GP73在肝癌患者外周血CD4+T淋巴細胞中的異常表達及其相關機制研究

李淑群,翁 俊,莫慶榮,喻亞群

(桂林醫學院附屬醫院肝膽胰外科,廣西桂林 541000)

論著·臨床研究

GP73在肝癌患者外周血CD4+T淋巴細胞中的異常表達及其相關機制研究

李淑群,翁 俊,莫慶榮,喻亞群△

(桂林醫學院附屬醫院肝膽胰外科,廣西桂林 541000)

目的探討肝癌患者外周血CD4+T淋巴細胞中高爾基體蛋白73(GP73)的異常表達及其對Th1/Th2/Th17亞型分化的影響。方法選擇該院2015年5月至2016年2月住院的肝癌患者50例為研究對象,50例健康志愿者作為對照。采集外周血并分離CD4+T淋巴細胞，采用實時熒光定量PCR檢測CD4+T淋巴細胞中GP73表達水平；另將分選的20例健康者CD4+T淋巴細胞分別轉染GP73小干擾RNA或過表達載體，實時熒光定量PCR及蛋白質印跡法(Western blot)檢測CD4+T淋巴細胞中GP73及核因子κB(NF-κB)表達水平,ELISA檢測上清液中白細胞介素4(IL-4)、γ干擾素(IFN-γ)、白細胞介素17(IL-17)的分泌水平。結果肝癌患者外周血CD4+T淋巴細胞中GP73 mRNA的表達與健康者相比明顯上調，差異有統計學意義(Plt;0.05)。GP73過表達組NF-κB表達水平明顯升高(Plt;0.05)，GP73干擾組NF-κB表達水平明顯降低(Plt;0.05)。過表達GP73導致CD4+T淋巴細胞中IL-4、IL-17水平明顯升高，IFN-γ水平明顯降低(Plt;0.05)；沉默GP73導致CD4+T淋巴細胞IL-4、IL-17水平明顯降低，IFN-γ水平明顯升高(Plt;0.05)。結論GP73在肝癌患者的外周血CD4+T淋巴細胞中過表達，而GP73很有可能通過激活NF-κB參與炎癥反應，導致患者體內Th1/Th2/T17失衡，促進肝癌的發生與發展。

肝腫瘤；GP73；腫瘤免疫；CD4+T淋巴細胞

在我國，肝癌是一種高發性惡性腫瘤，近年來其發生率和病死率呈現不斷上升的趨勢，嚴重威脅了人們的生命健康[1]。目前，對于肝癌的診斷和治療效果不令人滿意，因此，篩選新型腫瘤特異性標志物作為檢驗及治療的靶點成為了該腫瘤研究領域的難點。高爾基體蛋白73(GP73)是近年來新發現的一種肝癌診斷指標，大量研究表明,GP73在肝癌患者血清中異常表達，證實其可能在肝癌的發生、發展中起到重要作用[2-3]。另一方面，腫瘤免疫也是癌癥研究方面的一個熱點，研究證實腫瘤患者輔助性T淋巴細胞(Th)的功能異常是導致腫瘤發生的重要原因[4]。截至目前，國內外尚無GP73在肝癌患者CD4+T淋巴細胞中的表達及其機制研究的相關報道。本研究通過驗證GP73在肝癌患者外周血CD4+T淋巴細胞中的表達及其對Th亞型分化的影響，從腫瘤免疫角度來探討GP73在肝癌中的相關作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年5月至2016年2月在本院住院的肝癌患者50例為研究對象。所有患者均經病理確診為肝癌，TNM臨床分期均為Ⅰ～Ⅱ期，無淋巴結轉移。所有患者未進行任何抗腫瘤治療,排除肝炎病毒重疊感染、自身免疫病，以及其他重大器官(如心、肺等)功能異常。其中男27例，女23例，年齡47～75歲，中位年齡59歲；TNM臨床分期Ⅰ期31例，Ⅱ期19例；乙型肝炎病毒(HBV)感染36例，丙型肝炎病毒(HCV)感染14例；Child-Pugh肝功能分級A級47例，B級3例；甲胎蛋白(AFP)lt;400 μg/L 35例，≥400 μg/L 15例；腫瘤直徑小于或等于5 cm 32例，gt;5 cm 18例；腫瘤數目1個 45例，2個及以上 5例；低分化或未分化11例，中分化30例，高分化9例；有血管浸潤24例，無血管浸潤26例。另選取體檢中心年齡及性別匹配的健康志愿者50例為對照，男26例，女24例，年齡46～76歲，中位年齡59歲。兩組一般資料比較差異無統計學意義(Pgt;0.05)，具有可比性。

