貴州省3個少數民族線粒體DNA 9 bp序列缺失頻率的分析研究

國學紅，何 燕，張旺德，王嬋娟，張 婷，官志忠

(地方病與少數民族性疾病教育部重點實驗室/貴州醫科大學分子生物學重點實驗室，貴陽 550004)

·調查報告·

貴州省3個少數民族線粒體DNA 9 bp序列缺失頻率的分析研究

國學紅，何 燕△，張旺德，王嬋娟，張 婷，官志忠

(地方病與少數民族性疾病教育部重點實驗室/貴州醫科大學分子生物學重點實驗室，貴陽 550004)

目的探討貴州省3個少數民族線粒體DNA(mtDNA)9 bp序列缺失頻率情況。方法隨機選取貴州省雷山縣苗族(69例)、荔波縣布依族(70例)、荔波縣水族(44例)共183例男性血液標本，應用PCR及直接測序檢測線粒體DNA 9 bp序列缺失情況。結果在貴州省3個少數民族樣本中發現標準型、缺失型、3型，缺失頻率最高為荔波縣水族(40.91%)，雷山縣苗族中檢出3型1例，3個少數民族群體間mtDNA 9 bp缺失頻率比較差異無統計學意義(Pgt;0.05)。結論3個世居少數民族mtDNA 9 bp 缺失頻率不同，水族的遺傳變異較大，水族與苗族的親緣關系相比水族與布依族較近。

貴州；布依族；水族；苗族；mtDNA

近年來，國內外學者利用分子生物學技術對線粒體DNA (mitochondrial DNA，mtDNA) 9 bp序列缺失標記做了一系列研究，結果發現該遺傳標記有助于了解人群的親緣關系和遷徙路線。mtDNA 9 bp序列缺失是指位于mtDNA COⅡ/tRNALys基因間小非編碼區RegionⅤ的2個串聯重復序列隨機發生一個拷貝序列丟失的現象，可能與DNA復制過程中滑鏈錯配有關，致使該區域核苷酸長度發生變化，最終形成4種多態：標準序列為2個串聯重復的 9 bp序列，長型為標準序列前加4個CCCC，缺失型為1拷貝 9 bp序列，3型為3個重復拷貝 9 bp序列[1]。缺失型是一種最常見的多態，在不同人群中分布比例不同。研究表明，mtDNA 9 bp序列缺失具有多重源性，在亞洲人、非洲人、歐洲人等均發現了mtDNA 9 bp序列缺失現象[2]。本文旨在通過對貴州省雷山縣苗族、荔波縣布依族、荔波縣水族的mtDNA 9 bp序列缺失頻率分布情況進行研究，并結合已報道的其他民族群體來分析該地區人群的母系遺傳結構特點，為相關的民族群體的起源和遷徙路線提供遺傳學數據。

1 資料與方法

1.1標本采集 根據知情同意原則，隨機選取貴州省雷山縣苗族(69例)、荔波縣布依族(70例)、荔波縣水族(44例)共183例男性血液標本，采血對象均3代內無族外通婚，彼此之間無直系親緣關系，每人取2 mL靜脈血，乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝。

1.2試劑 本試驗所用試劑均為國產分析純。血液基因組提取試劑盒、2×PCR Master Mix、96孔PCR反應板等購自北京天跟生化科技有限公司。PCR擴增引物合成和DNA序列測定由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

1.3儀器 2720 Thermal Cycler PCR儀(美國ABI公司)擴增目的基因片段,DU-640核酸蛋白分析儀(美國Beckman公司)檢測核酸的純度和濃度。電泳儀DYY-6C(北京六一儀器廠)和凝膠顯像儀(英國Syngene公司，G：BOX)用來分辨DNA片段長度大小。

1.4方法

1.4.1模板DNA提取 外周血提取試劑盒提取基因組DNA，每個DNA樣本取 2 μL加入 48 μL無菌雙蒸水進行25倍稀釋，紫外分光光度儀進行核酸定量，由A260和A280計算出DNA母液的濃度和純度，取少量的DNA進行模板標化至30 μL，標化濃度為30 ng/μL作為PCR的模板，于-20 ℃保存。

