的含量顯著升高，而阿江欖仁酸給藥組可以使升高的NO含量降低，并與劑量呈正相關性（P<0.05）。阿江欖仁酸給藥濃度為40 μmol/L和80 μmol/L時，對NO的含量的抑制率可達到50%（見圖2）。

2.3阿江欖仁酸對 LPS誘導的炎性細胞因子含量的影響

采用ELISA試驗檢測炎性細胞因子TNF-α和IL-6的表達量。結果顯示，加入LPS后的細胞液中TNF-α（見圖3A）和IL-6（見圖3B）的表達量顯著升高，而阿江欖仁酸給藥組能夠劑量依賴性地使升高的炎性細胞因子含量降低（P<0.05）。

3 討論

巨噬細胞是一種廣泛分布在炎癥中其重要作用的先天免疫細胞[8]。LPS通過其脂質成分可以作用于包括巨噬細胞在內的多種細胞，在LPS的誘導下，巨噬細胞被激活而導致炎癥介質（TNF-α，IL-6）的釋放[9]。因此，LPS-誘導RAW 264.7巨噬細胞產生炎癥反應的模型被廣泛用于抗炎藥物的篩選[10]。IL-6是一個潛在的炎性細胞因子介導許多重要的生理功能，特別是急性和慢性炎癥[11]。TNF參與多種細胞生理過程，包括細胞存活、細胞凋亡和壞死。在本研究中，LPS能促炎細胞因子TNF-α和IL-6的水平顯著增加，而阿江欖仁酸可逆轉由LPS引起的TNF-α和IL-6的高表達。這些結果表明，阿江欖仁酸對LPS誘導的小鼠RAW264.7巨噬細胞炎癥具有保護作用。

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