1.2主要材料 GP73小干擾RNA(GP73 siRNA)及過表達(GP73 Overexpression) 載體(上海吉瑪制藥技術有限公司)；感受態大腸桿菌DH5α和人肝癌細胞HepG2由本實驗室保存；限制性內切酶BglⅡ、EcoRⅠ、HindⅢ、T4 DNA連接酶(TaKaRa公司)；膠回收試劑盒(Promega公司)；質粒提取試劑盒(Tiangen公司)；引物及測序由奧科公司完成。人淋巴細胞分離液(美國GE公司)；磁力架、CD4+磁珠及試劑盒、MS分離柱(德國Miltenyi Biotec公司)；RPMI 1640培養基、TRIzol試劑、胎牛血清及Lipofectamine 3000脂質體轉染試劑(美國Thermo Fisher Scientific公司)；實時熒光定量PCR試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]；GP73、核因子κB(NF-κB)、GAPDH引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]；人白細胞介素4(IL-4)、γ干擾素(IFN-γ)、IL-17(南京奧青生物技術有限公司)；NF-κB及GAPDH抗體(美國Abcam公司)。

1.3方法

1.3.1CD4+T淋巴細胞的分選、鑒定、培養和轉染 清晨空腹采集患者和健康者外周血各10 mL，加入淋巴細胞分離液，采用密度梯度離心法分離參與者外周血單一核細胞(PBMC)。CD4+磁珠分選試劑盒按照說明書分選PBMC中的CD4+T淋巴細胞。每管細胞分選后采用流式細胞儀進行鑒定，其分選純度均大于95%。根據后續實驗的不同需求，所得CD4+T淋巴細胞或保存于-80 ℃，或進行后續培養。

根據文獻提供的針對GP73 siRNA序列5′-GCC AGT GCA TCA ATC AGA T-3′，并經BLAST分析確定與其他已知基因沒有同源性后,按照pSUPER.retro.neo+gfp載體的說明和要求設計合成了兩條相應的DNA序列。將酶切鑒定正確的克隆測序,測序正確的相應質粒命名為psiGP73。

Flag-GP73載體的構建human gp73-BamHI-forward：5′-CGG GAT CCA TGA TGG GCT TGG GAA ACG GGC GTC-3′,human gp73-EcoRI-reverse:5′-CGG AAT TCT CAG AGT GTA TGA TTC CGC TTT CAC-3′。

將分選的部分健康人CD4+T淋巴細胞加入含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養液，分別加入GP73 siRNA (psiGP73) 或過表達(Flag-GP73)載體，使用Lipofectamine 3000按說明書流程進行轉染。轉染后細胞分為未轉染組，GP73干擾組及GP73過表達組，在anti-CD28(1 μg /mL)和anti-CD3 (1 μg /mL)的刺激條件下，37 ℃、5%CO2條件培養72 h，收集細胞及上清液進行后續實驗。

1.3.2實時熒光定量PCR檢測GP73、NF-κB mRNA表達水平 -80 ℃保存的CD4+T淋巴細胞加入1 mL TRIzol,按照說明書指示提取總RNA，使用一步法實時熒光定量PCR試劑盒，逆轉錄合成cDNA后對目的基因進行擴增。GP73：上游引物5′-CAG CGC TGA TTT TGA GAT G-3′,下游引物5′-ATG ATC CGT GTC TGG AG-3′;NF-κB：上游引物5′-ATG TGC ATC GGC AAG TGG-3′,下游引物5′-CAG AAG TTG AGT TTC GGG TAG-3′;GAPDH：上游引物5′-AAG TAT GAC AAC AGC CTC AAG A-3′,下游引物5′-CAC CAC CTT CTT GAT GTC ATC A-3′。PCR反應條件：95 ℃30 s；95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個循環。PCR產物的相對表達采用2-△△CT法計算，以GAPDH的表達量作為內參。

1.3.3蛋白質印跡法(Western blot)檢測NF-κB蛋白表達水平 用RIPA裂解液裂解細胞后，進行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉至PVDF膜，加入5%的脫脂牛奶封閉1 h 后，加入 NF-κB抗體4 ℃孵育過夜，洗滌，加入辣根過氧化物酶(HRP) 標記的二抗孵育1 h 后加入化學發光物質進行顯影。

1.3.4ELISA檢測IL-4、IFN-γ及IL-17水平 轉染及未轉染的CD4+T淋巴細胞培養72 h后，根據ELISA試劑盒說明書步驟，測定上清液中IL-4、IFN-γ、IL-17的分泌水平。