1.4.2mtDNA 9 bp的PCR擴增 根據文獻設計PCR引物序列，上游引物：5′-GCC CGT ATT ACC CTA TA-3′，下游引物：5′-GTA AAG AGG TGT TGG TTC-3′。PCR總反應體系為20 μL，無菌雙蒸水11.0 μL，2×PCR master mix 6.0 μL，上下游引物各1 μL，DNA模版1 μL。PCR循環參數為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性 40 s，54 ℃退火 30 s，72 ℃延伸40 s，共30個循環，最后72 ℃充分延伸5 min，4 ℃終止。PCR產物用2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色，電壓120 V，時間80 min。結果發現標準型、缺失型、3型，與之相對應的PCR產物片段長度為121、112、130 bp。

1.4.3mtDNA 9 bp的PCR產物測序 隨機選取標準型、缺失型、3型PCR擴增產物各6例交由上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定，測序結果與mtDNA修訂的劍橋標準序列進行比對。

1.5統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件進行處理。計數資料以率表示，采用χ2檢驗，以Plt;0.05為差異有統計意義。

2 結 果

2.1基本情況 貴州3個少數民族群體mtDNA 9 bp發現3種基因型:標準型、缺失型、3型，見圖1。本次研究的3個少數民族群體標準頻率依次為66.67%、75.71%、59.09%，缺失頻率依次為31.88%、24.29%、40.91%，差異無統計學意義(Pgt;0.05)；僅在苗族中發現3型，頻率為1.45%。

圖1 貴州3個少數民族mtDNA 9 bp 3種基因型頻率的分布

2.2mtDNA 9 bp PCR產物電泳圖譜 在PCR檢測中未發現非特異擴增，183例受檢者的電泳圖譜發現標準型125例，缺失型57例，3型1例，見圖2。被檢測的貴州3個少數民族群體樣本數依次為苗族69例、布依族70例、水族44例mtDNA 9 bp缺失個數分別為22、17、18個。

M:DNA標準分子量參照物；1:3型擴增產物；2、3:標準型擴增產物；4、5:缺失型擴增產物

圖2 mtDNA 9 bp PCR產物電泳結果

2.3序列測定結果 檢測的6例標準型PCR擴增產物的核酸序列與mtDNA COⅡ/tRNALys基因區的小非編碼區的劍橋序列一致，存在2個重復拷貝的9 bp序列，5例缺失型1拷貝9 bp序列和1例3型3個拷貝的9 bp序列。見圖3。

A：缺失型;B:標準型;C:3型

圖3 mtDNA 9 bp序列分析結果

3 討 論

人類mtDNA 9 bp序列缺失標記由于具有母系遺傳特點，能夠忠實地記錄母系進化歷史，因此對于研究人類的起源、遷徙、親緣關系等具有重要價值。有研究通過對伊朗人群的mtDNA 9 bp序列缺失頻率的分析[3]，提示該人群的母系遺傳結構與巴基斯坦人群、新幾內亞人群較為相近，而與我國人群32%、中國臺灣人群18%～40%的母系遺傳結構差異較大(Plt;0.05)[4-5]。mtDNA 9 bp缺失頻率分布所呈現的地理趨勢能夠較好地描述出史前該地區人類的遷徙路線。姚永剛等[6]對國內多個地區的少數民族和漢族群體的mtDNA 9 bp缺失頻率進行研究發現，南方人群的遺傳多態性高于北方人群，沿海人群高于內陸人群，提示自我國的南方進入，隨后由南向北遷徙，這與柯越海等[7]得出中華民族南方起源的結論是相符的。于恩艷等[8]對我國新疆塔吉克族和柯爾克孜族人群mtDNA 9 bp多態分析發現，塔吉克族1.43%、柯爾克孜族2.86%與維吾爾族3.3%、高加索人群mtDNA 9 bp缺失頻率較近；這與嚴江偉等[9]通過對新疆喀什地區維吾爾族 mtDNA D 環高變Ⅰ區序列研究得出維吾爾族人群與高加索人群基因發生了融合的結論相一致。本次研究的貴州3個世居少數民族為不同原始部落起源的民族群體，苗族是一個有著悠久歷史的并且發源于我國的國際性民族，水族、布依族起源于古代百越。研究發現，地理位置相近的苗族與百越起源的布依族、水族的mtDNA 9 bp缺失頻率分布不同，但差異無統計學意義(Pgt;0.05)，其中布依族的mtDNA 9 bp缺失頻率最小，苗族次之，水族的mtDNA 9 bp缺失頻率最高，提示苗族的母系遺傳結構變異小于水族和布依族。

國內外學者通過對不同地域、不同民族的mtDNA 9 bp缺失頻率分布狀況進行分析，結果顯示其分布具有明顯的地域特異性和種族差異性。不同民族起源的民族群體mtDNA 9 bp缺失頻率分布情況表現不一。本次研究的3個世居少數民族群體mtDNA 9 bp缺失頻率均高于北方民族起源的新疆蒙古族4.0%、朝鮮族9.43%、藏族5.52%[6，10-11]，差異有統計學意義(Plt;0.05)；這符合起源于百越、苗瑤支系的民族群體mtDNA 9 bp缺失頻率高于北方民族起源的民族群體的結論。荔波水族人群mtDNA 9 bp缺失頻率與中國臺灣高山族41.46%、漢族40%相近[12-13]，提示親緣關系較近。筆者分析可能的原因有，高山族來源是多源性的，但主要是來自我國大陸東南沿海的古越的一支，因此與同為古越起源的水族有著相似的遺傳結構；另一個原因為漢族與高山族混雜居住，民族間基因發生了交流。同一民族起源的不同民族群體mtDNA 9 bp缺失頻率分布情況也是不同的，本研究的荔波布依族的mtDNA 9 bp缺失頻率與廣西壯族20.83%相近[14]，與荔波水族的缺失頻率相比差異較大，提示該人群與廣西壯族的親緣關系較近，與荔波水族的親緣關系較遠。究其原因可能是這些具有共同史載起源的民族群體在遷徙過程中與其他民族基因融合的概率不同，也有可能群體間本身就存在遺傳結構差異。

本課題組前期對貴州多個世居少數民族人群的mtDNA 9 bp的遺傳多態性進行研究，結果均未發現3拷貝9 bp序列，而本次研究在雷山苗族人群中發現。3拷貝9 bp序列在國內外均有報道，研究發現伊朗人群[3]的3個9 bp拷貝的重復頻率很低并且分布分散，與我國的內蒙古蒙古族、廣東漢族、遼寧漢族、武漢漢族、云南漢族、新疆維吾爾族人群接近[6，15]，與葡萄牙人群相比要低，提示這種長度變異的起源在伊朗人群與我國人群中可能是各自獨立起源，在葡萄牙人群中可能是共同起源。

綜上所述，研究mtDNA 9 bp的遺傳多態性標記，不僅有助于了解不同民族群體的母系遺傳結構，而且為研究人類的起源、遷徙路線、親緣關系提供了一定的遺傳背景資料。

[1]任凌雁，何燕，張婷，等．貴州3個地域苗族人群mtDNA 9 bp序列缺失頻率[J]．重慶醫學，2013，42(22)：2586-2587．

[2]李琦，谷志遠，趙亞力．北京地區漢族人群線粒體DNA 9bp序列缺失頻率檢測[J]．中華醫學遺傳學雜志，2000，17(2)：141-142．

[3]Alemohammad SA,Farhud DD,Hooshmand M,et al.Distribution of Mitochondrial DNA Intergenic COII/tRNALYS 9 bp Deletion in Iranian Populations[J].Iran J Public Health,2003,32(2):1-5.

[4]Yao G,Watkins S,Zhang P.Evolutionary history of the mtDNA 9-bp deletion in Chinese populations and its relevance to the peopling of East and Southeast Asia[J].Hum Genet,2000,107(5):504-512.