2 結 果

2.1GP73 mRNA的表達水平 肝癌患者外周血CD4+T淋巴細胞中GP73 mRNA 的表達較對照組升高，差異有統計學意義(Plt;0.05)。見圖1。

圖1 GP73 mRNA的表達水平

2.2GP73 mRNA水平與肝癌患者的臨床病理特征關系 將肝癌患者GP73 mRNA水平分為低表達組(低于對照組1.1倍)和高表達組(不低于對照組1.1倍)。與GP73 mRNA低表達相比，高表達患者表現較惡化的臨床病理，包括TNM臨床分期、Child-Pugh肝功能分級、腫瘤直徑和腫瘤分化程度(Plt;0.05)；而和HBV/HCV感染、AFP、腫瘤數目及血管浸潤等無明顯關系(Pgt;0.05)。

圖2 各組CD4+T淋巴細胞中GP73 mRNA的表達水平

2.3過表達與沉默GP73對CD4+T淋巴細胞NF-κB表達水平的影響 GP73過表達組CD4+T淋巴細胞中GP73 mRNA水平較未轉染組明顯上升(Plt;0.05)，而GP73干擾組較未轉染組明顯降低(Plt;0.05)，證明轉染成功，見圖2。GP73過表達組NF-κB mRNA及蛋白表達水平均明顯升高(Plt;0.05)，GP73干擾組明顯降低(Plt;0.05)，見圖3。

圖3 各組CD4+T淋巴細胞NF-κB mRNA及蛋白的表達水平

2.4患者與健康人群外周血中的IL-4、IFN-γ和IL-17的水平比較 與健康人群相比，肝癌患者外周血IL-4和IL-17的水平明顯升高，IFN-γ水平明顯降低(Plt;0.05)。見表3。

表3 患者與健康人群外周血中的IL-4、IFN-γ和 IL-17的水平比較

2.5過表達與沉默GP73對CD4+T淋巴細胞IL-4、IL-17和IFN-γ分泌的影響 與未轉染組相比，GP73過表達組中IL-4和IL-17水平明顯升高，IFN-γ水平明顯降低(Plt;0.05)；而GP73干擾組有效沉默GP73后，其顯示IL-4和IL-17水平較未轉染組明顯降低，IFN-γ水平明顯上升(Plt;0.05)。見表4。

表4 過表達與沉默GP73對CD4+T淋巴細胞IL-4、 IL-17和IFN-γ分泌的影響

*Plt;0.05，與未轉染組比較

3 討 論

近年來，GP73作為肝癌特異性標記物的研究成為了癌癥領域的一個熱點。GP73是由Kladney等[5]在2000年發現并首次報道的，GP73是一個位于細胞內高爾基體上的Ⅱ型跨膜蛋白，研究顯示在肝癌患者中GP73水平與肝臟纖維化程度呈正相關，并在患者發展成為原發性肝癌時達到高峰，證實其參與肝癌的發生和發展。此后，大量研究證實，肝癌患者血清中GP73水平明顯升高并與腫瘤的發展密切相關[6-7]。本研究驗證了GP73在肝癌患者外周血CD4+T淋巴細胞中的表達，與健康人相比，GP73在肝癌患者外周血CD4+T淋巴細胞中過表達(Plt;0.05)，揭示其可能通過影響免疫系統的功能參與肝癌的發生與進展。

本研究結果表明，和GP73 mRNA低表達組相比，高表達患者表現較惡化的臨床病理，包括TNM臨床分期、Child-Pugh肝功能分級、腫瘤直徑和腫瘤分化程度(Plt;0.05)等，從而為臨床醫生在患者的診斷方面提供重要的參考，具有重要的臨床意義。

腫瘤免疫是腫瘤機制研究領域的重要組成部分。大量的研究證實，免疫系統與腫瘤之間存在著錯綜復雜的關系。一方面，目前的許多抗腫瘤療法通過激活各種免疫細胞及其分泌的相關因子對癌細胞進行殺傷；而另一方面，也有大量研究證實，某些免疫細胞通過各種炎癥通路參與癌癥的發展與發生[8-9]。研究表明，某些慢性炎癥可能導致體內大量活性氧的產生與累積，從而導致胞內DNA的損傷及基因的突變，最終促進腫瘤的發生。因此，如何有效地控制炎癥可能會對腫瘤的發生及治療產生極為重要的作用。NF-κB是炎癥反應中最為重要的一個轉錄因子，NF-κB的啟動可以激活其下游信號通路，分泌各種炎性因子促進炎癥的發生。在本研究中，在CD4+T淋巴細胞中過表達GP73后，NF-κB的表達也隨之上調，而在沉默CD4+T淋巴細胞中的GP73可導致NF-κB表達的下調，提示GP73可能通過激活NF-κB信號通路激活炎癥反應，從而促進癌癥的發生和發展。