[5]Fucharoen G,Fucharoen S,Horai S.Mitochondrial DNA polymorphisms in Thailand[J].J Hum Genet,2001,46(3):115-125.

[6]姚永剛，袁志剛，周曾娣，等．中國民族人群線粒體DNA 9bp序列缺失的分布[J]．自然科學進展，2001，11(4)：343-359．

[7]柯越海，宿兵，肖君華，等．Y染色體單倍型在中國漢族人群中的多態性分布與中國人群的起源及遷移[J]．中國科學，2000，30(6)：614-620．

[8]于恩艷，張藝，董曉宇，等．新疆兩個民族人群線粒體DNA V區缺失多態性[J]．生物技術，2008，18(3)：18-20．

[9]嚴江偉，唐暉，高俊薇，等．中國新疆喀什維吾爾族群體mtDNA D環區多態性[J]．中國法醫學雜志，2003，18(1)：39-39．

[10]張永吉，李哲，徐京男，等．中國朝鮮族線粒體DNA編碼區序列多態性[J]．中國法醫學雜志，2011，26(2)：124-126,129．

[11]劉永，溫有鋒，席煥久．西藏藏族mtDNA COⅡ/tRNA-(Lys)基因間區9 bp缺失多態性[J]．武警醫學，2007，18(2)：100-103．

[12]任凌雁，何燕，王嬋娟，等．貴州6個少數民族線粒體DNA 9bp序列缺失頻率研究[J]．生物技術，2012，22(5)：51-54．

[13]任凌雁，何燕，張婷，等．貴州9個少數民族線粒體DNA Region V及Y染色體DYS287位點多態性研究[J]．中山大學學報(自然科學版)，2013，52(4)：121-124．

[14]季米娜，胡啟平，竇霄云，等．廣西壯族線粒體DNA9-bp缺失頻率的分析[J]．廣西醫科大學學報，2008，25(1)：38-39．

[15]Alves-Silva J,Guimar?es E,Rocha J,et al.Identification in Portugal and Brazil of a mtDNA lineage containing a 9-bp triplication of the intergenic COII/tRNALys region[J].Hum Hered,1999,49(1):56-58.

Studyonfrequencyof9bpsequencedeletionofmithochondrialDNAinthreeethnicnationalitiesofGuizhouProvince*

GuoXuehong，HeYan△，ZhangWangde，WangChanjuan，ZhangTing，GuanZhizhong

(KeyLaboratoryofEndemicandEthnicDiseases,MinistryofEducation/KeyLaboratoryofMedicalMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China)

ObjectiveTo study the frequency of 9 bp sequence deletion of mithochondrial DNA in three ethnic nationalities of Guizhou Province.MethodsA total of 183 male blood samples were randomly extracted from Miao nationality(69 cases) in Leishan County,Shui nationality(44 cases) and Buyi nationality (70 cases) in Libo County.Polymerase chain reaction(PCR) and direct sequencing were used to detect the mithochondrial DNA 9 bp sequence deletion.ResultsThe standard type,deleting type and 3 type were found in the samples of 3 ethnic nationalities in Guizhou Province,the highest deletion frequency was Shui nationality(40.91%) in Libo County,1 cases of 3 type was detected in Miao nationality of Leishan County,and the mtDNA 9 bp deletion frequency had no statistical difference among 3 ethnic nationalities(Pgt;0.05).ConclusionThe frequency of mtDNA 9 bp deletion is different among three native minorities,the genetic variation in Shui nationality is larger,compared with Miao nationality genetic relationship,Shui nationality has a relatively closer affinity with Buyi nationality.

Guizhou;Buyi nationality;Shui nationality;Miao nationality;mtDNA

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.33.031

貴州省“2011 協同創新中心”項目(黔教合協同創新中心[2014]06號)；貴州省科技廳基金資助項目(黔科合J字[2011]2119號)。

國學紅(1981-),在讀碩士，主要從事疾病分子生物學研究。△

，E-mail:annieheyan@gmc.edu.cn。

Q987

A

1671-8348(2017)33-4702-03

2017-05-06

2017-08-04)