CD4+T淋巴細胞是一類Th，與其他類型淋巴細胞不同，CD4+T淋巴細胞通過分泌各種細胞因子對機體的免疫功能進行調節。CD4+T淋巴細胞根據其功能及分泌細胞因子的種類主要分為兩個亞群，Th1及Th2。Th1主要調節機體細胞免疫,其代表性分泌細胞因子包括IFN-γ、IL-2等；而Th2主要調節機體體液免疫，以IL-4、IL-6等作為其標志性分泌因子[10]。而Th1通過分泌的IFN-γ抑制Th2的分化，Th2則可通過分泌IL-4抑制Th1的分化。大量研究證實，許多疾病的發生、發展與Th1/Th2的比例失調密切相關[11-12]。細胞免疫是機體免疫系統參與腫瘤發生、進展及腫瘤免疫中最主要的部分，當Th1的數量及其分泌的相關因子在患者體內占有主導地位的時候，患者的免疫系統處于抵抗狀態，較為活躍，具有較強的抗腫瘤能力，而一旦Th1/Th2比例失調，Th2數量占優時，患者免疫系統處于易感狀態，抗腫瘤能力較差[13]。除以上兩種主要的CD4+T淋巴細胞亞群外，近年來新發現的Th17在腫瘤的發生與發展中也扮演著及其重要的角色。Th17主要分泌IL-17，在腫瘤微環境中，IL-17可能通過促進腫瘤組織新生血管的形成促進腫瘤的生長、遷移、侵襲與轉移[14]，同時，IL-17促進Th17生成，抑制Th1的分化及IFN-γ的分泌[15]。在本研究中，與健康人群相比，肝癌患者外周血IL-4和IL-17的水平明顯升高，而IFN-γ水平明顯降低(Plt;0.05)；過表達GP73組中CD4+T淋巴細胞IL-4和IL-17水平明顯上升，IFN-γ水平明顯降低(Plt;0.05)；而沉默GP73后，IL-4和IL-17水平較未轉染組明顯降低，而IFN-γ水平明顯上升(Plt;0.05)，說明GP73異常表達可能導致患者體內Th1/Th2/T17失衡，從而抑制機體抗腫瘤的相關免疫反應，促進腫瘤的發生及進展。

綜上所述，GP73在肝癌患者外周血CD4+T淋巴細胞中過表達，而GP73很有可能通過激活NF-κB參與炎癥反應，導致患者體內Th1/Th2/T17失衡，促進肝癌的發生與生長。然而，GP73與Th1/Th2/T17細胞失衡作用的機制并不清楚，將在未來工作中做進一步研究。

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AbnormalexpressionofGP73inperipheralbloodCD4+Tlymphocytesofpatientswithhepatocellularcarcinomaanditsrelatedmechanism

LiShuqun,WengJun,MoQingrong,YuYaqun△

(DepartmentofHeaptobiliaryandPancreaticSurgeryt,AffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,Guilin,Guangxi541000,China)

ObjectiveTo investigate the abnormal expression of Golgi protein 73(GP73) in CD4+T lymphocytes of the patients with hepatocellular carcinoma(HCC) and its influence of Th1/Th2/Th17 subtype differentiation.MethodsFifty cases of HCC hospitalized in this hospital from May 2015 to February 2016 and 50 healthy volunteers as controls were selected.Peripheral blood was collected and CD4+T lymphocytes were isolated;then the expression levels of GP73 and nuclear factor kappa-light-chain-enhancer (NF-κB) in CD4+T lymphocytes were determined by using RT-qPCR and Western blotting methods;furthermore,the secretion levels of IL-4,IL-17 and IFN-γ in the supernatants were examined by using ELISA method.ResultsGP73 mRNA expression in peripheral blood CD4+T lymphocytes in the HCC patients were significantly up-regulated compared with the healthy volunteers,the difference was statistical difference(Plt;0.05).The expression level of in GP73 overexpression group was significantly increased(Plt;0.05),while which in the GP73 interference group was significantly decreased(Plt;0.05).Over-expression of GP73 induced significant increase of IL-4 and IL-17 levels and significant decrease of IFN-γ (Plt;0.05);silencing GP73 induced marked decrease in the expression of IL-4 and IL-17 in CD4+cells and obvious increase of IFN-γ(Plt;0.05).ConclusionGP73 is over-expressed in peripheral blood CD4+T cells of HCC patients,moreover GP73 is very likely to participate in the inflammatory reaction by activating NF-κB to cause the unbalance of Th1/Th2/T17 and promote the occurrence and development of HCC.

liver neoplasms；GP73；tumor immunology；CD4+T lymphocytes

李淑群(1984-)，主治醫師，碩士，主要從事肝膽胰惡性腫瘤研究?！?/p>

，E-mail:yuyaqun0222@sina.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.33.021

R735.7

A

1671-8348(2017)33-4667-03

2017-05-13

2017-08-02)